Name: Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında mitozu ve kromozom ayrışmasını yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile gözlemleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve kanser araştırmalarında fizyolojik olarak uygun veri toplamayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

pCS2-H2A.F/Z-EGFP ve pCS2-mCherry-CAAX vektörleri için Kristen Kwan'a teşekkür ederiz. Chris Rodesch'e zebra balığında canlı görüntüleme konusunda bize ders verdiği için teşekkür ederiz. UAB'deki konfokal görüntülemeye ve UAB'deki Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisine yardımcı oldukları için Shawn Williams, Erik Malarkey ve Brad Yoder'e teşekkür ederiz. Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi, UAB Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibesi (P30CA013148) ve Romatizmal Hastalık Çekirdek Merkezi (P30 AR048311) tarafından desteklenmektedir. JMP, Ulusal Nörolojik Hastalık ve İnme Enstitüsü (NIH R21 NS092105) tarafından desteklenmektedir ve Amerikan Kanser Derneği (ACS IRG-60-001-53-IRG) ve UAB Kapsamlı Kanser Merkezi'nden (P30CA013148) pilot hibeler almaktadır. S.M.P., Hücre ve Moleküler Biyoloji T32 Eğitim Bursu (5T32GM008111-28) tarafından desteklenmektedir.

1. in vitro transkripsiyon <ol><li> Enzim 31 sindirmek Notl kısıtlama pCS2-H2A.F / Z-EGFP ve / veya pCS2 mCherry-CAAX vektörleri Linearize. Vitro transkripsiyon kitinde bir RNA kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak, her şablonun 5 &#39;başlıklı mRNA ürünleri oluşturur. </li><li> Bir saflaştırma kiti kullanılarak şapkalı mRNA arındırın. üreticinin talimatlarına uyun. RNaz ücretsiz H2O ile Zehir </li><li> bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (OD 260 x seyreltme x 40 ug / ml). </li><li> Her biri H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX RNase içermeyen H2O için ul / 100 ng RNA seyreltin RNA konsantrasyonu çok düşükse, flüoresan azalması veya mevcut olacaktır. Parlak örnekler fototoksisite ve photobleaching kaygıları azalacaktır. Diğer taraftan, çok RNA toksik ve / veya hedef etkilere kapalı yol açabilir. Not: Kalan Mağaza-80 ° C dondurucu içinde saflaştırılmış mRNA. </li></ol> 2. Zebra balığı Islahı, Embriyo Toplama ve mRNA Enjeksiyon 36-38 <ol><li> iki bölgeye tankı ayırmak ve Zebra balığı tesiste kullanılan yetiştiricilik sistemi su ile her üretim tankı doldurmak için bir engel ile üreme tankları birleştirin. </li><li> ıslah gece önce, zamansız ıslah önlemek diğer tarafta bariyer bir tarafında ve iki kadın balık iki erkek balık yerleştirmek için. </li><li> Sonraki gün, buz üzerinde, daha önce hazırlanan mRNA&#39;nın karışımı çözülme. tatlı su sistemi su ile üreme tanklarında su yerine ve engellerin ortadan kaldırılması. bariyerler çekti hemen sonra, 28.5 ° C bir enjeksiyon kalıp sıcak ve mikroenjeksiyon için ekipman kurmak. Not: enjeksiyon kalıpları hakkında bilgi için, Gerlach 36 bakınız. </li><li> Bir çay süzgeci kullanılarak 15 dakika ve E ile temiz 100 x 15 mm Petri kabı içine yumurta durulama - yumurta her 10 topla3 Mavi (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 -5% metilen mavisi). E3 Mavi mantar büyümesini önlemek ve larva balık düzgün gelişimini sağlamak için kullanılır. Çiftleşme ve embriyo koleksiyonu hakkında daha fazla bilgi için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 bakın. </li><li> Yerleştir tek hücreli bir ısıtılmış enjeksiyon kalıp embriyolar düzenleyerek embriyolar (Şekil 1A), istenen miktarda yumurta sarısı içine RNA enjekte edilir. Doğal embriyonik ölüm ve deney için gerekli% 15 daha fazla embriyoların üzerinde embriyonik enjeksiyonları yaparak döllenmemiş embriyolar için hesap. Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon Ek detaylar için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 başvurun. NOT: mRNA İlk kullanımda, önce 5D görüntüleme gerçekleştirmek için (en fazla 5 dpf&#39;e hiçbir brüt gelişimsel kusurlar olarak tanımlanır) floresan ve canlılığı için en uygun dozu belirlemek için bir doz-eğrisi analizi gerçekleştirmek. 150-200 ng / mlembriyoların içine enjekte bu nedenle nihai konsantrasyon için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, genellikle uygun konsantrasyondur. </li><li> Dikkatle değiştirilmiş 9 &quot;cam Pasteur pipeti kullanarak kalıp enjekte embriyolar ayıklayın. Pipet değiştirmek için, bir top kıvamına gelinceye kadar bir Bunsen beki kullanarak sonuna eritin. </li><li> Bir 28.5 ° C inkübatör 100 x 15 mm Petri E3 Mavi çanak ve evde enjekte edilen embriyolar yerleştirin. </li><li> enjeksiyon sonrası altı saat, plakalardan herhangi bir ölü ya da döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve temiz E3 Blue ekleyin. 28.5 ° C&#39;de Ev embriyolar. </li></ol> 3. Hazırlama ve Görüntüleme için canlı balığı Embriyolar gömülmesi (Şekil 1B) <ol><li> İki saat görüntüleme önce, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak GFP enjekte embriyolar ekran. E3 Blue ile yeni bir 100 x 15 mm Petri kabındaki parlak yeşil GFP ifade embriyolar yerleştirin. </li><li> agaroz E3 Blue 100 ml düşük eriyik 1 g eklenerek% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz bir stok solüsyonu kaynatılır. agaroz kullandıktan sonra, alüminyum folyo ile şişesi kapağı. stok solüsyonu bir ay kadar yararlıdır kalır. </li><li> Kısım 17 x 100 mm kültür tüpü içine erimiş agar 3 mi. Kullanıma hazır olana kadar bir 42 ° C su banyosunda kültür tüpü yerleştirerek agaroz sıcak tutun. Zebra balığı embriyolar 36 anestezi için deiyonize edilmiş su içinde 15 mM Tricaine çözeltisi hazırlayın. Not: erken zaman noktalarında görüntüleme isteniyorsa, agar konsantrasyonu% 0,3 39 kadar düşük azaltılabilir. </li><li> 15 mM Tricaine, ekranlı embriyolar, düşük erime agaroz, E3 Mavi ve diseksiyon ışık mikroskobu ile 35 mm cam lamel alt kültür çanak getirin. Dikkatle 5. cımbız ile embriyonun koryon çıkarın. üç embriyo için bunu yapın. </li><li> Ayrı bir kapta dechorionated embriyolar anestezi olmak yerleştirin. lamel taban kabı kapağı genellikle bu amaç için kullanılır. Bir transfer pipeti kullanarak, üç damla (yaklaşık 150 ul)kadar veya embriyolar yeterince anestezi edilmiştir (lamel alt çanak kapağı kullanıyorsanız) 5 ml E3 mavi çanak 15mM Tricaine. % 1 erimiş agaroz tüpe 15 mM Tricaine çözeltisi - (200 ul, yaklaşık 150), ek olarak, 3-4 damla ekleyin. </li><li> kesilmiş pipet 1 cm olan bir P200 pipet kullanarak; Lamel tabanlı çanak anestezi embriyolar transfer. Tricaine çözüm: herhangi bir aşırı E3 Mavi çıkarın. </li><li> Embriyolar yanlışlıkla birbirine yakın kayması etmemelerini sağlamak için ayrı her damla tutarak, embriyolar üzerinde Tricaine çözümü: Düşük erime agaroz 10 ul - Yavaşça 5 ekleyin. Uyarı: Agaroz çok sıcak ise, embriyo zarar verecektir. 