Name: Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a identificar patógenos bacterianos raros usando MALDI-TOF MS e sequenciamento do gene 16S rRNA. Este método rápido e econômico melhora o diagnóstico microbiológico clínico de espécies como Myroides odoratimimus.

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Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Enno Jacobs por seu apoio contínuo.

1. Extracção de DNA bacteriano <ol><li> Preparação de solução de PBS <ol><li> Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g de NaCl, num balão e encher com água destilada para um volume final de 1000 ml. Ajustar o pH para 7,4. Para utilização final filtrar a solução através de uma bactéria-proof (0,22) filtro. </li></ol></li><li> Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-negativas <ol><li> Streak o material do paciente em meio de cultura adequado (por exemplo, Columbia ágar sangue), identificar e isolar patógenos potenciais. </li><li> Prepare cultura pura e executar coloração de Gram, a fim de determinar morfotipo e para confirmar a pureza e a cultura de 49. </li><li> Escolher uma única colónia bacteriana e transferi-lo com uma ansa de inoculação de utilização única 1 ul num tubo de reacção de 2,0 ml estéril que contém 1 ml de solução de PBS. </li><li> Incubar esta suspensão em um Thermomixer a 95 ° C durante 10 min. Após a incubação, deixar o extracto bacteriano (contendo o DNA dissolvido) arrefecer à temperatura ambiente, utilizando-a directamente para a amplificação ou armazenar a -20 ° C para utilização posterior (Figura 1a). </li></ol></li><li> Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-positivas <ol><li> Streak o material do paciente em meio de cultura adequado (por exemplo, Columbia ágar sangue), identificar e isolar patógenos potenciais. Realizar coloração de Gram, a fim de confirmar morfotipo da cultura. </li><li> Prepare cultura pura e executar coloração de Gram, a fim de determinar morfotipo e para confirmar a pureza da cultura. </li><li> Escolha uma única colônia de bactérias com 1 ml de loop de inoculação estéril e suspendê-la em 500 solução de PBS em um tubo de 2,0 ml reação. </li><li> Adicionar 500 mL de vidro-esferas e transferir o tubo para um homogeneizador oscilante, operado a frequência máxima e a amplitude (50 Hz), durante 5 min. Use vidro-esferas de 1,0 mm de diâmetropara romper as paredes das células bacterianas. </li><li> Incubar este tubo durante 10 minutos a 95 ° C e arrefecer à temperatura ambiente. Utilizar o extracto, quer directamente para a reacção de PCR ou armazenar a -20 ° C para posterior utilização. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA PCR <ol><li> Preparação de iniciadores de amplificação <ol><li> Use o TPU1 primers (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) como iniciador directo e RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC AT CTP TGT T-3&#39;) como iniciador reverso 25. Prepara-se uma solução stock de iniciador com DNAse e RNAse água livre, com uma concentração de 100 pmol / ul (100 uM) e dilui-se ainda mais para uma solução de trabalho a 10 pmol / uL. Armazenar o iniciador e da solução de trabalho à temperatura de -20 ° C ou utilizar directamente. </li></ol></li><li> Preparação da Mistura de Reacção de PCR <ol><li> Pipetar 1 mL de cada iniciador, 1 ul de dNTP-Mix (100 mM), 2,5 ul do extracto de DNA, 5? L de 10x tampão PCR (25 mM contendo MgCl 2), 0,25 mL de Taq-polimerase (5 unidades / mL) e 39,25 mL DNase e RNase água PCR livre em um tubo de reacção 200 mL estéril. </li></ol></li><li> Protocolo de PCR <ol><li> Inicie o programa de PCR construído como se segue: Em primeiro lugar, um passo de incubação inicial a 95 ° C durante 5 min que é necessário para activar a polimerase de Taq-. Em segundo lugar, 35 ciclos de amplificação, que contém um 1 min. passo de desnaturação a 95 ° C, um 1 min. iniciador passo de recozimento a 50 ° C, e um passo de extensão do primer 1,5 min a 72 ° C. Em terceiro lugar, uma extensão final de 10 min a 72 ° C. Finalmente, a reacção de PCR é arrefecida a 4 ° C. NOTA: Staphylococcus aureus e H2O servir como controlo positivo e negativo (Figura 1b). </li><li> Colocar o tubo contendo a mistura reaccional de PCR no termociclador e iniciar o programa. </li></ol></li><li> A purificação do produto de