Name: Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung tumorspezifischer Endothelzellen aus genetisch modifizierten Mausmodellen. Diese Methode nutzt magnetische Säulen und Klonierungsringe für reine Zellpopulationen.

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ACD wird durch einen Zuschuss des National Institute of Health (R01-CA177875) unterstützt. LX ist Fellow im HHMI-finanzierten Programm für translationale Medizin an der UNC Chapel Hill. JVM wird durch ein T32-Pre-Doktoranden-Stipendium des Integrative Vascular Biology Program an der UNC Chapel Hill unterstützt. Wir danken Clayton Davis für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.

Das folgende Protokoll wird gemäß den Leitlinien, die von der Abteilung für Labortiermedizin an der University of North Carolina in Chapel Hill niedergelassen. 1. Bereiten Sie das folgende Material und Reagenzien vor dem Start <ol><li> Vorbereitung EC Medien durch Hinzu 400 ml niedrigen Glucose (1 g / l D-Glucose oder LG) Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml Antibiotika-Antimykotika, und hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 und Heparin-Komponenten aus dem im Handel erhältlichen Kits. </li><li> Vorbereitung 500 ml FACS-Puffer (0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS); filtriert durch ein steriles 0,22 um Filtertasse. </li><li> Zu sterilisieren oder zu desinfizieren Sezieren Bord. </li><li> Dissektion Stifte, chirurgische Scheren und Dissektoren sterilisieren. </li></ol> 2. EG-Isolation (Tag 1, ~ 5 Stunden) <ol><li> Euthanize Maus mit Kohlendioxid oder einem anderen Verfahren konform with der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Politiken. Hinweis: Mehrere Brusttumoren unterschiedlicher Größe (von 5 bis 15 mm Durchmesser) in einem einzigen genetisch veränderten Maus zu entwickeln, wie beispielsweise C3-Tag, sollten Sie alle von ihnen für TEC Isolation zu ernten. Bei Verwendung von Tumoren, die orthotop bei Mäusen eingepflanzt werden, Pool zwei vor drei 1 cm 3 Tumoren für eine einzige EG-Isolation. Hier verwenden wir Brusttumoren als Demonstration, aber das Protokoll kann für andere Tumorarten modifiziert werden. </li><li> Desinfizieren Maus durch Sprühen oder mit reichlichen Menge von 75% v / v Ethanol Abwischen des Mausbauchseite. </li><li> Resezieren Tumoren mit einer Schere und Dissektoren unter aseptischen Bedingungen in eine sterile Haube oder an einer Sterilbank. <ol><li> Ausstrecken und die Glieder der Mäuse Stift auf einem Seziertisch Bord. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit der Schere ohne Öffnen des Bauchfells. Lateral zerlegen zwischen der Haut und dem Bauchfell zu den Brustdrüsen, wo Tumore befinden.Das Bauchfell nicht öffnen. </li><li> Verbrauch nur Tumorgewebe von den Brustdrüsen, Weglassen normalen Brust Margen. Sorgfältig schneiden Sie Nicht-Tumor-Gewebe wie Haut und Muskeln, und legen Sie sezierten Tumoren in einem konischen Röhrchen mit 30 ml DMEM-LG auf Eis. </li></ol></li><li> Bringen Tumorproben zur Gewebekultur Kapuze; waschen Gewebe mit sterilem LG-DMEM 1-2 mal. </li><li> Transfer Tumoren von der konischen Röhrchen in einen sterilen Gewebekulturpetrischale, 2 ml DMEM-LG in der Schale, und Hackfleisch mit einem Paar von sterilen Schere in Stücke &lt;5 mm. </li><li> 5 ml Collagenase (stock = 2 mg / ml in Hanks Balanced Salt Solution, im Folgenden HBSS), 1 ml Dispase (stock = 2,5 U / ml in HBSS) und 75 &amp; mgr; l Desoxyribonuclease (lieferbar = 1 mg / ml in PBS ) in die Petrischale. Gesamtvolumen ist jetzt ~ 10 ml. </li><li> Übertragen Sie die Kollagenase / Gewebemischung aus der Petrischale mit einem gewebe Dissociator Rohr und auf einem Gewebe Dissociator für 60 Sekunden laufen zweimal (voreingestellt Dissoziation prOgram auf der Dissociator: 1270 Gesamt Schuss pro Lauf). Inkubieren mit leichten Schütteln auf einem Schüttler für 75 min bei 37 ° C. </li><li> Filter verdaute Gewebe durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb über einem 50 ml konischen Röhrchen. Rinse-Filter mit 5 ml FACS-Puffer, um jegliche verbleibenden Zellen zu waschen. Spin bei 280 xg für 5 Minuten und der Überstand vorsichtig abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Verdünnen Sie 1 ml der Stamm RBC Lysispuffer (10x) in 9 ml sterilem Wasser. Lyse der roten Blutzellen mit 10 ml Lyse-Puffer (1x) und unmittelbar Spin 5 min bei 280 x g. Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen, wenn wenig Blut sichtbar ist. </li><li> Resuspendiere in 10 ml FACS-Puffer. Mischen Sie 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau, und zählen lebende Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Die Zellen bei ~ 10 7 Zellen / 100 ul. Zugabe von 10 &amp; mgr; l FcR-Block pro 100 ul Zellsuspension, und Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> In Ratten-Anti-Maus-PE-konjugierten CD31 Antikörpers nach. Tabelle 1 auf Eis inkubieren 10-15 min und das Röhrchen klopfen, gelegentlich. </li><li> 10 ml FACS-Puffer auf das Rohr und Schleudern bei 280 × g für 5 min. Den Überstand vorsichtig abnehmen und waschen Sie das Zellpellet erneut mit 5 ml FACS-Puffer. Zentrifuge Zellen zu pelletieren. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Zellpellet. </li><li> Hinzufügen FACS-Puffer und Anti-PE-Mikrokügelchen gemäß Tabelle 2 auf Eis inkubieren. 10 - 15 min. Flick Rohr gelegentlich. </li><li> 10 ml FACS-Puffer und Spin-Proben bei 280 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 5 ml FACS-Puffer und Zentrifuge wieder. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Pellet. </li><li> Das Volumen auf 300 ul in FACS-Puffer. Spin durch 35 &amp; mgr; m-Sieb Zell Röhrchen mit 5 min bei 280 x g. Benutzen Sie 2 Rohre und ein größeres Volumen, wenn nötig. </li><li> Einrichten Magnet mehrgerüstigen und magnetischen Spalten in Haube, fügen Sie eine Spalte mit dem Separator und ins Gleichgewicht der Säule mit 2 ml FACS-Puffer. </li><li> Aspirate des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 - 1 ml FACS-Puffer. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert magnetischen Spalte. </li><li> Dreimal mit 2 ml FACS-Puffer Die Säule, und sammeln Flow-Through (FT) in einem 15-ml-Tube (FT-Fraktion). </li><li> Nehmen Sie die Spalte aus dem Separator und Elution mit 2 ml FACS-Puffer in einen anderen 15 ml-Röhrchen (Eluatfraktion). Verwenden Sie Kolben, um sicherzustellen, alle Zellen aus der Säule. Wiederholung der Elution noch zwei Mal mit 2 ml FACS-Puffer jedesmal. </li><li> Spin des Eluats bei 280 × g für 5 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml EC Medien. </li><li> Ebenso teilen die Eluatfraktion (~ 6 ml) in 10 cm Gelatine beschichteten Schalen. Seit drei 1 cm 3 Tumoren, Platte eluiert Zellen in mindestens vier Platten. Alternativ Platte eluiert Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen in mehrere Platten (z. B. Saatgut, 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml des Eluates in vier Platten), um sicherzustellen, daß einet mindestens eine Platte ist dünn mit eluierten Zellen ausgesät. Prüfen, ob die Konfluenz der anhaftenden Zellen ist bei ~ 1% am nächsten Tag (dh ungefähr 1,0 bis 2,0 x 10 5 anhaftenden Zellen). Anmerkung: Die Zellen brauchen spärlich zu plattierenden sodass EC Kolonien können, ohne von anderen Zelltypen kontaminierten bilden. </li><li> Platte FT-Fraktion in einem 10 cm-Schale zu lassen Zellen zu gewinnen O / N. Überprüfen Sie, ob die Platte 80-100% konfluent am nächsten Tag. Frieren Sie die Zellen nach unten (-80 ° C) in 250 ul zellgefrierenden Medien in einem Kryoröhrchen und speichern sie in flüssigem Stickstoff am nächsten Tag. Anmerkung: FT-Fraktion kann zur Tumorzellisolierung zu einem späteren Zeitpunkt und / oder als Negativkontrolle für EC Genexpressionsanalyse der isolierten EC-Klone verwendet werden. </li><li> Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Kolonien beginnen, nach 7 bilden - 10 Tage. Kleine EG Kolonien können so früh wie Tag 3. Markieren Sie die Kolonien mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Schale identifiziert werden. </li><li> Abkratzen unspezifische cEllen rund um die identifizierten Kolonien mit einer sterilen 200 ul Pippet Spitze. </li></ol> 3. Colony Auswahl mit Cloning Ringe <ol><li> Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. 