Name: Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden tam pigmentli, olgun melanositleri nasıl türeteceğinizi. Bu yöntem, melanosit gelişimini ve ilgili hastalıkları anlamak için büyük ölçekli hücre üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Joanna M. Nicolay Vakfı melanom araştırmacılar için bir burs ile ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü F31 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca NYSTEM ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı) hibe yoluyla destek verdi.

NOT: Burada özetlenen melanosit protokolü ilk Mika ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. 1. Kültür Orta hazırlanması, Kaplamalı Züccaciye ve hPSCs Bakım <ol><li> orta Hazırlık Not: saklayın fazla 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C&#39;de tüm orta. Sterilizasyon için tüm orta Filtresi. <ol><li> DMEM /% 10 FBS hazırlayın. 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 mi Pen / Strep ve 5 ml L-glutamin karıştırın. Sterilizasyon Filtre. </li><li> hESC orta hazırlayın. 800 mL DMEM / F12, 200 mi KSR, 5 ml L-glutamin, 10 mL MEM minimum temel amino asitler çözeltisi, β-merkaptoetanol 1 ml ve 5 ml pen / strep karıştırın. 10 ng / ml FGF-2 ilave süzüldükten sonra. </li><li> KSR-farklılaştırma ortamı hazırlayın: 820 mi Nakavt DMEM, 150 mi KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 mL MEM minimum temel amino asitler çözeltisi ve 1 mi β-merkaptoetanol karıştırın. Sterilizasyon Filtre. </li><li> N2-farklılaşma ortamı hazırlayın. 12 g DMEM / F12 tozu i çözülürn 980 ml ​​dH 2 O 1.55 g glikoz, 2 g sodyum bikarbonat ve 100 mg apo insan transferin ekleyin. 2 mi DH 2 O 25 mg insan insülininin ve 40 ul 1 N NaOH karıştırın; çözülmüş bir kez, orta karışımı ekleyin. 100 ul putresin dihidroklorür, 60 ul selenit, 100 ul progesteron ekleyin. Filtreleme önce dH 2 O ile 1 litreye son hacim kazandırın. </li><li> Tam melanosit ortamı hazırlayın. % 50 Neurobasal orta,% 30 düşük glukoz DMEM ve% 20 MCDB201 birleştirin. Bu ekleme:% 0.8 ITS + 250 nM L-glutamin, 100 uM Askorbik Asit (L-AA), 50 ng / ml, kolera toksini, 50 ng / ml SCF, 0.05 uM Deksametason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . % 2 B27 eki, 25 ng / ml BMP4, 3 uM CHIR99021, 500 uM cAMP: steril filtre sonra kalan reaktifleri ekleyin. </li></ol></li><li> Kültür Yemekleri Kaplama <ol><li> Böyle Matrigel olarak jelatinimsi proteini kullanarak kaplama yürütmek. 1 ml bölüme açılması, tablet ve dondurma Matrigel üzerine tekrarlanan donma çözülme c önlemek içinycles. Çözülme ve 19 ml DMEM / F12 ile 1 ml dondurulmuş kısım yeniden askıya. 10 cm&#39;lik çanak üzerine plaka 5 ml. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile bulaşıkları inkübe edin. hemen hücreleri kaplama önce jelatinimsi protein aspire ve DMEM / F12 ile yıkayın. </li><li> Poli-L ornıtın hidrobromid / fare Laminin-I / fibronektin (PO / Lam / FN) kullanılarak kaplama yapınız. Içeren PBS ile kaplayın çanağı 15 ug / ml poli-L ornıtın hidrobromid. nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. solüsyonu aspire ve PBS 1 ug / ml fare laminin I ve 2 ug / ml fibronektin içeren kaplamadan önce üç kez PBS ile plakaları yıkayın. nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de yemekler O / N inkübe edin. <ol><li> Önceki hücreleri kaplama için, çözüm aspire ve plakalar doku kültürü kaputu kapaksız iyice kurumasını bekleyin. Plakalar yaklaşık 10-15 dakika kurumasını bekleyin. Not: kristal yapıları gözle yüzeyinde görünür olduğunda yemekleri kuru ve hücre kaplama için hazır. parseles PBS sürece sıvı buharlaşır yok gibi, iki hafta boyunca inkübatör LAM / FN içeren tutulabilir. Plakalar, birkaç saat boyunca oda sıcaklığında kurutuldu tutulabilir. </li></ol></li></ol></li><li> hPSCs bakımı Not: hPSCs hESC ortamı içinde% 0.1 jelatin ve mitotik pasifleştirilmiş fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) tutulur. Hücreler her 6-8 günde bölünmüş olmalıdır. <ol><li> Kat 5 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 0.1 jelatin ile 10 cm&#39;lik bir tabak. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde hızla dondurulmuş MEFS çözülme. </li><li> jelatin aspire ve hücreleri plaka. DMEM /% 10 FBS içinde ~ 50,000 hücre / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta Plaka MEF&#39;ler. önceki hPSCs ekleyerek 37 ° CO / N de MEFS kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Hazırlanan MEF plakadan DMEM /% 10 FBS aspire PBS ile plaka yıkayın ve hPSCs 10 ml hESC orta ekleyin. Geçiş 1 &#39;in bir oranda hPSCs: Ön pasaj için yoğunluğuna bağlı olarak 5/10. Not: hPSCs çözülmüş ya da tek hücre olarak pasajlanmağa yapılıyorsa, destekilk geçiş kadar 10 uM Y-27632 dihidroklorid (Rocki) ile mana tamamlayıcı. </li><li> ml 10 taze hESC-orta günlük hücreleri besleyin. </li><li> Bir farklılaşma farklılaşmış hücrelerin düzensiz sınırları, ya da şeffaf merkezleri 28 içeren görünen herhangi bir pluripotent koloniler kaldırmak başlamadan önce. Mekanik çıkarmak ve bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu altında bir pipet ile düzensiz koloniler aspire. </li></ol></li></ol> Farklılaşma için hPSCs 2. Kaplama Not: farklılaşma durumları 10 cm&#39;lik kaplar için tarif edilmiştir. <ol><li> Adım 1.3.1 de açıklandığı gibi farklılaşma başlamadan önce 10 cm Matrigel yemekler hazırlamak. </li><li> Bir farklılaşması için kaplama hPSCs geçişi için hazır bir yoğunlukta (~% 80 konfluent), hESC orta aspire PBS ile yıkayın ve hücrelere% 0.05 tripsin-EDTA 3 ml ekleyin de hPSCs bir plaka ile başladığınızda. </li><li> Şiddetle çanak horizontall sallamakMEFS tek hücre olarak kaldırın kadar y 2 dakika süreyle mikroskop altında görüntülenmesi sırasında. hPSC kolonileri kolonilerin olarak ekli kalmalıdır. </li><li> MEFS kaldırdı sonra Tripsin aspire ama hPSCs koloniler ayırmadan önce. </li><li> Ekle plaka 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC orta 10 ml ve koloniler üzerinde yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri ayırmak. </li><li> Adım 2.1 hazırlanan 10 cm çanak Matrigel çözüm aspire ve kümeleri kaldırmak için DMEM / F12 ile yıkayın. Matrigel plakasına 2: 1 oranında en hPSCs Plate. 10ml kadar 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC orta ekleyin. 37 ° CO / N inkübe edin. Not: Bu kaplama / cm2 yaklaşık 100,000 hücre sonuçlanmalıdır. </li></ol> Sinir Farklılaşma 3. İndüksiyon Not: hPSCs% 80 konfluent olduğunda, farklılaşma (gün 0) başlatılmalıdır. Hücreler HESC-ortamı ile günlük olarak beslenebilirfarklılaşma başlayan dek 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren. <ol><li> Gün 0 ve gün 1 üzerinde, 100 nM LDN193189 ve 10 uM SB431542 içeren KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir. </li><li> 2. günde, 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542, 3 uM CHIR99021 ihtiva KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir. </li><li> 3. günde, 10 uM SB431542, 3 uM CHIR99021 ihtiva KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir. </li><li> gün 4 ve 5, besleme 15% 75 KSR-farklılaştırma ortamının ml 3 uM CHIR99021 ihtiva eden% 25 N2 farklılaşma ortamı ile hücreler üzerinde. Not: yüzen hücreleri açısından hücre ölümünün büyük miktarda görmek için paniğe etmeyin. Bu, normal ve beklenen bir şeydir. </li><li> gün 6 ve 7, besleme 15 ila 50%, KSR-farklılaştırma ortamının ml ve her ikisi de 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 ihtiva eden% 50 N2 farklılaşma ortamı ile hücreler üzerinde. </li><li> günlerde 89 beslemesi 20% 25 KSR-farklılaştırma ortamının ml ve her ikisi de 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 ihtiva eden% 75 N2 farklılaşma ortamı ile hücreleri. </li><li> 11. günde hücrelerin yeniden kaplama için 1.2.2 de belirtildiği gibi gün 9 ve 10 PO / Lam / FN yemekler hazırlamak. </li><li> 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 içeren N2-farklılaştırma ortamının 20 ml gün 10 besleme hücreleri üzerinde. </li></ol> NC Şartname damlacıklar 4. şarjı <ol><li> gün 11 soluklu Lam üzerinde / tamamen hazırlanmış PO / LAM / FN plakaları ve kuru FN. </li><li> Gün 11 hücrelerinden orta çıkarın PBS ile yıkayın ve 10 cm çanak başına Accutase olarak 4 ml hücre dekolmanı çözüm ekleyin. 37 ° C&#39;de 25 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> çanak Tam Melanosit orta 5 ml ekleyin ve tüm hücreleri plaka kaldırdı kadar bir 10 ml pipet ile elle yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri tekrar süspansiyon. 