PCR NOTA: De modo a purificar o produto de PCR, ambos os vários protocolospode ser usado de enzima à base ou com uma matriz de adsorção de sílica. A limpeza de um só passo de PCR utilizado aqui utiliza duas reacções enzimáticas hidrolíticas. Enquanto exonuclease I (Exo I) remove DNA de cadeia simples, fosfatase alcalina de camarão (SAP) hidrolisa dNTPs não incorporados. O segundo procedimento é baseado em uma técnica de adsorção com membrana de sílica com um sal de alta rápida ligação - lavar - baixo teor de sal ciclo de eluição. <ol><li> Adicionar 1,5 uL de uma mistura enzimática contendo tanto Exo I e a SAP a 25 uL do produto de PCR, misturar cuidadosamente e transferir para um termociclador aplicação de um protocolo simples de primeiro 15 min a 37 ° C, seguido de 15 min a 80 ° C. Armazenar o produto de PCR purificado, quer à temperatura de -20 ° C ou usá-lo directamente como alvo para a marcação de PCR. </li></ol></li></ol> 3. DNA de agarose eletroforese em gel <ol><li> Preparação do tampão de electroforese (TBE-tampão) <ol><li> Titula-se 54,0 g (445 mM) de base Tris, 27,5 g (445 mM) de ácido bórico e 20 ml de uma 0,5 M de EDTA (10mM) solução a pH 8,0 com NaOH num frasco e preenchê-lo com água destilada até um volume total de 1.000 ml. Em seguida, diluir esta tampão 5x 1:10 com água destilada (0,5x TBE) para eletroforese. </li></ol></li><li> Preparação do tampão de carregamento <ol><li> Misturar 250 mg de azul de bromofenol, 250 mg de xileno cianol FF e 15 g de polissacarose (Tabela Materiais) para um frasco. Em seguida, preenchê-lo com tampão 0,5x TBE para um volume total de 100 ml. Alíquota o corante de carga a porções de 1 ml e armazenar a -20 ° C para posterior utilização. </li></ol></li><li> Fundição do gel de agarose <ol><li> Pesar 6 g de electroforese de agarose padrão de 300 ml de tampão TBE 0,5x (ver secção 3.1.1) num balão, para se preparar a 2% (w / v) de gel de agarose. Em seguida, coloque a mistura de agarose em um forno de micro-ondas, aquecê-lo ponto próximo de ebulição até que a agarose esteja completamente dissolvido ea solução parece clara. </li><li> Deixe as agarose fundida arrefeça suficientemente e adicionar 10 ul de uma solução 1% (w / v) de brometo de etidio da solução. Verter a solução em um molde e colocar um pente de gel (permitindo 30 poços) no molde. Remover o pente quando o gel é completamente solidificada e colocar o gel dentro da câmara de electroforese contendo tampão TBE 0,5x. NOTA: O brometo de etídio é tóxico e mutagênico. Por isso, devem ser manuseados com cuidado. É aconselhável usar luvas de borracha nitrílica. Há manchas de ácidos nucleicos intercalante alternativos que podem ser utilizados como uma alternativa não tóxica. </li></ol></li><li> Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR NOTA: A fim de verificar o tamanho correcto dos produtos de amplificação de PCR e para estimar a concentração de ADN do produto de PCR purificado é separado num gel de agarose. <ol><li> Pipeta 2 ul do tampão de carga para um tubo de reacção de PCR e adicionar 8 ul do produto de PCR. Pipetar esta mistura nas cavidades do gel. Adicionar 8 mL de um marcador de tamanho-peso molecular (escada de DNA) em um poço separado para estimar o tamanho do produto de PCR. </li><li> Apliqueuma voltagem constante de 10 V / cm e parar a electroforese, logo que o marcador de azul de bromofenol atingiu cerca de ¾ do comprimento total do gel. Visualizar os fragmentos de PCR separadas usando um UV-transilluminator (comprimento de onda 302 nm) e documentá-los usando um sistema de gel documentação. Estimar a quantidade de DNA por comparação visual com a escada de DNA. Use cerca de 10 ng como alvo para a rotulagem PCR. </li></ol></li></ol> 4. O sequenciamento Sanger <ol><li> Cycle Sequencing PCR NOTA: Executar a rotulagem PCR em uma reação de 10 mL usando um kit comercial (Materials Table). <ol><li> Adicionar 2 mL de mastermix reacção 5x, 2 ul da preparação de ADN, 1,5 ul de solução TPU1 ou RTU4 de trabalho (10 pmoles / ul) e 4,5 ul de DNase e RNase água livre. </li><li> Coloque esta mistura reacção de sequenciação em um termociclador e executar outra PCR. No total, 25 ciclos de processo que consiste em um passo de desnaturação (96 ° C,10 seg), um passo de recozimento (45-60 ° C, 5 segundos) e um passo de extensão (60 ° C, 2 