Name: Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri l'analisi del calcio intracellulare nei podociti di glomeruli isolati freschi. Questo metodo elettrofisiologico consente il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio e dell'attività dei canali ionici per studi renali.

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Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) per un&#39;eccellente assistenza tecnica con gli esperimenti di microscopia. Gregory Blass è riconosciuto per la correzione critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health HL108880 concessione e American Diabetes Association concedere 1-15-BS-172 (AS), e il Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).

Uso e benessere degli animali dovrebbero aderire alla guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio seguendo protocolli esaminato e approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC). 1. Rene Flush <ol><li> Utilizzare da 8 a 12 settimane di età topo maschio (consigliato è un ceppo Sprague Dawley, ma altri ceppi di età e sesso diverso possono essere utilizzati con le opportune modifiche). </li><li> Anestetizzare l&#39;animale secondo la procedura consentita dal protocollo IACUC; monitorare profondità dell&#39;anestesia e controllare l&#39;animale. La descrizione dettagliata della chirurgia da eseguire in 1,3-1,8 possono essere trovati in Ilatovskaya et al 7. </li><li> Dopo anestesia corretta, posizionare l&#39;animale su un tavolo operatorio temperatura controllata, fare una incisione mediana dell&#39;addome (fino a 3 pollici di lunghezza), e scoprire la vena cava e l&#39;aorta. </li><li> Inserire legatura intorno ai celiaci e mesenterica superiore arterie e gli addominaliaorta sopra di quelli; non legare. </li><li> Blunt sezionare l&#39;aorta addominale al di sotto delle arterie renali, e mettere due legature attorno ad esso, ma non legare, quindi bloccare l&#39;aorta sopra le legature e legare il filo inferiore. </li><li> Cateterizzarla l&#39;aorta con un tubo di polietilene PE50 (collegato a una pompa a siringa riempita con PBS) sotto il morsetto e fissare il catetere con la seconda legatura; rimuovere il morsetto, accendere la pompa, e legare l&#39;aorta e le arterie mesenterica con celiaci. Fare rapidamente incisione nella vena renale per alleviare la pressione. </li><li> Infondere l&#39;aorta con PBS pre-raffreddata per 2 o 3 minuti ad una velocità di 6 ml / min. </li><li> Smettere di perfusione, accise e decapsulate 7 i reni, e metterli sul ghiaccio in soluzione PBS. Euthanize l&#39;animale secondo il protocollo approvato da IACUC. </li></ol> 2. Isolamento del Topo glomeruli <ol><li> Preparare 30 ml di soluzione fresca di 5% BSA in RPMI 1640. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio e forbici,isolare la corteccia di entrambi i reni, e poi sminuzzare fino omogeneo. Questa procedura è stata descritta in precedenza 7. </li><li> Spingere il tessuto tritato durante la fase precedente al setaccio in acciaio inossidabile 100 mesh (pre-imbevuto di 5% di BSA soluzione / RPMI) con una spatola. Raccogliere il flusso continuo e dalla forza di gravità consentono il flusso continuo di passare attraverso un setaccio di 140 mesh. </li><li> Filtrare il flow-through raccolti dalle maglie 140 setaccio con un vaglio da 200 pre-impregnato, scartare il filtrato, e lavare la parte superiore del vaglio a 10 - 15 ml della soluzione di BSA / RPMI preparati a raccogliere i glomeruli che sedimenti il setaccio. </li><li> Mettere la soluzione BSA / RPMI contenente glomeruli su ghiaccio in una provetta da 15 ml e lasciare il sedimento glomeruli sul fondo del tubo fino a 20 min. Il concentrato glomeruli sul fondo del tubo sarà visto chiaramente. Rimuovere la soluzione in eccesso, lasciando circa 2 ml nel tubo. </li></ol> 3. monocanale patch-clamp Electrophysiology <ol><li> Preparare 5 x 5 mm frammenti di vetro di copertura da rivestimento con 70.000 MW - 150.000 poli-ʟ-lisina, e lasciare asciugare. Usare circa 30 ml di 0,01% sterile soluzione filtrata in acqua al vetro di copertura. </li><li> Riscaldare le soluzioni sperimentali RT e riempire la camera patch-clamp e pipetta. Per il monitoraggio canali TRPC, utilizzare una soluzione del bagno, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 glucosio, pH 7.4; pipetta: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 glucosio; pH 7.4. <ol><li> Aggiungere inibitori alla soluzione pipetta per bloccare l&#39;attività di canali endogeni, che