15 ml&#39;lik bir tüpe süspansiyon aktarın. </li><li> SpinAşağı 200 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücre ve tam melanosit ortamı içinde ml başına 2 x 10 6 hücre tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre veya eşdeğer tekniğine tripan mavisi dışlama kullanarak hücreleri saymak. </li><li> kurutulmuş PO / Lam / FN 10 cm yemekleri üzerine (onları dokunmadan) birbirlerine yakın plaka 10 ul damlacıkları. plaka yeterince kurutulmuş olmuşsa, damlacıklar iyi kenarları tanımlanmış ve çalıştırmak gerekirdi. Not: Bu genişleme için çanak içinde oda korurken, hücrelerin şarjı zaman önemli olan hücreler, bir yüksek yoğunluklu yerel bir ortam oluşturur. </li><li> daha sonra yavaşça (ekli hücreleri bozmamaya) Tüm melanosit ortamı 10 ml damlacıklar hücre yapışmasına izin vermek için 10-20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. inkübatör çanak taşıyın. </li></ol> 5. Melanosit atalarıdır Genişleyen <ol><li> her 2 ila 3 gün tam Melanocyte ortamı ile beslemeye devam edin. Not: Pigmentasyon w görünür olmasını başlamalıdırİlk hafta sonunda hücrelerin kümeleri ithin ve ikinci hafta çok netleşecektir. Bu tür erken küçük, karanlık kümeleri ayırt etmek bir kağıda gibi beyaz bir arka plan üzerinde plaka görüntüleyin. Tüm plaka (Şekil 2B bakınız) eşit pigmente kadar Hücreler, zamanla giderek daha pigmente olur. </li><li> ~ 1 oranında haftada bir Geçiş hücreleri: 6 (damlacıklar olarak kaplama, bu aşamada artık gerekli değildir). hücreleri ayırmak ve Tam melanosit ortam içinde yeniden kaplama önce, düz Neurobasal ortamı ile iki kez yıkanması Accutase kullanın. PO / LAM / FN plakalar üzerinde hücreleri korumak. Not: Tam Melanosit orta korunması ve hESC ve iPSC türetilmiş melanositler genişletilmesi için en uygun olduğunu bulduk. Bununla birlikte, hücreler ticari olarak temin edilebilen M254 ortamı içinde kısa bir süre kültürlenebilir, ancak basitleştirilmiş ortam boyama ve plaka kaldırma hücre riskini arttırır. </li></ol>

<ol><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li>
<li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat methods. 7, 25-27 (2010).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2FGlutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Diamond+Blackfan+Anemia+in+Vivo+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Blood. 124, (2014).</li>
<li>Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammed+Cells+for+Disease+Modeling+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine.</a> Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> Embo J. 33, 409-417 (2014).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest+and+the+opportunities+of+life+on+the+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge.</a> Dev biol. 275, 1-11 (2004).</li>
<li>White, R. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+in+development%2C+regeneration%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Melanocytes in development, regeneration, and cancer.</a> Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phox2b+function+in+the+enteric+nervous+system+is+conserved+in+zebrafish+and+is+sox10-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+develop%22%5BJournal%5D)">Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent.</a> Mech develop. 122, 659-669 (2005).</li>
<li>Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+proteins+in+melanocyte+development+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigm+cell+melanoma+r%22%5BJournal%5D)">Sox proteins in melanocyte development and melanoma.</a> Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).</li>
<li>Herbarth, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Sry-related+Sox10+gene+in+Dominant+megacolon%2C+a+mouse+model+for+human+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease.</a> PNAS. 95, 5161-5165 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat genetics. 18, 60-64 (1998).</li>
<li>Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+3+induces+the+reversion+of+melanocytes+to+glia+through+a+neural+crest-derived+glial-melanocytic+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor.</a> PNAS. 97, 7882-7887 (2000).</li>
<li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126, 3757-3767 (1999).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127, 5379-5389 (2000).</li>
<li>Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MITF%3A+master+regulator+of+melanocyte+development+and+melanoma+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+mol+med%22%5BJournal%5D)">MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene.</a> Trends mol med. 12, 406-414 (2006).</li>