7 Tage - EC Reinheit kann durch LDL (Dil-Ac-LDL) zusätzlich bei etwa 5 überprüft werden. In 50 ul LDL pro 10 ml EC-Medium und Inkubation für 3-4 h vor der Überprüfung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Mehrere LDL + EC-Klone konnten bei ~ Tag 7 beobachtet werden. </li><li> Beginnen Ernten EC Kolonien, wenn sie Durchmessern von 3 erreichen - 5 mm in der Größe. (Wählen Sie große Kolonien, die mit kleinen LDL + Zellen, die für beste Ergebnisse gepackt werden.) </li><li> Vor der Ernte EG mit Clonierungsringen, Vorstrich ein paar 6-Well-Platten mit 0,5% Gelatine. Saugen Sie Gelatine, 2 ml EC Medien in jede Vertiefung, und halten Sie die Platten in einen Inkubator, bis sie benötigt. </li><li> Abkratzen Nicht-EG an den Rändern der Kolonien, um sicherzustellen, dass keine anderen Zelltypen werden mit dem Klonen Ring eingefangen werden. </li><li> Mit einemPhasenkontrastmikroskop (4X oder 10X-Objektiv), Exposé mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Kulturschale die Bereiche mit EC Kolonien. </li><li> Waschen Sie die Platte mit 10 ml PBS und lassen Sie eine sehr dünne Schicht aus PBS in der Platte beim Ansaugen. (Wichtig: eine kleine Menge (~ 0,5 ml) PBS werden die Zellen während des Klonen-Ring-Verfahren am Leben zu erhalten; auch muss Gewebekleber Wasser zu binden.) </li><li> Wählen Sie eine Klonierung Ring entsprechender Größe. Verwenden Sie ein Paar Pinzette zu holen ein Ring, und mit einer 10 ul Pipettenspitze eine kleine Menge von Gewebekleber gleichmäßig auftragen auf das Klonen Ring. Hinweis: Verwenden Sie nur eine minimale Menge (~ 0,2 &amp; mgr; l für einen kleinen Ring) der Gewebekleber zum Klonen Ringe, und stellen Sie sicher, Gewebekleber wird gleichmäßig über die Bodenfläche verteilt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Übermäßige Gewebekleber erzeugt Wärme und bildet Filme, die Zellen zu töten kann. </li><li> Legen Sie das Klonen Ring über die EG-Kolonie. Drücken Sie vorsichtig das Klonen Ring um die ri klebenng auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien werden nicht vor dem Kleben der Ring getrocknet. </li><li> Unmittelbar Pipettieren von 25 ul der enzymatischen Zellablösung Lösung in den Klonierungsvektor Ring und inkubiere ~ 1 min oder bis die Zellen sind lose befestigt. </li><li> Pipet-Zellen bei der Klonierung Ring tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit vorgewärmten EG Medien. (Wichtig: die Platte, um Zellen zu dispergieren, nicht schütteln; EG lieber in dichten Trauben wachsen.) Waschen Sie das Klonen Ring mit 50-100 ul EG Medien, um so viele Zellen wie möglich zu sammeln und übertragen alle Waschanlagen in den gleichen 6-Well- . </li><li> Wenn einige Kolonien in der 10 cm-Schale zu klein, um zu ernten, 10 ml frischem Medium, lassen die Kolonien wachsen für ein paar Tage, und wiederholen Sie den Klonen Ring Prozedur erneut. </li><li> Wachsen geernteten Kolonien in Platten mit 6 Vertiefungen bis 80 - 100% konfluent waren, und die Übertragungszellen zu 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen, zuvor in einer 10 cm-Gewebekulturschale expandierenden ihnen. Abkratzen Verunreinigung Zellen. Wiederholeneine weitere Runde des Klonens Ringverfahren (Schritte von 3,5 bis 3,10), wenn nötig. Halten Zellen relativ konfluent (~ 60-70%) bei der Erweiterung. EG kann aufhören zu wachsen, wenn überzogen zu spärlich. </li><li> Charakterisieren EG durch FACS, Färbung, PCR usw. Beachten Sie, dass Dil-Ac-LDL ist fluoreszierend und können mit PE oder andere fluoreszierende Antikörper für FACS stören. </li></ol>