non sono rilevanti per gli studi (consigliate sono: 100 micron niflumico o DIDS (per bloccare Ca 2+ -activated Cl - canali), TEA 10 mm (per inibire la grande-conduttanza Ca 2 + - K + dipendente canale), 10 nM iberiotoxin (per bloccare gli Ca 2 + K + canali -activated), 10 mM nicardipina (per bloccare tipo N Ca2+ canali)) direttamente prima dell&#39;esperimento patch-clamp. </li></ol></li><li> Mescolare delicatamente la soluzione contenente glomeruli, e quindi applicare circa 50 ml di al coperchio rivestito chip di vetro poli-ʟ-lisina. Lasciate che i glomeruli attribuiscono per circa 5 minuti. </li><li> Spostare i chip di vetro con glomeruli alla camera di patch-clamp pre-riempite con la soluzione del bagno; profumato camera ad una velocità di 3 ml / min per 1 min per assicurare la rimozione dei glomeruli separati. </li><li> Condurre un esperimento patch-clamp convenzionale in una modalità cella-attached 7. Con una pipetta di vetro (7 - 10 MW resistenza pipetta) formare una tenuta ad alta resistenza tra una pipetta e una membrana podocyte applicando aspirazione delicata (una pipetta collegata ad un podocyte sulla superficie del glomerulo isolato è mostrato in figura 2, sulla la sinistra). </li><li> Per le misure di cella-attached, passa-basso le correnti a 300 Hz da un filtro a otto poli Bessel. </li><li> Use isolata glomeruli in esperimenti di patch-clamp per un massimo di 4-6 ore. Mantenere la frazione magazzino glomeruli sul ghiaccio. </li></ol> 4. Raziometrico confocale misure di fluorescenza intracellulare concentrazione di calcio nelle podociti <ol><li> Mettere 500 ml di frazione glomeruli (descritto in 2.5) a 0,5 ml tubo conico e aggiungere coloranti calcio Fura Red, AM e Fluo-4, AM. Utilizzare 2mM e 1 mm concentrazioni di stock di Fura Red, AM e Fluo-4, AM, rispettivamente (conservare a -20 ° C, sciolto in DMSO) e l&#39;uso di 2,5 ml di ciascun colorante per 500 ml di frazione glomeruli. Immediatamente dopo l&#39;aggiunta dei coloranti coprire il tubo con un foglio di alluminio. </li><li> Porre le provette su un agitatore rotante per almeno 20 minuti fino a 1 ora a temperatura ambiente. Nota: Agenti farmacologici possono essere aggiunti durante questa fase. </li><li> Preparare vetrini, coprirli con poli-ʟ-lisina e permettere l&#39;asciugatura utilizzando set piatto riscaldato a 70 ° C. </li><li> Una volta che il carico di coloranti calcio è complete, applicare 100 ml di i glomeruli contenenti soluzione ai vetrini rivestiti di poli-ʟ-lisina e farli aderire alla superficie per circa 5 minuti. Montare i coprioggetti glomeruli-schiera in una camera di imaging, e profumato con la soluzione del bagno (contenente (in mM): 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) ad una velocità di 3 ml / min per rimuovere i glomeruli assegnata e le restanti coloranti. </li><li> Impostare il microscopio confocale a scansione laser ad una lunghezza d&#39;onda di eccitazione 488 nm e filtri di emissione (525/25 e 650/25 nm per Fluo-4 e Fura Red, rispettivamente). Impostare il software di imaging per una frequenza e risoluzione desiderata. </li><li> Trovate i glomeruli in campo chiaro e poi accendere il rilevamento del segnale di fluorescenza. Regolare l&#39;intensità del laser per ciascun colorante per evitare la saturazione del segnale. Scegliere il piano focale con podociti che sono direttamente collegati al vetro. Ciò minimizza l&#39;effetto causato dalla contrazione di un glomerulo in risposta a farmaciapplicazione. Doppio controllo che glomerulo di scelta è ben attaccato al vetro; </li><li> Avviare l&#39;imaging piano focale scelta (prendere 512 x 512 immagini con la frequenza impostata a 4 secondi per visualizzare Ca 2+ veloce cambiamenti transitori. Usare un 60X / NA 1.4 o simile lente dell&#39;obiettivo immagine ad alta risoluzione per), si applicano le droghe di interesse, e registrare la risposta. <ol><li> Selezionare un piano focale desiderata (il più vicino alla superficie del vetro come possibile, per assicurare l&#39;imaging di podociti sulla superficie del glomerulo). Controllare l&#39;intensità della fluorescenza sul Fluo4 canali FuraRed, e assicurarsi che il glomerulo si vede chiaramente in campo chiaro. </li><li> Inizia imaging. Prima dell&#39;applicazione di qualsiasi droga, record di almeno 1 min di riferimento di fluorescenza per assicurarsi che il segnale è stabile (non ci sono picchi improvvisi o dissolvenza del segnale). </li><li> Applicare farmaci desiderati con l&#39;aiuto di una micropipetta; fare