min). Finalmente, arrefece-se a reacção a 4 ° C. </li></ol></li><li> A purificação da reacção de sequenciação <ol><li> Purifica-se a mistura de reacção de marcação utilizando colunas de centrifugação comerciais para a purificação de PCR (Tabela Materiais). </li><li> Carga de 10 uL da reacção de sequenciação para a matriz de gel-filtração pré-hidratado e realizar um passo de centrifugação a 750 xg durante 3 min. NOTA: Através da utilização do presente procedimento de terminadores corantes não incorporadas são retidos na matriz de gel. </li><li> Em seguida, secar o eluído aquoso num concentrador de vácuo. Centrifugar a 2.500 xg durante 20 a 30 min a 40 ° C para completar a secura. </li><li> Adicionar 10 ul de formamida desionizada, em seguida, altamente desnaturar a 90 ° C durante 2 min e arrefece-se a mistura em gelo. Pipetar 10 ul das amostras desnaturadas numa placa de 96 ul. Armazenar o produto de PCR seca e limpa-se a -20 ° C, se a análise épara ser realizada a uma hora mais tarde. </li></ol></li><li> 16S rRNA gene seqüenciamento e análise da sequência de ADN NOTA: Realizar análise de sequência em um sequenciador automático (Tabela de Materiais). O sequenciador usado aqui é um sistema de electroforese capilar à base de fluorescência automatizada que analisa 4 amostras simultaneamente (matriz de 50 centímetros 4-capilar) com um líquido de polímero 67 (Figura 1C). <ol><li> Colocar a placa de microtitulação no sequenciador. Escrever uma folha de amostra (registro placa), conforme estabelecido em 2, guardá-lo e iniciar o sequenciamento run / análise a seguir os passos indicados em 1. NOTA: Duração de uma corrida sequência é de 2 horas e fornece dados de 800 a 1.000 pb. </li><li> Abra o software de análise de sequenciação (Materials Table). dados de sequência são dados como um arquivo de texto (.seq) e um arquivo contendo o electrofograma incluindo os valores de qualidade (QV) (.ab1). Observação: chamar Base é automaticamente performado pelo software de análise de sequenciação e eletroferograma subjacente é verificado visualmente (por exemplo, altura do pico, a separação de pico) antes que a sequência é usada para outras aplicações. </li><li> Compare o arquivo de seqüência de DNA armazenada com o algoritmo BLAST NCBI banco de dados nr usando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS NOTA: O espectrómetro de massa utiliza um laser de 337 nm, N2 e é operado por um software de controlo específico (Tabela Materiais). Spectra são registrados no modo linear e uma gama de massa entre 2.000 a 20.000 Da é coberto. A interpretação dos dados e a atribuição de pontuações para as amostras é efectuada em tempo real por um programa de análise (Tabela Materiais) (Figura 1D). <ol><li> Preparação de Bactérias por MALDI-TOF MS Análise <ol><li> Crescer as bactérias de interesse (por exemplo, Myroides odoratimimus) sobre Colagar de sangue umbia contendo 5% de sangue de cavalo a 37 ° C durante 18 a 24 horas, dependendo da estirpe bacteriana (Figura 2a). Realizar coloração de Gram para verificar a morfotipo do organismo sob investigação, bem como a pureza da cultura. </li><li> Usar um palito de madeira para a transferência de uma única colónia bacteriana para um poço de um alvo de aço de 96 poços (Figura 2b e 2c). Ponto 1 ml de ácido fórmico 70% em cima do organismo seca ao ar no alvo de aço e deixar secar por cerca de 2-3 min. </li><li> Em seguida, sobrepor o local com solução de matriz 1 ul, contendo 50 mg / ml de CHCA (α-ciano-4-hidroxicinâmico) num solvente orgânico (50% de acetonitrilo, 2,5% ácido trifluoroacético, 47,5% de H2O). NOTA: O método da sobrecamada de ácido (no método de preparação placa) pode ser usado para melhorar a qualidade dos espectros de massa. Tem sido demonstrado que, para as bactérias Gram-positivas, um &quot;ataque ácido&quot; VA aumenta a pontuaçãolues do espectro medido 45. NOTA: Alternativamente, um sistema de preparação de amostras automatizado (Tabela Materiais) pode ser utilizado no qual os pontos de contacto livre de 1 ul de 70% de solução de ácido fórmico e, após um primeiro ciclo de secagem, a solução de matriz 1 ul são aplicados sobre a mancha bacteriana. As amostras são então secas sob condições padronizadas a 60% de umidade relativa e está pronto para usar para análise. </li><li> Deixe o esfregaço com uma matriz