Name: 迷走神经刺激作为一种工具来诱导可塑性相关途径灭绝学习 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习迷走神经刺激技术以增强条件性恐惧消退，通过电极植入和听觉恐惧条件反射训练，诱导突触可塑性变化。该方法为焦虑症治疗提供精准神经调控策略。

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本研究由美国国家心理健康研究所资助，项目编号 MH 086960-01A1（Christa K. McIntyre）。

本方案中描述的所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. VNS 套管的构建
<ol>
	<li>用锯子将一根22½ G针头的尖端锯下，制成钻孔工具。</li>
	<li>将此时已变钝的22½ G针头在金属锉上反复摩擦数次以使其端面平整。将针头以45º角抵住锉刀，并在来回摩擦的同时旋转针头，使金属变薄并向内卷曲。警告：将手术刀刀尖插入针头切割端内部，施加向下的力并旋转，以展开卷曲的金属。</li>
	<li>第1节后续步骤需使用放大双目镜进行操作。</li>
	<li>使用手术刀（10号或15号刀片）切割出长度为4 mm的管段。</li>
	<li>将一段4 mm长的管子套在小型钻头或其他形状相似的工具上，以固定管子，便于后续操作。</li>
	<li>在管子上钻出4个孔（图1A）。孔的位置应构成一个2 mm × 2 mm正方形的四个顶点，且孔边缘应整齐光滑，无毛刺。 
	注意：每钻2至3个孔后，需重新修锐钻孔工具（步骤1.2）。若此步骤操作困难，几乎可以确定是由于钻孔工具不够锋利所致。</li>
	<li>保持管子套在钻头上的状态，使用手术刀沿管子纵向在孔之间切开，使两个孔位于切口的两侧（图1B）。</li>
	<li>使用缝合针和缝线，将缝线穿过各孔，以构建用于最终将套管固定于迷走神经周围的系线结构。从套管内部开始，将缝线穿入其中一个孔，再从外部穿回相邻的另一个孔（图1C）。在距离塑料管约2 cm处打结，使管段与缝线形成三角形结构。打结后保留约8 cm长的线尾，然后剪去多余部分。对切口另一侧的两个孔重复上述操作。此时套管已准备就绪，可进行布线。</li>
	<li>准备套管用导线。
	<ol>
		<li>将铂铱合金导线剪成70 mm长的线段。</li>
		<li>使用珠宝焊枪最细的喷嘴，产生中心呈蓝色的锐利火焰，并尽可能精细地用火焰烧除导线末端约1 cm的塑料绝缘层。将火焰的蓝色中心对准已去绝缘层的导线末端，使其熔成一个小球。再将蓝色火焰对准去绝缘段的多个位置，使七股金属丝熔合为一体。这些部位的导线会出现明显弯折。</li>
		<li>在导线的另一端，用蓝色火焰中心加热末端，使其熔成一个小球。此端应尽量减少去除塑料绝缘层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为套管布线（图1D）。 
	注意：第1.10节中的所有步骤必须在放大双目镜下进行。
	<ol>
		<li>用缝线将套管固定在工作台上，使其切口方向保持水平。拉紧缝线使套管张开，然后将缝线固定。</li>
		<li>用5号镊子夹住已处理导线带小球的一端（去绝缘端），从右下孔穿入。将镊子从孔中抽出，使导线末端留在套管内部。</li>
		<li>再次用镊子夹住该小球端（此时位于套管中部），将其从右上孔穿出。抽出镊子，使导线完全穿过套管，并在套管顶部留出松弛段。</li>
		<li>再次用镊子夹住小球端（此时位于套管顶部外侧），从内侧重新穿回右上孔。重复此操作，直至导线牢固就位：可通过拉动导线另一端测试其固定程度。 
		注意：此过程中必须明确区分导线的去绝缘部分与绝缘部分。最终位于套管“槽”内的导线部分必须去绝缘，而位于底部两孔以下的部分（套管底端外部）必须保持绝缘。这可确保电流仅作用于迷走神经。&#160;</li>
		<li>用镊子夹住绝缘端的小球，从套管内部将导线从右下孔穿出，并绕回一次。</li>
		<li>在套管左侧重复步骤1.10.2至1.10.5，使两根导线分别牢固固定于管段左右两侧。</li>
		<li>将一枚金针插入“辅助手”夹具的臂部，使针孔朝上，并在孔内填入焊剂。</li>
		<li>将已连接至套管的导线绝缘端焊入金针孔内。</li>
		<li>待焊料冷却后，再次加热熔化，以确保导线末端与针孔内壁形成良好连接。必要时可添加更多焊料。对第二根导线重复此过程。</li>
		<li>将引线朝右摆放，在套管顶部用永久性记号笔做标记。同时标记连接顶部引线的金针。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 迷走神经刺激输入位点头帽的构建
<ol>
	<li>截取30 mm长的26 AWG铜线段，每端剥去一小段绝缘层。</li>
	<li>剪下松散金针的窄端，并将导线剥去绝缘层的一端焊接到金针的切口端。为每个所需的输入位点制作两个导线/针复合体。将一个连接器放入辅助夹持装置中，并将导线/针复合体的导线端焊接到连接器的两个已上助焊剂的齿状端子上（图2G）。</li>
	<li>用记号笔标记其中一根导线。在手术过程中，将植入物放置成标记导线位于未标记导线的头侧方向。</li>
</ol>
3. 迷走神经刺激术手术
<ol>
	<li>制作用于手术期间处理迷走神经的定制玻璃工具。
	<ol>