attenzione e verificare che il farmaco è stato in grado di diffondere bene e raggiungere il glomerUlus. Mescolare delicatamente la soluzione del bagno, se necessario, controllare il piano focale selezionata e verificare che non si muoveva fuori fuoco a causa della domanda di droga. </li><li> Registrare i cambiamenti di intensità di fluorescenza per i segnali Fluo4 e FuraRed. Assicurarsi che la registrazione è abbastanza lungo, aspettando fino a quando il segnale raggiunge il livello di plateau o raggiunge un picco e poi ritorna al basale. Eseguire cambiamento soluzione o l&#39;aggiunta di altri farmaci se necessario. </li><li> Interrompere la registrazione, e salvare il file nel formato nativo del software. </li></ol></li></ol> 5. Image Analysis per le Misure di calcio <ol><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini con il software ImageJ attrezzata con il plugin Utility ND che consente di importare le immagini nel formato ND2 nativo. </li><li> Importare la sequenza di immagini; assicurarsi di dividere i canali e utilizzare una modalità HyperStack scala di grigi. </li><li> Seguire la → Strumenti → ROI percorso Analizzare manager nel software ImageJ per openna un window manager ROI. Seleziona più regioni di interesse (podociti) utilizzando uno strumento di selezione ovale e il &quot;(t) Aggiungi&quot; funzione nel ROI Manager. Come l&#39;ultimo ROI, selezionare l&#39;area in background; salvare il ROI selezionate (More → Salva). </li><li> Evidenziare la finestra contenente il canale selezionato per le analisi. Utilizzare la More → funzione Multi Measure nella ROI Manager, selezionare la casella &quot;una riga per ogni slice&quot; nel dialogo che si apre, e quindi fare clic su OK. I risultati saranno mostrati nel formato che può essere impostato nella finestra dei risultati: entrare nei risultati opzione di menu → Set misurazioni, selezionare &quot;Mean valore di grigio&quot; e calcolare i valori di intensità dei pixel per ogni ROI, che verrà visualizzato nella finestra Risultati in colonne separate per ogni ROI. </li><li> Copiare i valori di intensità ROI misurati per ogni canale (Fluo-4 e Fura Red) nel comodo software di analisi dei dati; sottrazione di valori di intensità di fondo di ogni datun punto. </li><li> Per ogni punto di tempo calcolare il rapporto di intensità del Fluo-4 a canali Fura rossi. Trama scatter / linea point-tempo cambia di Ca 2+ transitoria per ogni ROI. Calcolare i valori medi / SE per glomeruli selezionati. Nota: colonna Ora deve essere impostato in base alla frequenza di imaging selezionato a 4.5. </li></ol> 6. intracellulari Calcoli calcio Concentrazione Uso Fluo-4 fluorescenza del segnale <ol><li> Prelevare un campione dei glomeruli ed eseguire il protocollo sperimentale fino al punto 4.7. Dopo la registrazione della fluorescenza di fondo aggiungere Ionomicina (concentrazione finale nella camera vasca dovrebbe essere 10 pM) per la soluzione del bagno, e aumento dell&#39;intensità di fluorescenza registrare. Una volta che l&#39;intensità raggiunge il suo massimo e il decadimento comincia, aggiungere MnCl 2 (concentrazione finale dovrebbe essere 5 mM) per estinguere la fluorescenza 8. </li><li> Analizzare i dati ottenuti in 6.1. Copiare il Fluo-4 valori di intensità di segnale ROI ottenuti secondoil protocollo descritto a 5,1-5,5 da software di analisi preferito. </li><li> Calcolare la concentrazione di calcio intracellulare (in nm) nella podocita corrispondente alla ROI utilizzando una formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> dove K d è una dissociazione predeterminato costante Fluo-4 (345 nM), F è l&#39;intensità alla prima rilevazione che si sta calcolando la concentrazione di calcio per (basale) e F min e F max sono i valori di intensità del punto di carico massimo calcio (dopo l&#39;applicazione ionomicina) e dopo quenching della fluorescenza (con MnCl 2), rispettivamente (vedere Figura 3). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;approccio qui descritto permette l&#39;analisi di movimentazione calcio dai podociti dei glomeruli roditori. Questa tecnica consente l&#39;applicazione di patch-clamp elettrofisiologia singolo canale e imaging di fluorescenza confocale raziometrico. Tuttavia, entrambi gli approcci possono essere utilizzati separatamente, per conto proprio. Il protocollo proposto ha diverse relativamente semplici passaggi, tra cui a livello 1) del rene; 2) l&#39;isolamento dei glomeruli da vagliatura differenziale; 3) l&#39;esecuzi...