revestida seca ao ar novamente por cerca de 5 minutos em uma capa. Esta mancha bacteriana com a matriz aplicada é agora estável por muitas horas. NOTA: manchas bacterianas sem matriz pode não ser estável devido à degradação de proteínas. </li></ol></li><li> Executando a MS Análise de MALDI-TOF <ol><li> Introdução de amostras <ol><li> Abra o software de nossas IHMs (Materiais Tabela) controle. </li><li> Arejar a porta de carregamento de amostra do espectrómetro de massa, premindo o botão IN / OUT do instrumento. </li><li> Abra a porta de carregamento após um clique e insira a placa-alvo MALDI-TOF MS com a mancha bacteriana seca mais matriz. </li><li> Feche a porta e evacuar novamente. Observar vácuo e quando se chega a 4,5 x 10 -6 mbar iniciar a medição. </li></ol></li><li> Análise de amostras <ol><li> Abra o software de análise de nossas IHMs (Tabela de Materiais) e clique no menu &quot;Arquivo&quot;. Selecione &quot;Nova classificação&quot; e um novo &quot;assistente de classificação em tempo real MALDI biotyper&quot; janela se abre. Digite o nome do projeto, por exemplo &quot;project_1 medição Myroides, no campo&quot; Nome do projeto &quot;e pressione o botão&quot; Novo &quot;. De acordo com a nova caixa de diálogo denominada&quot; Novo projeto &quot;nome do projeto de seleção e continue pressionando o botão&quot; OK &quot;. </li><li> No &quot;Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI&quot; observar a janela &quot;colocação Analito&quot; aberto. Selecionar posições de destino (por exemplo, A1, A2, A3 ...), bem-click qualquer posição selecionada (indicada por um quadrado azul) e selecione &quot;Adicionar amostras&quot;. Na tabela aberta automaticamente tipo de vista em nome da amostra, ID da amostra e, opcionalmente, um comentário. Clique no botão &quot;Next&quot; para prosseguir. </li><li> No &quot;Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI&quot; observar a &quot;Seleção de MALDI métodos biotyper&quot; janela aberta. Selecione &quot;Bruker Taxonomia&quot; de &quot;MSPs de árvores de taxonomia&quot; e clique em &quot;Next&quot; para continuar. </li><li> No &quot;Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI&quot; observar a janela &quot;Resumo do Projeto&quot; aberto. Verifique as entradas inseridas dadas acima para o projeto de classificação real. Comece a classificação executado pressionando o botão &quot;Finish&quot; (Figura 2d - f). A medição inicia-se automaticamente quando o vácuo adequada seja atingida. </li><li> Siga a classificação de execução até que a medição é concluída com êxito. Veja a tabela de resultados em tele &quot;MALDI Biotyper Realtime Myroides classificação do projeto de medição project_1&quot; abrir o menu &quot;Visualizar&quot; e clique em &quot;Resultados&quot;. </li><li> Ver os &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classificação Resultados&quot; como arquivo HTML no navegador padrão web. Imprimir e salvar os resultados. </li></ol></li><li> Medida de um padrão de teste diariamente antes da amostra de análise para calibrar o instrumento e executar instrumento semanal de validação (instrumento de auto-teste). Nota: Durante a medição MALDI-TOF Os espectros são analisados ​​em tempo real pelo software de análise (Tabela Materiais). A lista de dez espécies com suas respectivas pontuações é dado e é alimentada no sistema de informação laboratorial (LIS) para relatórios. </li><li> Avaliar criticamente os resultados MALDI-TOF MS (ver resultados representativos) e, se necessário, incluir outros testes, tais como perfis biochemical- e antibióticos suscetibilidade ou 16S rRNA sequenciamento de genes e, se necessário, coloração de Gram paraa atribuição de uma espécie bacteriana para o relatório microbiológica. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ambos MALDI-TOF MS e 16S rRNA sequenciação genética oferecem a possibilidade de identificar um grande número de diferentes bactérias. MALDI-TOF MS é um método rápido e barato, o que é fácil de manusear e de grandes bases de dados de espectros de massa bacteriana estão disponíveis. Por esta razão, MALDI-TOF MS é um custo método rápido, eficaz e de confiança para realizar os estudos de rastreio focados em agentes patogénicos bacterianos raras 17,20,39,51. Em um estudo prospectivo comparando MALDI-TOF MS com out...