<li>Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-KIT+signaling+depends+on+microphthalmia-associated+transcription+factor+for+effects+on+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation.</a> PloS one. 6, e24064(2011).</li>
<li>Grichnik, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+expression+reveals+a+population+of+precursor+melanocytes+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+invest+dermatol%22%5BJournal%5D)">KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin.</a> J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J cell sci. 123, 853-860 (2010).</li>
<li>Nishimura, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+role+of+the+niche+in+melanocyte+stem-cell+fate+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination.</a> Nature. 416, 854-860 (2002).</li>
<li>Zur Nieden, N. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZur+Nieden%2C+NI+%22Embryonic+stem+cell+therapy+for+osteo-degenerative+diseases+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-content+screening+for+novel+pigmentation+regulators+using+a+keratinocyte%2Fmelanocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+dermatol%22%5BJournal%5D)">high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system.</a> Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek çatışan çıkarları yok yok.

hPSCs gelen melanosit başarılı farklılaşması için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. İlk ve en önemlisi, her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için gereklidir. Buna ek olarak, pluripotent tam farklılaşmamış hPSCs ile başlamak için önemlidir; Başlangıç ​​nüfus farklılaşmış hücreleri içeriyorsa verimi kaçınılmaz kirletici melanosit yönelik edilemez ve hatta daha düzgün ayırt hücreleri bozabilir olarak düşecek. Hücreler pluripotent kök hücre bakım için köklü kurallara uymak i...

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) hastalığı modelleme, ilaç tarama ve hücre replasman tedavileri 1-6 için ölçeklenebilir bir şekilde normal farklılaşma taklit etmek bir platform sağlar. Özellikle ilgi çekici, hPSCs izole etmek zor veya hasta numunelerinin kıt nadir / geçici hücre tipleri çalışmak için yollar açmak. Ayrıca, uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) benzersiz mekanizmaları 1,2,7-11 çözülmeye hasta belirli bir şekilde gelişmesini ve hastalık modelleme incelemek için araştırmacılar sağlar. HPSCs gelen melanosit farklılaşması için önce yayınlanan bir protokolün farklılaşmalar 6 haftaya kadar gerekmektedir ve L-Wnt3a hücreleri 12 kıvamlandırılmış ortamı ile kültür hücreleri içerir. Protokol ilk Mika ve arkadaşları tarafından sunulan. Ve tarif burada üç hafta içinde pigmentli hücreler üretir ve belirsizlik ve koşullandırılmış ortam ile ilişkili tutarsızlıkları ortadan kaldırır. melanosit arnöral, omurgalılar özgü hücrelerin göç nüfusu türetilen e. nöral krest gastrulasyon sırasında tanımlanan ve nöral ve nöral olmayan ektoderm arasında sınırındaki nöral plaka kenarında hücre popülasyonu temsil etmektedir. Nörülasyon sırasında, sinir dokusu nöral tüp 13,14 sonuçlanan dorsal orta hat yakınsama sinir kıvrımlar oluşturmak için bir nöral plaka gelişir. nöral krest hücreleri Notokordun karşısında, nöral tüpün çatı plakası ortaya ve farklılaşmış hücrelerin çeşitli bir nüfusa yol vermek için uzağa göç önce mezenkimal geçiş bir epitel uğrar. tepe hücreleri kaderi embriyo gövde ekseni boyunca tavan plakasının anatomik bölgeye kısmen tanımlanır. Nöral tepe hücresi türevleri, hem mezoderm karakteristik soy (düz kas hücreleri, osteoblastlar, adipositler, kondrositler) ve ektoderm hücrelerini içerir (melanosit Schwann Cıarşın, nöronlar) 14. Sinir tepe kök hücreler transkripsiyon faktörü SOX10 upregülasyon yapabileceğini ve p75 ve HNK1 antikorlar ile sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir. Melanosit bir melanoblast aşamadan geçmesi ve 6,21 MITF melanosit gelişim ana düzenleyicisidir ve bir transkripsiyon faktörü melanosit gelişiminin çok kontrol sorumludur KIT ve MITF (mikroftalmi ilişkili transkripsiyon faktörü) upregüle olmaya mahkum nöral krest hücreleri 22- 24. İnsan Melanoblastlardan onlar saç şişkinliği veya Epidermisin keratinositlerin çevrili olgun, pigmentli melanosit için öncüleri olarak hizmet vermeye (pigmentasyon birimleri oluşturan) ya ikamet epidermisin bazal tabakasındaki göç. pigmentli melanosit içine Melanoblastlardan farklılaşması ve olgunlaşması saç ampul kolonizasyon ve ifade melanin üretimi yolunun (TYRP1, TYR, OKA2&#39;den ve ile birlikte oluşurPMEL) 25,26. Hastaların insan melanosit ve Melanoblastlardan Ayırma, pahalı zor ve miktar sınırlayıcı olduğunu. Bu protokol hücre sıralama olmadan iyi tanımlanmış, hızlı, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve ucuz bir yöntem melanosit veya melanosit öncüleri içine hPSCs (isteğe bağlı veya embriyonik) ayırt etmek araştırmacılar sağlar. protokol pigmentasyon bozukluğu olan hastaların iPSCs ayırt zaman hastalığa özgü kusurları tespit etmek, daha önce kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo insan transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (B27 Takviyesi)</td><td>İnvitrojen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R& D Sistemleri</td><td>4423 6</td><td>mM</td></tr><tr><td>Kolera toksini</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg / ml</td></tr><tr><td>cAMP (siklikAMP)</td> <td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100</td></tr><tr><td>mM Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 & mu; M</td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Gibco-Life Teknolojileri</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı: Besin Karışımı F-12</td><td>Gibco-Life</td> Technologies <td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 tozu</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (Endotelin-3, insan)</td> <td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 & mu; M</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>356008</td><td>200 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>jelatin (Mg/Ca'sız PBS)</td> <td>evde</td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>İnsan insülini</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS + Evrensel Kültür Takviyesi Premiks&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (Nakavt Serum Replasmanı)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Gibco-Life Teknolojileri</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco-Life Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Düşük glikoz DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>DMEM/F12 MCDB201 Orta Sigma'da 1:20 çözün</td></tr><tr><td></td><td></td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM minimum esansiyel amino asit çözeltisi</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>Fare embriyonik fibroblastları (7 milyon hücre/flakon)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Fare Laminin-I</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U / ml</td></tr><tr><td>Poli-L Ominin hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg / ml / nbsp;</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>100 ml içinde 0.032 g %100 etanol</td></tr><tr><td>Putresin dihidroklorür</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (Rekombinant insan FGF bazik)</td><td>R& D Sistemleri</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (Kök Hücre Faktörü, Rekombinant İnsan)&nbsp;</td><td>Peprotech A.Ş.</td><td>300-07</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>TYRP1 (G-17) Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>TYRP2 Antikoru</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.05)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Tocris-R& D Sistemleri</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), hem normal hem de hastalık koşulları altında insan gelişimini in vitro olarak incelemek için bir platformu temsil eder. Araştırmacılar, gelişim sırasında görülen sinyalleri özetlemek için kültür koşullarını manipüle ederek hPSC'lerin farklılaşmasını ilgilenilen hücre tipine yönlendirebilirler. Böyle bir hücre tipi, cildi UV ışınlarına karşı korumaktan sorumlu, nöral krest (NC) kökenli pigment üreten bir hücre olan melanosittir. Bu protokol, NC'yi tamamen pigmentli melanositlere daha da farklılaştırmak için hPSC'lerden şu anda mevcut olan in vitro Nöral Krest farklılaşma protokolünün bir uzantısını sunar. Melanosit öncüleri, çift SMAD inhibisyon koşulları altında WNT, BMP ve EDN3 sinyalleme aktivatörlerine zamanlanmış maruz kalma yoluyla Neural Crest protokolünden zenginleştirilebilir. Elde edilen melanosit öncüleri daha sonra saflaştırılır ve seçici bir ortamda kültür yoluyla tamamen pigmentli melanositlere olgunlaştırılır. Elde edilen melanositler tamamen pigmentlidir ve olgun melanositlerin karakteristik proteinleri için uygun şekilde boyanır.