		<li>使用硼硅酸盐玻璃拉制微移液管，使其具有细长的锥形尖端。若无移液管拉制仪，可通过折断玻璃获得更长的边缘。</li>
		<li>用厚布握住移液管的非锥形端（以防烫伤），将锥形端或折断端压在光滑的耐火表面上，同时用珠宝焊枪的蓝色火焰加热锥形端。随着玻璃被压入表面，其将发生弯曲。持续加热直至形成钩状或J形。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迷走神经刺激（VNS）手术步骤
	<ol>
		<li>收集并灭菌所有器械。准备一个洁净、加热的手术区域。</li>
		<li>使用氯胺酮/赛拉嗪（85 mg/kg，5 mg/kg，腹腔注射）对动物进行麻醉。通过监测动物在脚趾和/或尾部夹捏时的发声反应和回缩反射来评估麻醉深度。</li>
		<li>剃除动物头部顶部及左侧颈部的毛发。用矿物油或眼膏保护动物的眼睛。用纱布蘸取碘伏溶液清洁剃毛区域，随后用酒精擦拭。重复一次。</li>
		<li>在头部顶部皮下注射0.05 ml布比卡因，并在将动物置于立体定位仪中的同时使药液扩散。</li>
		<li>使用手术刀在颅骨皮肤上做切口，暴露λ点和前囟点。使用钝头镊子在切口处皮下分离，从切口沿左耳前方至左侧颈部建立通路，为套管预留路径。</li>
		<li>用止血钳拉开切口，使用棉签将过氧化氢涂抹于暴露的颅骨，以清除残留组织。</li>
		<li>使用手术刀在颅骨上钻两个浅的起始孔，用于固定锚定螺钉。螺钉间距应足够大以容纳植入物，但不宜过于靠近周围组织。避免将螺钉直接置于中线上。&#160;
		<ol>
			<li>使用镊子和螺丝刀将骨螺钉旋入两个孔中。螺钉应紧密固定于孔内，螺帽高出颅骨表面2–3 mm，以便丙烯酸树脂填充螺钉下方及周围空间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在螺钉下方、周围及之间填充少量丙烯酸树脂，避免接触周围组织。随后在颅骨中部两螺钉之间填充较多树脂。</li>
		<li>抓握植入物，使标记导线朝向前脑方向，未标记导线朝向后方，迅速将植入物放入丙烯酸树脂中，注意避免树脂进入金针、卡扣区域或顶部的输入位点。定位后静置约5分钟直至固化。此步骤也可借助立体定位仪的臂进行支撑。使用低黏度丙烯酸树脂混合物填充植入物与颅骨之间的任何裂缝或间隙。静置使其干燥。</li>
		<li>对第3.2节后续步骤使用放大双目显微镜。</li>
		<li>将动物从立体定位仪中取出，使其右侧卧位，并略微向腹侧旋转。</li>
		<li>在左颈静脉上方做一小切口，下颌骨与锁骨到切口的距离应大致相等。使用钝性分离扩大切口，直至到达肌肉层。胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌应清晰可见。使用肌肉牵开器保持术野开放。</li>
		<li>沿肌肉间的自然沟槽继续钝性分离。寻找颈动脉的搏动。朝搏动方向穿过肌肉即可暴露颈动脉。使用肌肉牵开器将肌肉向后牵拉。包含颈动脉的鞘膜同时也包裹迷走神经。使用剪刀小心地对鞘膜进行钝性分离。</li>
		<li>识别迷走神经。它是颈动脉鞘内最粗大的神经，通常位于动脉的动物左侧，但也可能出现在任一侧。切换至定制玻璃工具，将迷走神经与颈动脉分离。神经应至少有5 mm长度无其他组织附着。</li>
		<li>从头部切口处，使用套管导线对侧的线头，用镊子或小型止血钳将套管经先前建立的皮下隧道拉出，推入颈部切口处。</li>
		<li>使用玻璃工具轻轻抬起神经，将套管导线对侧的线头从神经下方穿过。将线头完全拉出，注意避免摩擦神经。套管应紧邻神经放置。</li>
		<li>确保套管的标记“顶部”朝上。将神经轻轻放入套管中央。此时神经应横跨套管凹槽内的两根导线（图2B）。打结固定线头以闭合套管。</li>
		<li>在头帽上，将连接套管的插针插入刺激输入位点的金针中。将标记插针插入刺激输入位点最前齿对应的金针中。</li>
		<li>为验证套管能否有效刺激迷走神经，进行呼吸暂停测试：将刺激器连接至头帽的刺激输入位点，施加刺激（0.2 mA，60 Hz，最长10秒）。呼吸应短暂停止，心率应下降，以此验证套管功能。</li>
		<li>使用丙烯酸树脂固定刺激输入位点的插针。覆盖导线，并确认暴露的插针和导线不会导致短路。使用丙烯酸树脂抹平任何凸起或填充间隙。静置使其干燥。</li>
		<li>缝合两个切口。在颈部切口附近皮下注射0.05 ml布比卡因。在切口处涂抹抗生素软膏。可选地，在刺激输入位点保留一个公连接器，以防止愈合过程中受损或堵塞。</li>
		<li>给予抗生素治疗，并遵循标准术后护理，包括适当的镇痛。动物恢复活动能力后送回动物饲养设施。恢复期为5天。为确保头帽的最大使用寿命和功能，实验剩余期间应将动物单独饲养。 
		注：假性VNS大鼠接受相同的手术，但电路设计在头帽水平短路（即植入头帽，分离迷走神经与颈动脉，但不在神经周围放置电极套管）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 听觉恐惧条件反射
注意：该恐惧条件反射实验方案比大多数方案21更为强化，因为这些实验的目的是增强消退效果。若采用较温和的恐惧条件反射，其本身易于消退，则可能出现下限效应，从而掩盖这种增强作用。
<ol>
	<li>将实验动物置于12小时&#160;光/暗周期 随意摄取 自由获取食物和水。术后恢复期间每天处理动物。</li>