identificação segura de agentes patogénicos raros em diagnósticos de rotina é dificultada pelo fato de que os métodos culturais e bioquímicos clássicos são complicados e, por vezes questionável. Além disso, um laboratório de diagnóstico microbiologia tem de processar um grande número de agentes patogénicos, que vão desde algumas centenas a vários milhares, diariamente, o que requer o uso de sistemas automatizados. Em adição à gestão de um alto rendimento diária, é necessária a identificação precisa de espécies bacterianas. Isso se justifica, uma vez que diferem em seu padrão de susceptibilidade antimicrobiana e identificação, portanto, correta fornece o clínico com informações essenciais para escolher antibióticos apropriados (por exemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. sistemas de identificação microbiana automatizados (AMIS) aplicar conjuntos padronizados de reações enzimáticas para caracterizar as propriedades metabólicas de isolados bacterianos <sup&gt; 13,15,16,26,27. Embora os cartuchos utilizados nestes sistemas utilizam um grande número de diferentes reacções bioquímicas, por exemplo, 47 na placa de GN da amis utilizado neste estudo 52, esta estratégia permite a identificação segura apenas para um conjunto limitado de bactérias. Além disso, o banco de dados, um sistema especialista avançado, está claramente centrado na detecção de bactérias relevantes e altamente relevantes de importância médica 13,15,16,36. Dois outros sistemas, amplamente utilizado em laboratórios, também se aplicam esta abordagem bioquímica para a identificação de bactérias. Estudos recentes demonstram uma precisão de identificação comparáveis ​​entre os Amis utilizados neste estudo e um dos concorrentes (93,7% e 93,0%, respectivamente), enquanto que o 3º Amis tem uma precisão de apenas 82,4% de identificação em nível de espécie 35. Tais discrepâncias podem ser explicadas pela qualidade das referências de dados de identificação subjacentes, as versões de kits e software, diferenças em metabolismo e competência do pessoal técnico 35,36. Dois sistemas de MALDI-TOF MS automatizado (sistema de identificação microbiana MALDI-TOF, IHMs) são usados ​​principalmente. Estes sistemas permitem a detecção de um grande número de espécies bacterianas com base no seu espectro de massa de proteína de impressões digitais. Por exemplo, a base de dados dos MMIs utilizadas contém 6000 espectros de referência. Sistemas de identificação baseados em espectrometria de massa oferecem detecção rápida e confiável de uma grande variedade de microorganismos, incluindo raros patógenos 11,48,51. Até à data apenas algumas comparações diretas estão disponíveis entre as MMIs utilizados neste estudo e sua concorrente 19,33. De acordo com Daek et al., Ambos os sistemas fornecem uma elevada taxa de precisão semelhante a identificação, mas os MMIs utilizados neste estudo parece ser mais fiável na identificação de espécies 19. genes distintos Do mesmo modo, técnicas de biologia molecular endereçamento bem conservados mas também ( <em&gt; por exemplo, 16S rDNA ou rpoB) permitir a identificação das espécies clara 3,22,61. Entre estes, o 16S ADNr é o gene de manutenção mais amplamente utilizado devido à sua presença em todas as bactérias 34. Sua função permanece inalterada e, finalmente, com cerca de 1.500 pb, é longo o suficiente para ser adequado para bio-informática 14,34. Muitos pesquisadores consideram análise do gene 16S rRNA como o &quot;padrão-ouro&quot; para a identificação bacteriana 21. Isto é devido ao facto de alguns laboratórios utilizam técnicas de hibridação DNA-DNA até à data para a identificação de bactérias raros ou novos 14,34. Além disso, mais e mais bases de dados estão disponíveis, que podem ser utilizados para análise do gene 16S rRNA 50. No entanto, tem que ser tomado em conta que os sistemas de detecção à base de ADNr 16S tem uma sensibilidade limitada em comparação com protocolos de PCR convencionais. Além disso, a abordagem molecular é sofisticado, consumindo tempo e requer pessoal altamente treinado, bem comodedicados instalações laboratoriais e é, portanto, não é facilmente implementado em diagnósticos de rotina 55. Além disso, tem sido demonstrado que a combinação de, pelo menos, dois métodos diferentes para a identificação de bactérias conduz a identificação da estirpe de elevada precisão. A combinação de MALDI-TOF MS e sequenciação de 16S ADNr permite a identificação de um grande número de diferentes espécies bacterianas com alta precisão. Recentemente, a combinação de análise genética MALDI-TOF MS e 16S rRNA foi apresentada para a identificação de bactérias estudar questões epidemiológicas e agentes patogénicos raros 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, água de grau HPLC, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemanha</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>85600</td><td>Homogeneizador