Bu protokol, bir in vitro besleyici içermeyen, düşük maliyetli, ve tekrarlanabilir bir şekilde hPSCs tamamen pigmentli olgun melanosit türetilmesi için bir yöntem temin etmektedir. HPSC türetilmiş melanosit için daha önce oluşturulan Fang ve diğerleri. Protokolünün aksine, ana hatları çizilen protokol, koşullu ortam gerektirir ve zaman gereksinimi azaltır etmez. Fang ve diğerleri. Protokol WNT3A üreten fare hücre hattı kıvamlandırılmış ortam kullanılab...

Bu çalışma, bir nöral ile insan pluripotent kök hücreleri pigmentli olgun melanosit üretilmesi ve besleyici içermeyen, 25 günlük protokolünü kullanarak ara madde aşama melanoblast için bir in vitro farklılaşma protokolü tarif eder.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Bu protokolün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini tam pigmentli, olgun melanositlere farklılaştırmaktır. Bu yöntem, melanosit gelişimi sırasındaki temel faktörlerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Ayrıca bu protokol, hastalık gelişimi sırasında ters giden faktörlerin tespit edilmesini sağlamanın yanı sıra, önemli ilaçların taranmasına ve ilaç keşif süreçlerine olanak tanıyacaktır.Bu protokolün temel avantajı, çok sayıda tam pigmente melanosit üretmemize olanak tanımasıdır. Hastalardan melanosit izolasyonu genellikle nispeten az sayıda hücre ile sonuçlanırken. Jelatinöz proteini alikotlara ayırıp dondurduktan sonra, 1 ml'lik bir alikotu çözün ve 19 ml DMEM f12 içinde resüspande edin.Ardından, bu karışımdan beş mililitreyi tek bir 10 santimetrelik doku kültürü plağına ekleyin. Bu şekilde birkaç plak hazırladıktan sonra, plakları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, bir kültür plağına mililitre başına 15 mikrogram PO içeren PBS ekleyerek PO, laminin ve fibronektin ile kaplanmış plakları hazırlamaya başlayın.Ardından plakları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Sonrasında çözeltiyi aspire edin ve kapları üç kez 1X PBS ile yıkayın. 1 µg/mL fare laminin 1 ve 2 µg/mL fibronectin içeren 10 mL PBS ekleyerek kaplama işlemine devam edin.Ardından, kapları daha önce açıklanan şekilde inkübe edin. Başlangıç olarak, 10 santimetrelik bir kaba PBS içinde %0,1 jelatin ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.Bu plak kaplanırken, dondurulmuş fare embriyonik fibroblastlarını (MEF) hızlıca çözdürmek için 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, kaptaki jelatini aspire edin ve MEF'leri, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş DMEM içerisinde santimetrekare başına yaklaşık 50.000 hücre yoğunluğunda ekin. Kabı 37 °C'de gece boyunca inkübe ettikten sonra medyumu aspire edin ve hazırlanan MEF plağını 1X PBS ile yıkayın.Önceden hazırlanmış, hPSC olarak kısaltılan insan pluripotens kök hücreleri içeren 10 mililitre hESC besiyerini 10 santimetrelik bir kaba ekleyin. Hücreleri kap başına 5 milyon hücre yoğunluğunda ektikten sonra, plakları 37 derece Celsius sıcaklıkta ve yüzde beş karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Hücreleri her gün 10 mililitre taze hESC besiyeri ile beslemeye devam edin.Diferansiyasyon işlemine başlamadan önce, plakayı diferansiye olmuş hücreler içeren koloniler, düzensiz kenarlar veya şeffaf merkezler açısından kontrol edin. Laminer akışlı bir kabin içindeki diseksiyon mikroskobu altında, bu tür düzensiz kolonileri bir pipet yardımıyla mekanik olarak uzaklaştırın. Matrigel gibi jelatinöz proteinlerle kaplama yapmak için, proteinleri tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak amacıyla önce bir mililitrelik porsiyonlar halinde bölüştürün ve dondurun.Ardından, dondurulmuş bir mililitrelik bir