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<li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF%CE%B2-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li>
<li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li>
<li>Chi, J. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Aufgrund der Schwierigkeiten bei der reinen Primär TEC Kulturen, viele in vitro-Studien Ersatz TEC mit handelsüblichen EC Linien oder primäre EC wie humane Nabelvenen-EC (HUVEC) 13. Jedoch können diese EG-Populationen aus normalen Geweben dienen nur als Proxy für TEC, die sich deutlich von ihren normalen Gegenstücken unterscheiden. Zum Beispiel sind TEC phänotypisch und funktionell abnormalen in vivo und einige dieser Anomalien können tragbare in vitro 14-18 sein...

Endothelzellen (EC) sind bei der Entwicklung von soliden Tumoren essentiell. Von Einleitung der Angiogenese-Schalter in ruhenden Tumoren zu Verbreitung und Aussaat von Metastasen an entfernten Stellen, EG bilden die Leitungen, die Blut, Sauerstoff bereitzustellen und Nährstoffe, um das Tumorwachstum 1 aufrecht zu erhalten. Wie vor kurzem vorgeschlagen, EC auch Perfusions-unabhängige Funktionen und bilden eine Nische, die das Wachstum von Krebs-Stammzellen und anderen Tumor Stromazellen 2-5 unterstützt. So hochgereinigte Tumor-spezifischen EG (TEC) für die in-vitro-Kultur ermöglicht Routine funktionelle Studien, die Licht auf neuartigen molekularen Mechanismen der Vermittlung der Tumorangiogenese und Übersprechen mit Tumorzellen zu vergießen wird. EC sind hochspezialisierte Abhängigkeit von dem Ursprungsgewebe 6. Aufgrund der Heterogenität der verschiedenen Tumorarten und der Tumor-Mikroumgebung kann TEC auch einzigartige Funktionen, die eine tumorspezifische Spezialisierung o widerspiegeln anzeigenf das Gefäßsystem. Zum Beispiel gibt es auffallende Variabilität der Genexpressions in TEC aus unterschiedlichen Typen oder Qualitäten von Tumoren 7,8 isoliert. Allerdings können häufige Co-Reinigung von Nicht-EG, insbesondere Tumor-assoziierten Fibroblasten und Tumorzellen, mit TEC verwechseln genomweite Expressionsanalysen. Diese unerwünschten Zelltypen sind besonders problematisch, in Studien, die auf langfristigen in vitro Expansion des TEC Kulturen verlassen. Hier beschrieben wird ein High-Fidelity-Verfahren, die durchweg reine EG Kulturen von Tumoren und anderen Geweben produziert. Nach immunomagnetische Spalte Bereicherung der EG-Fraktionen und Entfernen von co-gereinigten Nicht-EG, um eine zusätzliche Klonen-Ring Schritt reine EG Kolonien verwendet 9 zu erfassen. Jede Kolonie in Kultur für mehrere Passagen, ohne die Entstehung von gefährdend Nicht-EG erweitert werden. Dieses Verfahren ergibt ebenfalls mehrere EC-Klone aus einer einzelnen Isolierungsverfahren, die ideal für die Untersuchung von Endothelial Heterogenität. Darüber hinaus wird gezeigt, dass CDH5 cre: ZsGreen l / s / l-Reporter-Mäuse sind ein wertvolles Werkzeug zur Erzeugung von &quot;Schicksal-mapped&quot; lesbar und dauerhaft markierte EC, die ZsGreen Fluoreszenz in Kultur 10 aufrecht zu erhalten. Mit geringfügigen Anpassungen des Protokoll sollte dieses Verfahren an verschiedene Tumortypen oder normalen Geweben sein.