oscilante</td></tr><tr><td>Esferas de vidro de 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Kit de núcleo de PCR Taq (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&agudo;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Alemanha&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Primer reverso RTU4 (5&agudo;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&agudo;)</td><td>biomers.net, Ulm, Alemanha&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>-&nbsp;</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Tubo de reação 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de reação 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburgo,</td><td></td> <td>Alemanha-Microondas</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na><2-sal desidratado; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 a 1.000 pb</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Bélgica</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemanha</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemanha</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Alemanha-Solução</td><td></td></tr> <tr><td>de brometo de etídio 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td> <td>Alemanha-Sistema</td> <td>de documentação em gel&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reações)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Reino Unido</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer (10x) com EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamida (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>-</td><td>Sequenciador</td></tr><tr><td>MicroAmp placa de reação óptica de 96 poços com código de barras</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético, base de placa 96 poços</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético, retentor de placa 96 poços</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético, bem septos de placas</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético, Polímero POP-7, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analisador Genético, 4-Capillary Array, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise de Sequenciamento 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha</td> <td>-</td> <td>Nosso mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Alemanha-Software de</td> <td>controle de dispositivos</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Alemanha-Software de</td> <td>análise</td></tr><tr><td>&alfa;-ciano-4-ácido hidroxicinâmico, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de Calibração de Peptídeos II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 alvo de aço polido</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha</td><td>Parte nº 1836007&nbsp;</td><td>Sistema automatizado de preparação de amostras</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Nosso aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Sistema Automatizado de Microbiologia</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; aureus&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&trade;)</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Padrões LGC, Molsheim, França</td><td></td><td>Controle positivo para PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rrna e maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Há um certo número de agentes patogénicos bacterianos raras e, por conseguinte, suficientemente descritas, que são relatados para causar infecções graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Na maioria dos casos, apenas alguns dados, em sua maioria publicados como relatos de casos, estão disponíveis que investigar o papel desses agentes patogênicos que um agente infeccioso. Por conseguinte, a fim de clarificar o carácter patogénico dos referidos microorganismos, é necessário levar a cabo estudos epidemiológicos os quais incluem um grande número dessas bactérias. Os métodos utilizados em tal estudo de vigilância tem que seguir os seguintes critérios: a identificação das estirpes tem que ser precisos de acordo com a nomenclatura válida, devem ser fácil de manusear (robustez), econômico em diagnósticos de rotina e eles têm para gerar comparáveis resultados entre diferentes laboratórios. De um modo geral, existem três estratégias para a identificação de estirpes bacterianas num local de rotina: 1) identificação fenotípica caracterizar o Biochemical e metabólicas propriedades das bactérias, 2) técnicas moleculares como a sequenciação do gene 16S rRNA e 3) espectrometria de massa como uma abordagem baseada em romance proteoma. Uma vez que a espectrometria de massa e abordagens moleculares são as ferramentas mais promissores para a identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas, são descritos estes dois métodos. Avanços, limitações e potenciais problemas ao utilizar estas técnicas são discutidas.