I reni mantenere l&#39;equilibrio omeostatico per varie sostanze e regolare il volume di sangue in un modo che determina la pressione totale di sangue. Disturbi della filtrazione renale, riassorbimento o secrezione causare o accompagnare stati patologici, che vanno da iper- o ipotensione per terminare malattia renale allo stadio che alla fine richiede il trapianto di rene. L&#39;unità di filtrazione renale (glomerulo) consiste di tre strati - l&#39;endotelio capillare, membrana basale e uno strato cella singola di cellule epiteliali - podociti, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell&#39;integrità e della funzione 1 fessura diaframma. Disfunzione nel filtro glomerulare permselective causa la perdita urinaria di macromolecole, come la proteinuria. Vari agenti possono influenzare la struttura dei podociti ei processi piede, che determinano l&#39;integrità della barriera di filtrazione glomerulare. I podociti sono coinvolti nel mantenimento della glomfunzione di filtrazione Eruli. È stato stabilito che la movimentazione calcio improprio dal podociti porta a danno cellulare e svolge un ruolo importante nella progressione di varie forme di nefropatie 2,3. Pertanto, lo sviluppo di un modello che permette di misurazione diretta dei cambiamenti concentrazione intracellulare di calcio sarà determinante per lo studio della funzione podocita. Isolati glomeruli erano già stati utilizzati in numerosi studi, tra cui la misurazione del coefficiente di riflessione albumina cambia 4 e la valutazione delle correnti cellulari integrali nelle cellule intere elettrofisiologiche misurazioni patch-clamp 5,6. Nel presente lavoro si descrive il protocollo che consente al ricercatore di misurare le variazioni della concentrazione di calcio intracellulare in risposta a richieste di agenti farmacologici, stimare i livelli basali di calcio all&#39;interno delle cellule, e valutare l&#39;attività canali del calcio individuale. Misure della concentrazione di calcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology sono stati usati per determinare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio nell&#39;ambito dell&#39;attività podocita e il canale, rispettivamente.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poli-&amp;#671;-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Acido Pluronic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>soluzione</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore per provette</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Microscopio confocale Nikon (invertito)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser di eccitazione 488 nm. Filtro di emissione 500-550 nm e 570-620 nm</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Grasso ad alto vuoto</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Composto al silicone</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione/perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore per patch clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Sistema Axon Digidata&amp;reg;</td></tr><tr><td>Filtro passa-basso</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>Bessel a 8 poli</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Estrattore per micropipette di tipo Flaming/Brown</td></tr><tr><td>Microforgia</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Giappone</td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrazioni</td><td>TMC</td><td></td><td>dotato di gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Sistema di perfusione con valvole multicanale</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione/perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxina</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Acido niflumico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di TEA</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>senza antibiotici</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>soluzione al 30% di albumina</td></tr><tr><td>Tavolo operatorio con controllo della temperatura</td><td>MCW core</td><td></td><td>per roditori</td></tr><tr><td>Setacci in acciaio:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>Maglia 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>schermo per CD-1</td></tr><tr><td>Microscopio binoculare</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binoculare</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione basato su pompa per siringhe</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubazione in polietilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia con isoflurano</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Altri reagenti di base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monocanale analisi e imaging di calcio nei podociti del freshly isolato glomeruli