	<li>设置条件化和测试装置，该装置由一个放置在隔音箱内的操作箱组成（图2C操作箱由透明塑料壁构成，尺寸为20 × 20 × 20 cm，底部为连接足底电击发生器的不锈钢网格地板。使用白色笼内灯照亮箱体，以便进行视频记录。以9 kHz、85 dB SPL的纯音作为条件刺激。</li>
	<li>使用位于操作箱上方、实验舱内的数码相机记录行为。在行为学实验室外的计算机上查看和监控实验过程。保存视频以供后续分析。</li>
	<li>每次实验前后用70%乙醇擦拭实验腔室，以消除嗅觉线索。</li>
	<li>对大鼠进行为期2天的恐惧条件反射训练（图3A）。在第一天呈现5次声音刺激（9 kHz，85 dB，持续30秒），以确认大鼠对声音本身无先天恐惧反应，并确保其僵直水平可忽略不计。
	<ol>
		<li>在连续两天中的每一天，进行8次音调-足底电击（1秒，0.5 mA）配对刺激。第二天再次重复相同的音调-足底电击配对。刺激间间隔（ISI）在2至4分钟之间变化，每次试验平均为3分钟。电击在音调过程中的出现时间应随机化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第三天，检测声音/电击关联的强度。&#160;播放4次音调，刺激间间隔（ISI）为3、4或5分钟（平均4分钟），在无足底电击的情况下，记录动物在音调呈现期间及刺激间间隔期间的僵直行为，作为条件性恐惧反应（CFR）的测量指标。</li>
	<li>第4天，开始进行VNS或假VNS的消退训练。
	<ol>
		<li>将刺激器的公头连接器插入大鼠的刺激输入部位，连接刺激器。将动物放入实验舱内（图2A, 2C将刺激器设置为0.4 mA，脉宽500 µs，频率30 Hz。刺激总持续时间为30.15秒，从声音开始前150毫秒启动。向动物播放4个音调（同步骤4.6），每次音调呈现均与VNS或假性VNS配对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定期使用示波器检测套管和输入端口的电学完整性。
	<ol>
		<li>将动物正常连接，并将刺激器的输出分路至示波器。</li>
		<li>将示波器的量程设置为 -20 V 至 +20 V，并开始刺激。30 Hz 刺激的波形应在示波器上可见。若刺激幅度超过 10 V，表明阻抗过高，袖带或刺激输入部位的连接存在问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了测试VNS对消退训练的影响，在第5天进行第二次条件性恐惧反应测试（同4.6步骤），记录在声音刺激期间的僵直时间，并与第一次条件性恐惧反应测试（步骤4.6）中记录的基线僵直时间进行比较。</li>
	<li>使用对处理条件不知情的独立观察者分析视频。使用秒表测量大鼠在呈现声音期间的僵直时间。僵直定义为完全静止不动，期间大鼠表现出快速呼吸、低头和四肢伸展。22对冻结行为的分析可分为两个阶段：声音刺激呈现期间和刺激间间隔期间。&#160;</li>
</ol>
5. 体内 诱发电位记录
注意：此步骤为可选。诱发电场电位（EFPs）在24小时后记录&#160;在异氟烷麻醉的大鼠固定于立体定位仪中后，按照标准操作程序，在恢复测试（第5天）之后23,24.
<ol>
	<li>收集并灭菌所有工具。</li>
	<li>在透明塑料麻醉舱中使用异氟烷（5%浓度，100%氧气，流速1 L/min）诱导麻醉。通过监测动物在脚趾和/或尾部夹捏刺激下的发声情况及屈肌反射，评估麻醉深度。使用矿物油或眼用软膏保护眼睛。</li>
	<li>在头部顶部皮下注射 0.05 ml 布比卡因，并使药液充分扩散。使用手术刀和止血钳将颅骨上的头帽移除。操作时用力尽可能轻柔，以避免遮挡前囟点。</li>
	<li>将动物置于立体定位仪中。使用手术刀扩大切口以暴露人字缝和前囟。通过鼻罩以异氟烷（3%浓度，100%氧气，流速1 L/min）维持麻醉深度。</li>
	<li>在下边缘前额叶皮层（IL）和基底外侧杏仁核（BLA）上方的颅骨上钻孔。将玻璃微电极（2M KCl；电阻1-2 MΩ）插入BLA（腹侧/背侧：7.2，前/后：2.7，内侧/外侧：4.9，以bregma为参考），并将刺激电极植入内侧前额叶皮层的IL区域（腹侧/背侧：4.6，前/后：3.0，内侧/外侧：0.7，以bregma为参考）图4A).</li>
	<li>刺激IL以在BLA中诱发EFPs。数据如图所示 图4 采用以下参数获取：刺激脉冲持续时间为0.3毫秒，刺激强度为诱发最大场反应所需最小电流强度的40%（依据在基线数据采集前测定的输入-输出曲线确定），每15秒给予一次刺激。</li>
	<li>在诱导突触可塑性之前，至少收集 10 - 15 分钟的基线数据。 
	注意：用于诱导突触可塑性的实验方案将根据具体实验需求而有所不同，须由每位实验人员谨慎选择。数据在 图4C 在最小电流强度下（该强度可引发最大场反应），以50 Hz（2秒）的频率施加3组各100次脉冲刺激，组间间隔20秒，图示为EFP在上述刺激后的变化。</li>
	<li>测量场电位（EFP）的幅度，方法是取刺激伪迹前5毫秒时间窗的平均值与刺激伪迹后约20–25毫秒处（对应场电位负峰）5毫秒时间窗平均值之间的差值。将数据归一化至基线水平，并将10分钟基线期的平均值设为100%。使用可塑性诱导后另10分钟时间段的平均EFP幅度例如， 诱导后40至50分钟，以评估EFP波幅的长期变化。</li>
	<li>记录结束后，将麻醉的动物断头并取出脑组织。制备组织样本以进行组织学检测，验证电极位置。</li>
</ol>