alikotu çözün ve 19 mililitre DMEM f12 ile yeniden süspande edin. Bu karışımın beş mililitresini 10 santimetrelik bir kaba ekleyerek plaklama işlemini gerçekleştirin ve kapları oda sıcaklığında (RT) bir saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri eklemeden hemen önce jelatinimsi proteini aspire edin ve DMEM F12 ile yıkayın. Bu kap kaplanırken, hPSC'lerin yaklaşık %80 konfluens düzeyinde olduğu bir plak seçin.hESC besiyerini aspire edin. Ardından hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'i uzaklaştırdıktan sonra, plağa üç mililitre %0,05 trypsin-EDTA ekleyin.MEF'lerin tek hücreler halinde ayrılmaya başladıkları mikroskop altında gözlemlenene kadar, kabı iki dakika boyunca yatay olarak kuvvetle çalkalayın. Bu süre zarfında, hPSC kolonilerinin plakaya yapışık kalması beklenir. MEF'ler ayrıldıktan sonra ancak hPSC kolonileri henüz ayrılmadan önce tripsini aspire edin.Ardından, plakaya 10 µM Y-27632 diklorhidrat (bir ROCK inhibitörü) içeren 10 mililitre hESC medyumu ekleyin. Sonrasında, kolonilerin üzerinden pipetleme yaparak hücreleri ayırın. Daha sonra, jelatinöz protein içeren kaba geri döndürün ve çözeltiyi aspire edin.Herhangi bir topaklanmayı gidermek için bu kabı DMEM f12 ile yıkayın. Ardından, hPSC'leri 1'e 2 oranında plaka üzerine ekleyin. Sonrasında plakaya, 10 µM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC medyumundan toplam 10 mL olacak şekilde ekleyin.Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücreleri günlük olarak ROCK inhibitörü takviyeli besiyeri ile besleyin. hPSC'ler %80 konfluenslikle ulaştığında nöral farklılaştırmayı başlatın ve bu zaman noktasını Gün 0 olarak belirleyin.Diferansiyasyonu başlatmak için hücreleri 0. Gün ve 1. Gün'de, 100 nanomolar MP inhibitörü LDN-193189 ve 10 mikromolar activin ve Nodal inhibitörü SB 431542 içeren 10 mililitre KSR diferansiyasyon besiyeri ile besleyin. 2. Gün'de, besiyerini BNP ile activin ve Nodal inhibitörlerinin aynı konsantrasyonlarını ve ek olarak üç mikromolar Wnt Agonisti CHIR99021 içeren besiyeri ile değiştirerek devam edin. Ardından, 3. Gün'de, hücreleri yalnızca 10 mikromolar SB 431542 ve üç mikromolar CHIR99021 ile desteklenmiş KSR diferansiyasyon besiyeri ile besleyin.%75 KSR farklılaşma ortamı ve üç mikromolar Wnt agonisti içeren %25 N2 farklılaşma ortamı karışımı hazırlandıktan sonra, 4. ve 5. günlerde hücrelere bu sıvıdan 15 mililitre verin. Ardından, 6. ve 7. günlerde hücreleri; %50 KSR farklılaşma ortamı ve %50 N2 farklılaşma ortamından oluşan ve ayrıca üç mikromolar CHIR99021, 25 nanogram/mililitre BMP4 ve 100 nanomolar EDN3 ile desteklenmiş 15 mililitre ortam ile besleyin.Ardından, 8. ve 9. günlerde hücreleri, 6. ve 7. günlerde kullanılan faktör konsantrasyonları ile desteklenmiş 20 mililitre %25 KSR diferansiyasyon medyumu ve %75 N2 diferansiyasyon medyumu ile besleyin. 10. günde, hücreleri üç micromolar CHIR99021, 25 nanograms per milliliter BMP4 ve 100 nanomolar EDN3 içeren 20 mililitre N2 diferansiyasyon medyumu ile besleyerek nöral diferansiyasyona devam edin. 11. günde, önceden PO laminin 1 ve fibronektin ile kaplanmış kaplardaki solüsyonu aspire edin.Ardından, plakaları tamamen kurumaları için yaklaşık 10 ila 15 dakika boyunca bir doku kültürü davumbazında açık bırakın. 