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

I podociti (cellule epiteliali glomerulari renali) sono noti per regolare la permeabilità glomerulare e mantenere la struttura glomerulare; un ruolo chiave per queste cellule nella patogenesi di varie malattie renali è stato stabilito poiché il danno dei podociti porta alla proteinuria e all'eliminazione del processo del piede. In precedenza è stato riportato che vari agenti endogeni possono causare un drammatico sovraccarico della concentrazione intracellulare di Ca2+ nei podociti, presumibilmente portando all'albuminuria, e questo probabilmente avviene attraverso i canali ionici conduttori di calcio. Pertanto, è apparso importante studiare la manipolazione del calcio nei podociti sia in condizioni normali che in vari stati patologici. Tuttavia, gli approcci sperimentali disponibili sono rimasti in qualche modo limitati alle cellule in coltura e trasfettate. Sebbene rappresentino un buon modello di base per tali studi, sono essenzialmente estratti dall'ambiente nativo del glomerulo. Qui descriviamo la metodologia di studio dei podociti come parte del glomerulo intero appena isolato. Questo preparato conserva il potenziale funzionale dei podociti, che sono ancora attaccati ai capillari; Pertanto, i podociti rimangono nell'ambiente che conserva le parti principali dell'apparato di filtrazione dei glomeruli. Il presente manoscritto elabora due approcci sperimentali che consentono 1) la rilevazione in tempo reale delle variazioni di concentrazione di calcio con l'aiuto della microscopia raziometrica a fluorescenza confocale, e 2) la registrazione dell'attività dei singoli canali ionici nei podociti dei glomeruli appena isolati. Queste metodologie utilizzano i vantaggi dell'ambiente nativo del glomerulo che consentono ai ricercatori di risolvere i cambiamenti acuti nella gestione intracellulare del calcio in risposta alle applicazioni di vari agenti, misurare la concentrazione basale di calcio all'interno delle cellule (ad esempio, per valutare la progressione della malattia) e valutare e manipolare la conduttanza del calcio a livello dei singoli canali ionici.

Qui abbiamo affrontato il problema di misurare variazioni acute dei livelli di calcio nei podociti. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale progettata per eseguire alta risoluzione confocale a fluorescenza diretta di imaging e singole registrazioni attività del canale ionico in podociti del fresco isolati glomeruli roditori. In breve, dopo che il ratto è anestetizzato, i reni devono essere lavati con PBS per eliminarli del sangue. Poi, i reni vengono escissi e deca...

I cambiamenti nei livelli intracellulari di calcio nei podociti sono uno dei mezzi più importanti per controllare la funzione di filtrazione dei glomeruli. Qui spieghiamo un approccio ad alto rendimento che consente di rilevare in tempo reale la manipolazione del calcio e l'attività dei singoli canali ionici nei podociti dei glomeruli appena isolati.