作者没有竞争利益或冲突。

本文介绍了一种用于在单次暴露于条件性线索期间促进条件性恐惧消退，并调节介导消退学习的下边缘皮层与基底外侧杏仁核通路可塑性的实验方案1920。该方案成功的关键步骤是在消退训练期间准确地给予迷走神经刺激（VNS）。因此，必须特别注意套管电极的制作以及将其正确放置于迷走神经周围。在制作套管电极的过程中，应确保导线暴露部分的位置准确无误。同样，在手术过程中，需特别注意将套管准确放置在适当位置，并充分固定，以保证在整个实验过程中套管与刺激器之间的电路保持完整。手术后应检查套管功能是否正常（见步骤3.2.20），并在行为学测试结束后再次检查（见步骤4.8）。
迷走神经刺激（VNS）调节中枢神经系统活动的机制尚未完全阐明。颈部迷走神经主要由传入感觉纤维和传出运动纤维组成，其比例约为4:125。迷走神经传入纤维将信号传递至孤束核（NTS），后者进一步投射至臂旁核、下丘脑、丘脑、杏仁核和海马26,27。重要的是，脑干中的单胺类神经核团——蓝斑核（LC）和中缝核，接受来自NTS的直接和/或间接投射（...

经典恐惧条件反射为研究焦虑症的生物学基础提供了一种广泛使用的动物模型。在恐惧条件反射过程中，将一种厌恶刺激（非条件刺激，US，例如足底电击）与一种中性刺激（如声音和/或环境背景，即条件刺激；CS）配对呈现。在此过程中，CS 与 US 之间形成关联，最终仅呈现 CS 即可引发恐惧反应（条件反应；CR）。在恐惧消退过程中，CS 在没有 US 的情况下被反复呈现，导致 CR 逐渐减弱1。因此，条件性恐惧的消退是一个主动过程，当中性刺激不再预示厌恶结果时，对这些刺激产生的恐惧行为反应随之减弱。条件反应的消退需要新记忆的巩固，这些新记忆与已习得的关联相互竞争。焦虑症的一个显著特征是消退功能受损2-4。因此，动物模型中条件性恐惧的消退不仅为抑制性学习提供了重要范式，也为人类焦虑症的行为治疗提供了模型依据5,6。
由于恐惧与人类焦虑之间存在密切关联，人们认为这些研究有助于揭示与焦虑相关疾病（如创伤后应激障碍）的生物学本质，并有助于开发相应的治疗策略。临床前研究的一个重要目标是促进消退学习，并在消退相关神经环路中诱导靶向性可塑性，以巩固消退学习效果。迷走神经刺激（VNS）是一种微创性神经假体技术，可能用于对参与正在进行的任务的脑区和突触进行精确的时间控制和环路特异性调控。德克萨斯大学达拉斯分校Michael Kilgard团队近期开展的一系列研究表明，将VNS与特定的感觉或运动刺激配对使用（例如， 一种声音或杠杆拉动）在促进皮层可塑性以治疗耳鸣方面具有显著效果7，或改善中风后的运动功能障碍8-10此外，在学习后短时间内给予的非关联性迷走神经刺激同样能够促进大鼠和人类的皮层可塑性，并增强记忆巩固。11-13.
考虑到迷走神经在副交感神经通路中的作用，它参与调节记忆和突触可塑性也就不足为奇了。高度情绪化的事件往往比非情绪性事件产生更强的记忆，这可能是由于应激激素对记忆巩固的影响所致。训练后给予应激激素肾上腺素可增强人类和非人类动物的记忆巩固，但肾上腺素无法穿过血脑屏障14, 15。因此，应激诱导的肾上腺素释放必须通过间接途径影响大脑，以增强记忆巩固。大量证据表明，迷走神经可能是循环中的肾上腺素与大脑之间的关键连接。Miyashita 和 Williams16 发现，系统性给予肾上腺素可增加迷走神经的放电活动，并提高杏仁核中去甲肾上腺素的水平17。当杏仁核中的β-肾上腺素能受体被阻断时，系统性给予肾上腺素无法增强记忆巩固18，这提示迷走神经在将情绪激发性经历转化为长期记忆的通路中发挥着重要作用。
因此，将迷走神经刺激（VNS）与训练配对使用，有可能增强支持记忆巩固的脑部变化；而在无强化条件下暴露于条件性线索，可增强大鼠消退学习的巩固19,20。本文描述了利用VNS作为促进皮层可塑性并加速条件性恐惧反应消退的工具。