<table><tbody><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (1 g/L D-Glukose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>Nicht alle Komponenten verwendet</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Hitze inaktiviert bei 56 &de; C für 30 min</td></tr><tr><td>Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>FACS Puffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,5 % BSA und 2 mM EDTA in PBS, gefiltert durch einen 0,22 &mu; m Filter</td></tr><tr><td>75% v/v Ethanol zur Desinfektion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Mikrokügelchen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>Medium zum Einfrieren von Zellen (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II &nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td>Herstellung einer Stammkonzentration von 2 mg/ml in HBSS</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I (DNase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002004</td><td>Herstellung einer Stammkonzentration von 1 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>Enzymatische Zellablösungslösung (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, 2 % in Wasser, Gewebekulturqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>In PBS verdünnen, um 0,5 % Gelatinelösung herzustellen</td></tr><tr><td>Maus-FcR-Blockierungsreagenz&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02104</td><td>Stellen Sie eine Stammkonzentration von 2,5 U/ml in HBSS</td></tr><tr><td>PE-Ratte Anti-Maus CD31 Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer (BD Pharm Lyse)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>steriles Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau, 0,4 %&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen (steril)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen (steril)&nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebedissoziatorröhrchen (gentleMACS) C-Röhrchen)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Zellseparator (MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 100 &mu; M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Klonringe (verschiedene Größen)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierplatte</td><td></td><td></td><td>Sterilisieren oder desinfizieren Sie mit 75 % v/v Ethanol vor Gebrauch&nbsp;</td></tr><tr><td>Präparierzange und -schere</td><td></td><td></td><td>Vor Gebrauch sterilisieren&nbsp;</td></tr><tr><td>Präpariernadeln 2 "</td><td></td><td></td><td>Vor Gebrauch sterilisieren&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen mit 35 μ; m Filterkappe</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Filterbecher (Stericup, 0,22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Feinmarker-Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekleber (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Oder eine Zentrifuge mit ähnlichem Fassungsvermögen für 15 ml und 50 ml konische Röhrchenzentrifugation</td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebedissoziator (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Voreingestelltes Programm "m_impTumor_01" für die Gewebedissoziation&nbsp;</td></tr><tr>Gefrierschrank <td></td><td></td><td></td><td>für flüssigen Stickstoff</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte oder Rotationsschüttler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrastlichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultur expansion von tumorspezifischen endothelzellen

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Frisch isolierte Tumor-spezifische Endothelzellen (TEC) kann zur molekularen Mechanismen der Tumorangiogenese zu erforschen und dienen als ein in vitro-Modell für die Entwicklung neuer Inhibitoren der Angiogenese bei Krebs ist. Jedoch ist die langfristige in-vitro-Expansion von murinen Endothelzellen (EC) herausfordernde aufgrund phänotypischer Drift in Kultur (endothelial-to-mesenchymale Transition) und Verunreinigungen mit Nicht-EC. Dies gilt insbesondere für die TEC die leicht durch co-gereinigte Fibroblasten oder Tumorzellen in Kultur outcompeted werden. Hier wird ein High-Fidelity-Isolierungsverfahren, die die Vorteile der Anreicherung immun gepaart mit Kolonie-Auswahl und in vitro Expansion dauert beschrieben. Dieser Ansatz erzeugt reine EG Fraktionen, die völlig frei von verunreinigenden Stromazellen oder Tumorzellen sind. Es wird auch gezeigt, dass die linien zurückzuführen CDH5 cre: ZsGreen l / s / l Reportermäusen, mit dem Protokoll, beschrieben, sind ein wertvolles Werkzeug, um Zell verifizierenReinheit der isolierten EG Kolonien aus diesen Mäusen zeigen, langlebige und brillante ZsGreen Fluoreszenz in Kultur.