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio in risposta ad agenti farmacologici. Stimare i livelli basali di calcio e valutare l'attività dei singoli canali nei podociti come parte del glomerulo frescamente isolato. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il sangue dai reni del ratto mediante lavaggio attraverso l'aorta addominale.Successivamente, i reni vengono prelevati e la corteccia renale viene isolata e tritata con una lametta. Nel terzo passaggio, i glomeruli corticali vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Successivamente, i glomeruli decapitati isolati possono essere sottoposti a esperimenti elettrofisiologici oppure caricati con coloranti fluorescenti e utilizzati per misurazioni confocali della concentrazione di calcio.In definitiva, queste procedure consentono ai ricercatori di risolvere i cambiamenti acuti nella gestione del calcio intracellulare in risposta all'applicazione di vari agenti e di valutare e manipolare la conduttanza del calcio a livello di singoli canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che permette di studiare i podociti come parte del glomerulo isolato nella sua interezza. Il nostro preparato mantiene il potenziale funzionale dei podociti.Rimangono attaccati ai capillari e partecipano all'omeostasi nell'ambiente che effettivamente può conservare le parti principali dell'apparato di filtrazione dei glomeruli. Le implicazioni di questa tecnica ampliano il nostro screening farmacologico. In condizioni normali e patologiche, il meccanismo di gestione del calcio da parte dei podociti svolge un ruolo regolatorio essenziale nello sviluppo e nella prevenzione di complicanze renali in malattie come la nefropatia diabetica, la sclerosi focale segmentale o l'ipertensione. È di grande importanza osservare la risposta dell'afflusso di calcio in queste cellule ai farmaci, che possono essere facilmente sottoposti a screening.In questa preparazione, VLA Hunka dimostrerà come eseguire il lavaggio del rene per le procedure seguenti. Mostrerò l'isolamento dei glomeruli e la tecnica di elettrofisiologia con clamp a V, mentre il dottor GaN vi guiderà nell'imaging confocale del calcio. Per iniziare questa procedura, posizionare un ratto anestetizzato su un tavolo operatorio con temperatura controllata. Sotto il microscopio, praticare un'incisione mediana sull'addome per esporre la vena CVA e l'aorta.Successivamente, inserire la ligatura intorno alle arterie celiaca e mesenterica superiore e all'aorta addominale al di sopra di esse. Dissezionare in modo ottuso l'aorta addominale al di sotto delle arterie renali. Quindi posizionare due ligature intorno ad essa, ma non legarle.Clampare l'aorta sopra le legature e annodare il filo inferiore. Successivamente, cateterizzare l'aorta con un tubo in polietilene collegato a una pompa a siringa riempita con PBS al di sotto del clamp e fissare il catetere con una seconda legatura. Quindi rimuovere il clamp e legare.Me arterie mesenteriche e celiache. Infondere l'aorta con PBS preraffreddato per tre minuti a una velocità di sei millilitri al minuto. Allo stesso tempo, praticare un'incisione nella vena cava vicino alle vene renali per alleviare la pressione.Dopo tre minuti, interrompere la perfusione, escindere e incapsulare i reni. Posizionarli in soluzione di PBS su ghiaccio. Preparare ora 30 millilitri di BSA al 5% appena preparata nel mezzo RPMI 1640.Utilizzando una lametta e delle forbici, isolare la corteccia di entrambi i reni, quindi omogeneizzarla con il MIT fino a ottenere una consistenza uniforme. Successivamente, far passare il tessuto tritato attraverso un setaccio in acciaio inossidabile da 100 maglie, precedentemente immerso in soluzione al 5% di P-S-A-R-P-M-I. Raccogliere il filtrato e lasciarlo passare attraverso un setaccio da 140 maglie.Successivamente, filtrare il flusso raccolto dal setaccio da 140 mesh utilizzando un setaccio da 200 mesh preventivamente saturato. Scartare il filtrato e lavare il setaccio superiore con 10-15 millilitri della soluzione B-S-A-R-P-M-I preparata, raccogliendo i glomeruli dalla superficie del setaccio. Successivamente, trasferire la soluzione B-S-A-R-P-M-I contenente i glomeruli G in un tubo da 15 millilitri e metterlo su ghiaccio; lasciare sedimentare i glomeruli sul fondo del tubo per un massimo di 20 minuti.In questo procedimento, rivestire chip di vetro coprioggetti di cinque millimetri per cinque millimetri con polilisina di peso molecolare compreso tra 70.000 e 150.000 e farli essiccare su una piastra riscaldata. Successivamente, portare le soluzioni sperimentali alla temperatura ambiente e riempire la camera per patch clamp e la pipetta. Mescolare delicatamente la soluzione contenente i glomeruli. Quindi applicare circa 50 microlitri di tale soluzione su ciascun chip di vetro coprioggetti rivestito con polilisina.In seguito, trasferire i frammenti di vetro con i glomeruli nella camera per il patch clamp, pre-riempita con la soluzione di Beth. Perfundere la camera a una velocità di tre millilitri al minuto per un minuto, al fine di rimuovere eventuali glomeruli non aderenti, prima di effettuare la registrazione standard con il patch clamp in modalità cella attaccata.Ora posizionare 500 microlitri della frazione di glomeruli in ciascun tubo conico da 0,5 millilitri e aggiungere i coloranti per il calcio pure red am e flu oh 4:00 AM. Successivamente, posizionare i tubi su uno shaker rotante per un massimo di un'ora a temperatura ambiente. Poi