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Chapters
- 00:05Title
- 00:43Synthesis of NNS Sub-libraries for Each Amino Acid Position by Two-step PCR Site-directed Mutagenesis
- 01:53Cloning of NNS Sub-libraries into Selection Vectors
- 03:47Selection of the TEM-1 Whole-Protein Saturation Mutagenesis Library for Antibiotic Resistance
- 05:51High Throughput Sequencing to Determine Fitness Effects of Mutations
- 08:44Results: High Throughput Sequencing from Whole-Protein Saturation Mutagenesis
- 10:16Conclusion
Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.