MALDI-TOF MS é um método rápido e barato para diagnósticos de rotina microbiológicos romance,. Identificação de espécies bacterianas por MALDI-TOF MS produz espectros composta principalmente de proteínas ribossomais, mas também outras &quot;proteínas muito conservadas com funções casa de manutenção afetados o menos possível e por condições ambientais&quot; 17 banco de dados .A deste MMIs contém um grande conjunto de espectros de referência e até mesmo bactérias, que raramente ...

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

O objetivo geral deste protocolo de espectrometria de massas MALDI-TOF é melhorar a tipagem de patógenos raros por meio de um procedimento rápido e com baixo custo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da microbiologia diagnóstica, permitindo a identificação rápida de patógenos bacterianos raros. Hoje, queremos falar sobre odoratimimus e bactérias do gênero Myroides.Para demonstrar o método e discutir a interpretação dos resultados. Geralmente, indivíduos novos neste método podem achar difícil, já que a transferência de bactérias, a aplicação da cobertura com métricas e a interpretação dos resultados exigem habilidades técnicas e conhecimento especializado em microbiologia. Tivemos inicialmente a ideia de utilizar a espectrometria de massas MALDI-TOF para triagem de bactérias raras quando atendemos um paciente em nosso hospital com infecção no pé diabético causada por Myroides odoratimus.Inicie este protocolo com a extração de DNA bacteriano, PCR do DNA ribossomal 16S e sequenciamento Sanger conforme descrito no protocolo textual. Utilize um palito de dente de madeira para transferir uma única colônia bacteriana para um poço de uma placa-alvo de aço de 96 poços. Adicione uma gota de um microlitro de ácido fórmico 70% sobre o organismo previamente seco ao ar na placa de aço, e deixe secar por aproximadamente dois a três minutos.Cubra o ponto com um microlitro de solução matriz contendo 50 mg/ml de CHCA em um solvente orgânico composto por 50% de acetonitrila, 2,5% de ácido trifluoroacético e 47,5% de água. Deixe o esfregaço e a matriz aplicada secar ao ar por cerca de cinco minutos em uma câmara de exaustão. Para introduzir as amostras, ventile a porta de carregamento da amostra no espectrômetro de massas pressionando o botão in/out do instrumento.Abra a porta de carregamento e insira a placa-alvo do MALDI-TOF MS com a mancha bacteriana seca mais a matriz. Feche a porta e faça a evacuação novamente. Observe o vácuo e, quando atingir 4,5 milhões de milibar, inicie a medição.Abra o software de análise MMIS e clique no menu Arquivo. Selecione Nova Classificação e uma nova janela chamada Assistente de Classificação em Tempo Real MALDI Biotyper deverá abrir. Digite o nome do projeto no campo Nome do Projeto e clique em Novo; na nova caixa de diálogo chamada Novo Projeto, verifique o nome do projeto e prossiga clicando no botão OK.No Assistente de Classificação em Tempo Real do MALDI Biotyper, observe a janela de posicionamento do analito. Selecione as posições de destino, clique com o botão direito em qualquer posição selecionada e escolha Adicionar amostras. Na visualização de tabela aberta automaticamente, digite o nome da amostra, o ID da amostra e, opcionalmente, um comentário.Clique no botão "Próximo" para continuar. Em seguida, observe a janela de seleção de métodos do MALDI Biotyper. Selecione "Bruker Taxonomy" nas MSPs das Árvores de Taxonomia e clique em "Próximo" para prosseguir.Em seguida, observe a janela de resumo do projeto. Verifique as entradas inseridas acima para o projeto de classificação atual. Inicie a execução da classificação clicando no botão "Concluir".As medições iniciam automaticamente quando o vácuo apropriado é atingido. Siga a execução da classificação até que a medição seja concluída