preparare le lamelle di vetro con polilisina e lasciarle asciugare sulla piastra riscaldata a 70 gradi Celsius. Una volta completato il caricamento dei coloranti per il calcio, applicare 100 microlitri della soluzione contenente i glomeruli sulle lamelle ricoperte di polilisina e lasciarle aderire alla superficie per circa cinque minuti.Quindi montare le coprioggetti con i glomeruli attaccati su una camera per imaging e perfondere con soluzione da bagno a un flusso di tre millilitri al minuto per rimuovere i glomeruli non attaccati e i coloranti residui. Successivamente, impostare il microscopio confocale a scansione laser sulla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Impostare quindi il software di acquisizione immagini sulla frequenza e risoluzione desiderate.Successivamente, individuare i glomeruli in campo chiaro. Accendere poi il rilevamento del segnale di fluorescenza. Dopodiché, selezionare un piano focale desiderato e verificare l'intensità della fluorescenza nei canali flu oh four e firo red.Assicurarsi che il glomerulo sia chiaramente visibile in campo chiaro. Quindi registrare le variazioni dell'intensità di fluorescenza dei segnali flu oh four e furor red. Per importare la sequenza di immagini, separare i canali e utilizzare la modalità scala di grigi hyper stack.Nel software Image J, aprire una finestra del gestore delle aree di interesse (ROI) seguendo il percorso strumenti di analisi, Gestore ROI. Selezionare una o più aree di interesse utilizzando lo strumento di selezione ellittica e la funzione aggiungi T nel gestore ROI. Quindi selezionare l'area nello sfondo e salvare le ROI selezionate.Successivamente, selezionare una riga per ogni box della sezione nella finestra di dialogo e fare clic su OK nelle opzioni del menu. Impostare le misurazioni. Selezionare il valore medio di grigio e calcolare i valori di intensità dei pixel per ciascuna ROI, che verranno visualizzati nella finestra dei risultati in colonne separate.Per ogni ROI, copiare quindi i valori di intensità misurati del ROI per ogni canale nel software di analisi dati preferito e sottrarre i valori di intensità del fondo scala da ciascun punto dati per ogni punto temporale. Calcolare il rapporto tra le intensità del canale flu oh four e quello del canale URA red; successivamente, tracciare le variazioni nel tempo del transiente di calcio per ciascun ROI. Questa immagine mostra la pipetta per il patch clamp attaccata al corpo ossidato sulla superficie del glomerulo di ratto.Durante una registrazione elettrofisiologica, una parte del glomerulo incapsulato può essere osservata nell'angolo inferiore destro dell'immagine. Di seguito è riportata una traccia di corrente rappresentativa dell'attività di canali di tipo tripy, ottenuta mediante un'acquisizione in configurazione cell-attached effettuata sul podocita per misurare la concentrazione intracellulare di calcio. I glomeruli vengono caricati con flu oh 4:00 AM per etichettare il calcio intracellulare.Questo video illustra gli effetti del CIN e del cloruro di manganese sull'ingresso di calcio nei glomeruli. Questo grafico quantifica i cambiamenti nell'intensità del segnale flu oh four registrati da un singolo podocita in risposta al CIN e al cloruro di manganese. Come previsto, il CIN produce il massimo della fluorescenza, mentre il cloruro di manganese quencha il colorante e determina l'intensità di fluorescenza più bassa.L'applicazione di questi farmaci consente al ricercatore di definire successivamente la concentrazione esatta di calcio all'interno della cellula. Questo video dimostra l'effetto di 10 micromoli di TP sulla concentrazione di calcio nei glomeruli. Si noti l'aumento della fluorescenza verde del fluo-4 e la diminuzione della fluorescenza rossa del fu-red, che indicano un aumento della concentrazione di calcio intracellulare.Questa tecnica offre un'opportunità unica per monitorare i cambiamenti nell'afflusso di calcio a livello di singoli canali ionici e di cellule singole dopo trattamenti farmacologici o altre manipolazioni. Pertanto, questo approccio rappresenta uno strumento molto potente, soprattutto alla luce dei numerosi modelli di roditori geneticamente modificati disponibili. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire misurazioni del calcio nei podociti, nonché degli esperimenti di clamping elettrofisiologici, utilizzati sia in combinazione che autonomamente.Queste tecniche forniscono un'analisi approfondita e un'interpretazione meccanicistica della regolazione del maneggiamento del calcio nei podociti in condizioni normali e patologiche.

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Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Canali ionici espressi in renale tubulare svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia del rene policistico. Qui si descrive protocolli sperimentali utilizzati per eseguire patch-clamp analisi e di livello di calcio intracellulare misure in cistico appena isolato da reni di roditori.

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

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Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

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Isolamento e imaging delle regioni pacemaker intatte e intatte della pelvi renale del topo mediante sezionamento del vibratoma

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Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

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