<table><tbody><tr><td>酒精</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿托品</td><td>Fisher</td><td>A0132-5G</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Henry Schein</td><td>69066950</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢&amp;nbsp;</td><td>CVS</td><td>209478</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>1129300</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Henry Schein</td><td>6312615</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>CVS</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>新孢霉素</td><td>CVS</td><td>629451</td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>Home Depot</td><td>304179</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Fisher</td><td>PENNA-10MU</td><td></td></tr><tr><td>丙烷</td><td>Home Depot</td><td>304182</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Henry Schein</td><td>4019308</td><td></td></tr><tr><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠宝喷枪</td><td>Smith Equipment</td><td>23-1001D</td><td></td></tr><tr><td>缝纫针</td><td>Walgreens</td><td>441831</td><td></td></tr><tr><td>#5 镊子（2个）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Home Depot&amp;nbsp;</td><td>203525863</td><td></td></tr><tr><td>AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X 电路板悬臂体视显微镜 + 144 LED</td><td>AmScope</td><td>SM-4TX-144A</td><td></td></tr><tr><td>辅助手架</td><td>A-M Systems&amp;nbsp;</td><td>726200</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片夹持器</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>金属锉刀</td><td>Home Depot</td><td>6601</td><td></td></tr><tr><td>直尺</td><td>Home Deopt</td><td>202035324</td><td></td></tr><tr><td>弯止血钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>130009-12</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小螺丝刀</td><td>Home Depot</td><td>646507</td><td></td></tr><tr><td>磁性固定器牵开系统</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-04, 18200-01, 18200-05</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Walgreens</td><td>30294</td><td></td></tr><tr><td>电动剪毛器</td><td>Walgreens</td><td>277966</td><td></td></tr><tr><td>记号笔（Sharpie）</td><td>Staples</td><td>125328</td><td></td></tr><tr><td>环形镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>定制玻璃微量移液管工具（J形和直形）— 硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>艾德森镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>套管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>MRE-065</td><td></td></tr><tr><td>铂铱合金导线</td><td>Medwire</td><td>10IR9/49T</td><td></td></tr><tr><td>金针</td><td>Mill-Max</td><td>1001-0-15-15-30-27-04-0</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Henry Schein</td><td>100-5797</td><td></td></tr><tr><td>22 G 针头</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>14-815-525</td><td></td></tr><tr><td>纸胶带</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>03-411-602</td><td></td></tr><tr><td>焊料</td><td>Home Depot</td><td>327793</td><td></td></tr><tr><td>助焊剂&amp;nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>300142</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，10 或 15 号</td><td>Stoelting</td><td>52173-10</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶实验导管，内径 0.51 mm × 外径 0.94 mm</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>508-002</td><td></td></tr><tr><td>头帽</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接器插头（公头）</td><td>Omnetics Connector Corporation</td><td>A25001-004</td><td></td></tr><tr><td>头帽插孔（母头）</td><td>Omnetics Connector Corporation</td><td>A24001-004</td><td></td></tr><tr><td>Teets 牙科丙烯酸树脂，液体和粉末</td><td>A-M Systems</td><td>525000, 526000</td><td></td></tr><tr><td>26 号实心铜导线</td><td>Staples</td><td>1016882 &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨螺钉</td><td>Stoelting+CB33:C61</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，10 或 15 号</td><td>Stoelting</td><td>52173-10</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Fisher</td><td>14-826-261</td><td></td></tr><tr><td>22 G 针头</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>14-815-525</td><td></td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; × 2&quot; 纱布</td><td>Fisher</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher</td><td>19-120-472</td><td></td></tr><tr><td>宠物尿垫</td><td>PetCo</td><td>1310747</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes 纸巾</td><td>Fisher</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>实验舱与行为测试环境&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Husky 金属前开门底柜（30英寸宽×19英寸深×34英寸高）</td><td>Home Depot</td><td>100607961</td><td></td></tr><tr><td>Quiet Barrier&amp;shy; HD 高性能隔音材料（板材）（压敏胶）</td><td>soundproofcow.com</td><td>10203041</td><td></td></tr><tr><td>波浪形声学泡沫板</td><td>soundproofcow.com</td><td>10432400</td><td></td></tr><tr><td>隔离式脉冲刺激器 Model 2100</td><td>A-M Systems</td><td>720000</td><td></td></tr><tr><td>数码相机 — Logitech Webcam C210</td><td>Logitech</td><td>B003LVZO88</td><td></td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinometer 10 MHz 单通道示波器</td><td>Sinometer</td><td>CQ5010C</td><td></td></tr><tr><td>OxyLED T-01 DIY 可粘贴四LED触摸式台灯</td><td>OXYLED</td><td>B00GD8OKY0</td><td></td></tr><tr><td>5k 欧姆电位器</td><td>Alpha Electronics</td><td>B00CTWDHIO</td><td></td></tr><tr><td>Extech 407730 40 至 130 分贝数字声级计</td><td>Extech Instruments</td><td>B000EWY67W</td><td></td></tr><tr><td>DSCK-C 双输出随机电击器</td><td>Kinder Scientific Co</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