11. gün hücrelerindeki besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Daha sonra, kaba dört mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 25 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, kaba beş mililitre tam melanosit medyumu ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar manuel olarak pipetle yukarı aşağı çekerek resüspansiyon yapın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Trypan Blue dışlama yöntemi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücreleri mililitrede 2X10⁶ yoğunlukta tam melanosit medyumu içinde resüspande edin.Hücre süspansiyonundan 10 µL'lik damlacıkları kurutulmuş, kaplanmış kapların üzerine damlatın. Damlacıkların birbirine yakın ancak temas etmiyor olduğundan, kenarlarının belirgin olduğundan ve yayılmadığından emin olun. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için damlacıkları oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika bekletin.Ardından, yapışmış hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek, kaba yavaşça 10 milliliters tam melanosit medyumu ekleyin. Daha sonra kabı inkübatöre yerleştirin. Hücreleri her iki ila üç günde bir tam melanosit medyumu ile besleyin.İlk haftanın sonunda hücre kümelerinde pigmentasyon gözlemlemeyi bekleyin. Haftada bir kez, hücreleri daha önce açıklanan şekilde önce hücre ayırma çözeltisi ile ilişkilendirerek pasajlayın. Hücreleri toplayıp santrifüjledikten sonra, sade nörobazal besiyeri ile iki kez yıkayın.Ardından, hücreleri PO, laminin 1 ve fibronektin ile kaplanmış kaplarda, tam melanosit ortamında bir altı oranında yeniden ekleyin. Yaklaşık 30 günlük farklılaşma süresinin sonunda hücreler koyu pigmentli görünecektir; bu durum, yüksek yoğunlukta ekildiklerinde veya pasajlama sırasında çöktürüldüklerinde kolayca gözlemlenebilir.Burada, hücreler yeniden ekilmeden önce, açıklanan diferansiyasyon protokolünün 11. gününe kadar kültüre edilmiş transgenik psox10 GFP insan embriyonik kök hücre hattından alınan hücrelerin aydınlık alan görüntüsü gösterilmektedir. Bu kültürlerde, hücrelerin oluşturduğu koyu renkli belirgin sırtlar görülmektedir. Bu kültürler GFP sinyali açısından değerlendirildiğinde, koyu sırtların sox10 pozitif hücreler açısından zenginleştiği görülmüştür.sox10, nöral krest kök hücreleri tarafından yukarı regüle edilen ve melanoblastlarda korunan bir transkripsiyon faktörü olduğundan, bu sonuçlar bu farklılaştırma yönteminin 11. güne kadar nihayetinde melanositlere dönüşecek hücreleri zenginleştirdiğini göstermektedir. Bunun kanıtı olarak, protokolün 20. gününe gelindiğinde kültürler pigmentsiz, olgunlaşmakta olan ve tamamen olgunlaşmış pigmente melanositler içeriyordu. 25. günde, kültürlerde aynı hücre türleri gözlemlenmiştir.Bu preparatlarda olgunlaşan ve pigmente olmuş melanositlerin varlığı, iki melanin üretim proteini ile boyama yapılarak doğrulanır. Bunlar, hem melanoblastların hem de melanositlerin bir belirteci olan TYRP2 ile yalnızca pigmente olmuş melanositlerde eksprese edilen geç evre melanosit belirteci TYRP1'dir. Uzmanlaşıldığında, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerini 25 gün içinde tamamen pigmente olmuş olgun melanositlere farklılaştırmak için kullanılabilir.Protokol, önce nöral krest evresinden ve ardından melanoblast aşamasından geçerek normal melanosit gelişimi yoluyla ilerler.

feeder-free-derivation-melanocytes-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz...

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Bu makale, Y-27632'nin TIVA ortamına eklenmesinin yetişkin cilt dokularından melanosit lerin verimini önemli ölçüde artırabileceğini bildiriyor.

Y-27632 Yetişkin Cilt Dokularından İnsan Melanositlerin Verimini Zenginleştirir

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden tam pigmentli, olgun melanositleri nasıl türeteceğinizi. Bu yöntem, melanosit gelişimini ve ilgili hastalıkları anlamak için büyük ölçekli hücre üretimi sağlar.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Daha fazla video keşfet