EC stellen nur geringfügige einen Bruchteil der gesamten Zellpopulation in den meisten Geweben von Erwachsenen 11. Es ist daher wichtig, vollständig zu verdauen, die geerntete Gewebe in eine Einzelzellsuspension, die die maximale Freisetzung von EC von extrazellulärer Matrix (ECM) und Bindegewebe gewährleistet. Nach unserer Erfahrung bietet CD31-vermittelte immunomagnetische Auswahl nur angereicherten aber nicht reine EG Fraktionen; Daher ist ein weiterer entscheidender Schritt, die physische Entfernung von c...

Wir berichten über eine zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären tumorspezifischen Endothelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, tumorassoziierte endotheliale Zellen mithilfe magnetischer Säulen und Klonierungsringe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst Tumorgewebe, das von Mäusen isoliert wurde, digeriert wird, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, die Population endothelialer Zellen mittels einer magnetischen Säule anzureichern. Anschließend werden die Endothelzellkolonien mithilfe der Klonierungsring-Methode vermehrt und ausgewählt. Im letzten Schritt erfolgt die Ausweitung und Charakterisierung der ausgewählten Endothelzellkolonien. Letztendlich wird die Reinheit der klonalen Populationen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung spezifischer Marker für Endothelzellen nachgewiesen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem FACS-Sorting besteht darin, dass sie schonender für die Zellen ist, was eine höhere Ausbeute an lebensfähigen endothelialen Zellen und eine anschließende Kolonieexpansion ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorangiogenese zu beantworten, beispielsweise wie eine Dysfunktion vaskulärer endothelialer Zellen in Tumor

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Tumor-initiierende Zellen (TICs) könnten ein brauchbares therapeutisches Ziel für die Behandlung von Eierstockkrebs darstellen, einer hochgradig wiederkehrenden und tödlichen Krankheit. Wir stellen ein Protokoll für Kulturbedingungen vor, die für diese hochgradig tumorigene Zellpopulation anreichern.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Tumor Endothelzellen sind wichtige Determinanten für die Tumor-Mikroumgebung und den Verlauf der Krankheit. Hier wird ein Protokoll für die Isolation der reinen und tragfähige endothelial Zellen aus menschlichen kolorektalen Karzinom und normalen Doppelpunkt in der Arzneimittelforschung Test- und Pathogenese verwendet werden beschrieben.

Isolierung der menschlichen Endothelzellen aus normalen Colon und kolorektalen Karzinom - eine verbesserte Protokoll

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, um ein murines Xenograft-Modell der venösen Fehlbildung zu erzeugen. Dieses Modell basiert auf der subkutanen Injektion von vom Patienten abgeleiteten Endothelzellen, die hyperaktivierende TIE2- und/oder PIK3CA-Genmutationen enthalten. Xenograft-Läsionen rekapitulieren die histopathologischen Merkmale des VM-Patientengewebes.

Ein vom Patienten abgeleitetes Xenograft-Modell für Venöse Fehlbildungen

Ein Protokoll wird für die Isolierung und Primärkultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) aus neonatalem Maus-Hirngewebe vorgestellt, um ein robustes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schrankfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erstellen.

Isolierung und Kultur mikrovaskulärer Endothelzellen im Maushirn

Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung tumorspezifischer Endothelzellen aus genetisch modifizierten Mausmodellen. Diese Methode nutzt magnetische Säulen und Klonierungsringe für reine Zellpopulationen.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

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