迷走神经刺激作为诱导与消退学习相关通路可塑性的工具

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

消退是指当原本维持某种行为的强化刺激不再出现时，个体对中性刺激的行为反应逐渐减弱的过程。恐惧与人类的焦虑密切相关，因此对消退学习的研究可能有助于揭示创伤后应激障碍等焦虑相关疾病的生物学本质，并为开发相应的治疗策略提供依据。临床前研究的目标是促进消退学习，并在消退相关神经环路中诱导靶向性的可塑性变化，以巩固新形成的消退记忆。迷走神经刺激（VNS）是一种有效的方法，能够实现时间精确且神经环路特异性的神经递质释放，从而调节参与当前任务的神经网络活动。VNS已在大鼠和人类中被证实可增强记忆巩固，将VNS与条件性刺激的暴露配对，可增强大鼠消退学习的记忆巩固。本文提供了用于大鼠VNS实验的定制部件制备及手术操作的详细方案。利用该方案，我们展示了VNS如何在听觉恐惧条件化任务中促进条件性恐惧反应的消退。此外，我们还提供了证据表明，VNS可调节内侧前额叶皮层下边缘区（IL）与杏仁核基底外侧复合体（BLA）之间通路的突触可塑性，该通路参与了消退记忆的表达与调控。

本部分展示了通过结合迷走神经刺激（VNS）与消退学习来降低大鼠条件性恐惧反应表达所能获得的结果示例。在第1天和第2天（听觉恐惧条件化），大鼠接受听觉恐惧条件化训练，期间将足底电击与声音刺激配对呈现。在第3天（治疗前测试），仅呈现声音刺激而不给予足底电击，以测量僵直水平并评估条件性恐惧反应的建立情况。在第4天（治疗日），大鼠接受分组特异性的消退训练和处理：4次声音刺激分别与VNS或假刺激配对；在扩展消退组中，则为20次声音刺激配以假刺激。在第5天再次测试大鼠对单独呈现4次条件刺激（CS）的僵直反应水平（治疗后测试）比较 时间线 图3A在消退阶段仅接受少量（4次）非强化条件性声音刺激的动物，在随后的恢复测试日仅表现出条件性恐惧反应的轻微减弱。图3B）。相比之下，经VNS治疗的大鼠在单次消退训练后表现出显著减少的僵直反应（图3B）。VNS处理动物的条件性恐惧反应降低程度与假手术处理动物在消退训练期间接受5倍非强化暴露（20次声音）时所观察到的降低程度相当（EE组）。 图3B）。利用上述特定实...