com sucesso. Após a conclusão da medição, abra o menu "Exibir" e clique em "Resultados" para visualizar a tabela de resultados no Projeto de Classificação em Tempo Real MALDI Biotyper Um.Visualize os resultados da classificação do Bruker-Daltonik MALDI Biotyper como um arquivo html no navegador da web padrão. Imprima e salve os resultados. São mostrados aqui espectros obtidos por MALDI-TOF MS que são medidos e classificados em tempo real.Os espectros recebem um nome de espécie e um valor de pontuação que reflete a qualidade da medição. Pontuações acima de 2.300 representam uma identificação de espécie altamente provável. Uma pontuação entre 2.000 e 2.300 indica uma identificação segura da espécie.Um escore abaixo de 1,700 e 2,000 indica uma identificação provável da espécie. E um escore abaixo de 1,700 é não confiável. A identificação de patógenos bacterianos cultivados em cultura pura em meio sólido leva de dois a três minutos.É importante lembrar que patógenos bacterianos raros só podem ser identificados com espectrometria MALDI-TOF MS quando os instrumentos contêm de forma confiável os espectros apropriados. Caso contrário, é necessário excluí-los mediante a integração de espectros MaSDA de cepas tipificadas de seus isolados caracterizados. No caso em que os resultados do escore não levem a uma identificação inequívoca da cepa, métodos adicionais, como perfil bioquímico ou sequenciamento do rDNA 16S, podem ser aplicados.Embora este método possa fornecer informações sobre a detecção bacteriana, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos, como fungos ou anaeróbios. Além disso, pode-se medir a resistência bacteriana. Não se esqueça de que, ao trabalhar com uma matriz que é uma substância perigosa, é necessário usar luvas, óculos de proteção e trabalhar sob uma capela.Além disso, é absolutamente necessário secar bem a matriz e espalhá-la completamente para evitar respingos na câmara de análise.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Este trabalho detalha procedimentos para identificação rápida de bactérias usando MALDI-TOF MS. Os procedimentos de identificação incluem aquisição de espectro, construção de banco de dados e análises de acompanhamento. Dois métodos de identificação, baseados em coeficiente de similaridade e métodos baseados em biomarcadores, são apresentados.

Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).

subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

IDBac é um pipeline de Bioinformática baseado em espectrometria de massas de código aberto que integra dados de proteínas intactas e espectros metabólito especializados, coletados em material celular raspado de colônias bacterianas. O pipeline permite que os pesquisadores organizem rapidamente centenas a milhares de colônias bacterianas em grupos taxonômicos putativos e diferenciem-se ainda mais com base na produção de metabólito especializado.

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

Este protocolo permite uma avaliação rápida e econômica da composição microbiana em produtos lácteos, combinando culturomics com MALDI-TOF MS. Ele fornece resultados de taxonomia comparáveis ao sequenciamento de rRNA 16S com um tempo de resposta mais curto do que os métodos tradicionais de cultura.

Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI

Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção...

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais...

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Aprenda a identificar patógenos bacterianos raros usando MALDI-TOF MS e sequenciamento do gene 16S rRNA. Este método rápido e econômico melhora o diagnóstico microbiológico clínico de espécies como Myroides odoratimimus.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

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