Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü In Utero C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Bu in vivo hücre manipülasyonunun genel amacı, fare benzeri korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatumun merkezi sinir sistemindeki belirli bölgelerin hücrelerini spesifik olarak değiştirmektir. Bu yöntem, örneğin farklı sinyal kaskadlarının tanımlanması ve hücre farklılaşma seviyesinin belirlenmesi yoluyla beynin gelişimi ve işlevi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak değiştirilmiş farelerin zaman alıcı üretimi olmadan merkezi sinir sistemindeki çeşitli hücre tiplerinin hızlı ve verimli bir şekilde manipüle edilmesine izin

Genel olarak, bu yöntemin gösterilmesi yararlıdır, çünkü bu yönteme yeni olan kişiler genellikle spesifik elektroporasyon için kritik olan doğru elektrot pozisyonunu bulmakta zorlanacaktır. Bu işleme başlamak için, anestezi uygulanmış hamile bir farenin karın boşluğunu bir neşter ile kesin. Açılan karın boşluğunu %0,9 ılık metil alkol tuzlu su çözeltisi ile nemlendirerek kurumasını önleyin.

Ardından, bir çift halka forseps kullanarak rahim boynuzlarını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, bir E14 embriyosunu, delinme bölgesinin üzerinde görünür damar kalmayacak şekilde yerleştirin. Daha iyi bir görselleştirmeye sahip olmak için, transfeksiyon için beyinde istenen alanın açısını ve konumunu bulmak için 5 milimetrelik bir elektrot kullanın.

Kortikal alanın utero elektroporasyonu için, sol lateral ventriküle yavaşça 1.5 ila iki mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ve yerleştirme derinliğinin rahim duvarından ölçülen bir ila iki milimetre olduğundan emin olun. Ardından, keskin bir sınırla mavi-yeşil renk olup olmadığını kontrol edin.

Daha iyi görselleştirme için, transfeksiyon için beyinde istenen yerin açısını ve konumunu bulmak için 5 milimetrelik bir elektrot kullanın. Bundan sonra, üç milimetrelik platin elektrot küreklerinin merkezini kulak primordiasının hemen önüne yerleştirin ve damarların veya plasentanın üzerine yerleştirilmediklerinden emin olun. Ardından, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın.

Hipokampal oluşumun utero elektroporasyonu için, bir E15 embriyosunun sağ lateral ventrikülüne iki mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, üç ila beş milimetre platin elektrot küreklerinin negatif kutbunu kulak primordiumunun hemen önüne ve pozitif kutbu kulak primordiumunun ortasına yerleştirin. Ardından, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın.

Lateral septal çekirdeğin ve striatumun in utero elektroporasyonu için, bir E12 embriyosunun sağ lateral ventrikülüne bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, 5 milimetrelik elektrotları kulak primordia seviyesine yerleştirin. Ardından, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın.

Talamus ve hipotalamusun utero elektroporasyonu için, bir E12 ila E13 embriyosunun lateral ventrikülüne bir ila 1.5 mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, çözeltinin üçüncü ventriküle yayılması için iki ila üç dakika bekleyin. Ardından, 5 veya üç milimetrelik elektrotları kulak primordiasının hemen arkasına yerleştirin.

Bundan sonra, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın. Bu şema, kortikal alanları kesmek için pozitif ve negatif kutuplar için uygun pozisyonları gösterir. Ve bu, hipokampal oluşumları transfekte etmek için pozitif ve negatif kutbun konumlarını gösterir.

Striatum ve lateral septal çekirdeğin transfekte edilmesi için pozitif ve negatif kutbun pozisyonları burada gösterilmektedir. Talamus ve hipotalamusun transfekte edilmesi için elektrotların uygun pozisyonları burada gösterilmiştir. Transfeksiyonun özgüllüğü elektrot boyutuna bağlıdır.

Elektrot küreğinin boyutunun arttırılması, transfeksiyonun özgüllüğünü azaltır. Bu özellikle genç embriyonik aşamalarda belirgindir, ancak geç embriyonik aşamalarda da görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 15 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, embriyoları ve anneleri büyük bir özenle ele almak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, Black 6 farenin merkezi sinir sistemindeki belirli bölgelerin nasıl transfekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.