迷走神经刺激（VNS）已成为一种诱导前脑靶向突触可塑性以调节多种行为的工具。本方案描述了如何实施迷走神经刺激以促进恐惧消退记忆的巩固。

消退是指当原本提供强化的中性刺激不再提供强化时，对这些刺激的行为反应逐渐减弱的过程。

本实验的总体目标是通过刺激迷走神经促进条件性恐惧的消退。首先制备用于向迷走神经传递电流的电极，随后将这些电极植入迷走神经中颈部区域周围，并在恢复期后安装头帽。随后，动物接受听觉恐惧条件化训练以及在迷走神经刺激或假刺激条件下的恐惧消退训练。最后一步是检测条件性恐惧的表达，并评估条件性僵直反应的降低程度。最终，通过迷走神经刺激诱导消退网络中的可塑性，从而增强消退学习。与现有的全身药物治疗等方法相比，该技术的主要优势在于能够精确调控治疗时机，从而实现神经递质在特定网络中的释放，并可与正在进行的行为相匹配。该方法有助于解答情感学习与记忆领域中的关键问题，特别是肾上腺素和糖皮质激素等应激激素的释放如何影响长期记忆的巩固过程。该技术的应用意义延伸至用于治疗焦虑症和创伤相关障碍的暴露疗法，以及成瘾康复领域。此外，迷走神经刺激还可应用于突触可塑性相关的其他学习模型，例如中风或创伤性脑损伤后的运动学习。准备时，使用一根针制作钻孔工具，开始将4厘米长的微细尼龙管套在钻床上。然后用针钻钻出四个孔，孔间距为2毫米，形成一个正方形的四个角。孔应整齐，无毛边。接下来，沿两个孔之间的管壁纵向剪开。现在使用缝合线，构建固定装置，将套管固定在迷走神经的两侧。在距离塑料管约两厘米处将缝合线打结，使管材与缝线形成一个三角形，结扎后每根缝合线应向外延伸约八厘米。接下来，将绝缘的七股铂铱合金导线剪切成 70 毫米长的段。然后使用珠宝焊接火炬，从导线一端去除约一厘米长的绝缘层。然后用火焰熔化暴露的铂铱合金部分。采用此技术将七根暴露的铂铱合金丝熔合成一根更坚固的导线，并将导线末端在熔合段的另一端熔成一个小球。在尽量减少绝缘层剥离的情况下，将铂铱合金丝熔成一个小球。现在用胶带将带螺纹的塑料套管沿水平面固定，切边朝下，拉紧螺纹并使套管充分伸展。使用镊子将导线制备物的暴露端从右下方的孔穿入，并将其拉至套管中央。然后将导线从右上方的孔穿出，并将导线回绕到套管上方。继续将导线再次穿过右侧上方的孔，然后轻轻一拉，拉紧导线并确保其固定牢固。必须确保位于套管凹槽内的导线部分无绝缘层，而套管底部外侧的导线部分仍保持绝缘，从而使输出的电流仅作用于迷走神经。接下来，从套管内部将导线裸露的一端穿过右下方的孔。如此形成一个回路，以完全相同的方式将导线放置在套管的左侧末端，但不要将导线固定在套管上。将导线裸露的一端焊接到金针上。让焊料冷却后重新熔化，以确保连接良好。根据需要添加更多焊料。现在为每个输入位点的迷走神经刺激（VNS）输入位点头帽准备连接器。剥去两段长度为30毫米、线规为26 AWG的铜线末端的绝缘层，剪下一根散装金针的窄端，然后将每对导线与金针分别焊接在一起。将导线的松散端焊接至连接器的两个通量齿上，从而制备出连接器。在立体定位仪上完成动物手术前准备后，使用手术刀切开颅骨上方的皮肤，暴露人字缝和β位点。使用钝头镊子从切口处皮下钝性分离，沿左侧耳前向下至左侧颈部建立一条通路，用于放置套管。接着，使用手术刀切开两个小的起始孔，用于固定螺钉。不要将这些孔直接置于中线上。然后使用镊子和螺丝刀拧入两枚骨螺钉，螺钉下方需留出空间以便丙烯酸树脂填充。接着用丙烯酸树脂填充圆形区域下方及螺钉之间的空隙，注意避免树脂接触周围组织，并在螺钉之间额外添加一些丙烯酸树脂。接下来，握住植入物，使标记的导线位于未标记导线的头侧。迅速将植入物放置到丙烯酸材料中。注意不要让丙烯酸沾到金针、卡扣区域或输入部位。静置五分钟使其干燥，并准备在体视显微镜下继续操作。在左侧颈静脉上方、下颌骨与锁骨之间做一小切口。用钝性解剖法扩大切口至肌肉层。暴露胸骨乳突肌、胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌。沿肌束间的沟槽进行钝性分离，以暴露颈总动脉。颈总动脉所在的鞘内还包含迷走神经。使用剪刀小心地解剖神经鞘，暴露出约五毫米长的迷走神经。接着，从头部切口处，利用套管上导线对侧的缝线，将套管经皮下隧道拉至颈部切口位置。用玻璃器械轻柔地提起神经，并将套管上的缝线从神经下方穿过。注意避免摩擦神经。套管的上侧应朝向动物的上方。现在将神经放入套管中央，并将套管固定在头帽上。将连接袖带的导线与刺激输入位点的针脚相连，以确认袖带位置正确。进行呼吸暂停操作，测试时呼吸应短暂停止，同时心率也应下降。确认套管位置后，使用丙烯酸树脂将引线固定至刺激输入位点。随后闭合手术部位，并使用Marcaine和局部抗生素对动物进行处理。让动物单独恢复五天，期间不与同伴同笼。在进行测试之前，在摄像机监控下设置好操作性条件反射箱。在行为训练的第一天，呈现声音刺激5次，每次持续30秒，以证明大鼠对声音本身无先天恐惧反应。在初次声音刺激呈现后，于第一天和第二天对大鼠进行恐惧条件化训练。播放一个32nd音调，同时随机给予一次持续1秒、0.5毫安的足底电击。每天进行八次音调与电击的配对，每次音调呈现之间间隔3至5分钟。在第三天检测音调与电击之间关联的强度。以单独的音调刺激四次，每次间隔三到五分钟。在第四天和第五天记录动物的僵直行为。进行伴随迷走神经刺激或假刺激的消退训练。将大鼠连接至刺激器，并放入操作性条件反射箱中。150 毫秒。每次声音刺激前，对迷走神经进行 30 秒的刺激。进行四次刺激音配对，每次间隔三到五分钟。使用示波器按照所述方案定期检查迷走神经刺激套管和输入位点的电学完整性。大鼠在消退阶段接受迷走神经刺激，并接受听觉恐惧条件化任务训练。在消退阶段仅接受少量未强化条件音刺激的动物，其条件性恐惧未见降低。相比之下，接受脑神经刺激（BNS）处理的大鼠表现出显著的僵直行为减少，程度与接受延长消退训练的假手术处理动物相似。此外，BNS处理动物在条件音未呈现期间的僵直行为也有所减少，提示其消退学习已泛化至所处环境背景。进一步研究表明，将迷走神经刺激（VNS）与消退训练配对可改变腹侧下边缘皮层与基底外侧杏仁核之间通路的突触可塑性。在麻醉动物中，假刺激且未能消除条件性恐惧反应的动物，其腹侧下边缘皮层的簇状刺激诱导了基底外侧杏仁核中诱发出的局部场电位的长时程抑制。在表现出显著消退条件性恐惧反应的动物中，这种突触抑制作用被逆转。此外，在单次消退训练期间给予迷走神经刺激（VNS）可促进长时程增强的诱导。观看本视频后，您应能充分理解如何将迷走神经刺激与行为训练结合使用。一旦掌握了VNS组件的制备和手术操作，若操作得当，整个过程可在约三小时内完成。在实施该手术时，重要的是要始终确保电连接的完整性。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

迷走神经刺激作为一种工具来诱导可塑性相关途径灭绝学习

来源：Sanchez, C. A., et al．大鼠慢性植入用外周神经刺激电极的制备．J. Vis.

通过慢性植入的外周神经袖带电极对大鼠进行迷走神经刺激

来源：Childs, J. E., 等．利用迷走神经刺激诱导与消退学习相关通路的可塑性．J. Vis. Exp.

通过大鼠模型中的迷走神经刺激减轻冻结行为

来源： Moeller, S., et al., 迷走神经刺激作为治疗难治性抑郁症的辅助神经刺激工具。 J. Vis. Exp.

迷走神经刺激疗法治疗难治性抑郁症

本方案描述了在大鼠进行学习与记忆任务时，如何暂时且远程地抑制离散脑区中神经元活动的方法。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件），旨在区分学习过程中的不同组分。...

一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

光遗传学方法被广泛用于操控神经元活动并评估其对脑功能的影响。本文概述了一种技术方案，该方案 在……之后 体内 光敏激活蛋白Channelrhodopsin的表达，使得能够 离体...

离体 光遗传学解析脑片中的恐惧环路

迷走神经刺激已被证实具有显著降低外周炎症的效果。本文介绍了一种改良的迷走神经刺激方案，可用于进一步研究胆碱能抗炎机制在局限性炎症反应中的作用。...

延长恢复时间并减少脂多糖给药以研究迷走神经刺激在有限炎症反应中的作用机制

迷走神经刺激（VNS）已被证明可作为难治性抑郁症（TRD）的辅助治疗手段，具有抗抑郁和抗自杀效应，并能改善生活质量。本方案提供了管理与调节迷走神经刺激器的逐步操作指南，以实现对难治性抑郁症的高效治疗。...

迷走神经刺激作为难治性抑郁症治疗中的辅助性神经刺激工具

本文描述了经皮耳迷走神经刺激（taVNS）技术的方法学概述、潜在作用靶点以及在人耳上的正确实施方法。...

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的实验室操作：技术、靶向定位与注意事项

目前用于构建可长期植入小型啮齿类动物的外周神经袖状电极的方法通常需要专用设备和/或经过高度培训的专业人员。在本方案中，我们展示了一种简单且低成本的可长期植入袖状电极的制备方法，并验证了其在大鼠迷走神经刺激（VNS）中的有效性。...

大鼠慢性植入外周神经刺激电极的制备

本文所述方法介绍了一种用于在大鼠行为相关神经环路中光遗传学逆转可卡因诱导的突触可塑性的实验流程。对丘脑-杏仁核突触进行持续的低频光刺激可诱导长时程抑制（LTD）。 在体 在可卡因暴露过的大鼠中，光遗传学诱导的LTD导致随后的线索驱动型觅药行为减弱。...

利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因觅药行为

本方案描述了在大鼠腹部迷走神经上植入电极阵列的外科手术技术，以及利用植入装置进行长期电生理记录和刺激的方法。...

清醒大鼠腹部迷走神经刺激与记录研究的植入手术

学习迷走神经刺激技术以增强条件性恐惧消退，通过电极植入和听觉恐惧条件反射训练，诱导突触可塑性变化。该方法为焦虑症治疗提供精准神经调控策略。

迷走神经刺激作为诱导与消退学习相关通路可塑性的工具

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