42 ° C de iyi bir sıcaklık agar korumak için. </li><li> 21 G 1 ½ iğne kullanarak, yavaşça istenen konuma agaroz embriyo yönlendirin. Time-lapse görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılarak zaman possib olarak lamel yakın ilgi alanları (ROI) bölgesini yönlendirmekle. Not: Genel amaçlar için, kuyruk bölgesi nedeniyle nispeten ince doku (Şekil 1A) için oryantasyon ve netlik kolaylığı sağlar. Bu sarısı ve fin kat çevreleyen epitel tabakası gibi diğer dokuların, 28,29 kullanılabilir. Bu dokular, ancak bu bölgeler yalnızca birkaç hücre tabakaları kalın, büyük netlik sunuyoruz. Bu protokolün amacı için, mümkün olduğunca çok sayıda hücre bölünmesi elde etmek için kuyruk bölgesi görüntü için faydalıdır. </li><li> agar kısmi katılaşması için bir kaç dakika bekleyin. onun katılaşma test etmek için agar küçük bir parça parçalayın iğne kullanın. agar bir parça damla uzağa çekilebilir, bir sonraki adıma geçin. </li><li> düşük erime agar gömülü embriyolar üzerinde bir kubbe oluşturan tüm lamel örtün. Ağar konfokal görüntüleme (Şekil 1A) için çanak geçmeden önce katılaşmaya izin verin. </li><li> Agar katılaşma süreci (yaklaşık 10 dakika sürer) sırasında, 3 ml o hazırlamak(Yaklaşık 250 ul) 15 mM Tricaine beş damla F E3 Blue çözeltisi görüntüleme sırasında gömülü embriyolar üzerinde yerleştirilir. </li></ol> Canlı Zebra balığı Embriyolar 40,41 4. 5D Konfokal Görüntüleme NOT: Diğer konfokal sistemleri kullanarak 5D görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl ilgili ayrıntılar için Ariga 40 ve O&#39;Brien 41 Bkz. Z-aralık, Z-yığının Z-derinlik, zaman aralığı, ve 5D tanımları Şekil 1C bakın. <ol><li> görüntüleme yazılımı açın ve 60X NA 1.4 objektife mikroskop ayarlayın. objektife daldırma yağı sürün ve mikroskop sahnede slayt tutucuya kültür çanak yerleştirin. eksen kontrolörü kullanarak, objektif lens üzerinde ilgi embriyo ortalamak ve kültür çanak karşılamak için yukarı objektif lens getirmek. </li><li> Göz parça simgesine tıklayın ve mikroskop GFP filtre geçin. YG odaklanın. o lamel yakın doku üzerinde olacak OdaklamaEn iyi görüntüleme sonuçları ffer. </li><li> kilidini çıkarın. (Yazılımında önceden belirlenmiş dalga boylarını) GFP ve mCherry kanalları seçmek ve normal seçeneği ortalama çizgisini ayarlayın. </li><li> Kullan &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / A1 Tarama Alanı&quot; A1 Tarama Alanı aracını açmak için komut. </li><li> Taramaya başlamak. Tarama alanı mümkün olduğunca zebrafish kadar dolu, böylece eksen-denetleyici kullanarak, embriyo yerleştirin. lazer gücü, bu noktada uygun olduğu gerek yoktur. Gereksiz photobleaching önlemek için lazer gücünü azaltın. </li><li> ND edinme kontrol panelini açmak için &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / ND edinimi&quot; komutunu kullanın. </li><li> Z-yığın parametrelerini ayarlamak için taramaya başlayın. Hücreler artık görünür olduğu Z-yığın hücreleri odakta olmadığı durumlarda üst sınır ve alt sınırını ayarlayın. görüntüleme alanına genişletebilir büyüme ve hücre hareketi için numune üzerinde 3 mikron alanı için izin verin. Bu pro gösterilen rakamlar Z-yığınıProtokolün embriyo kuyruk 40 mikron Z-derinlik kaplı. </li><li> 2 um Z-aralık adım boyutunu ayarlamak. Ortalama olarak, hücre çapı 10 um; Bu nedenle, 2 um görüntüleme verileri beş aralıkları, her bir hücre için, analiz edilecek üretecektir. NOT: elde edilebilir görüntünün derinliği Z aralığına bağlıdır. Z çözünürlüğü mümkün (büyük Z-derinlik) olarak mitoz geçiren birçok hücreler olarak görüntüye için Z boyutunda genel derinlik kazanmaya kurban. Z derinliği (küçük Z-derinlik) kurban ederken ters ki, doğrudur, adım boyutunu azaltarak, Z çözünürlük, elde edilir. </li><li> Görüntü lazer gücünü, HV ayarlayın ve seviyeleri ofset. Deneyler, bu protokolde gösterilmiştir için aşağıdaki lazer gücü, HV kullanabilir ve GFP kanal için sırasıyla ilgili seviyelerde belirlenen seviyeleri ofset; 5, 120 - - 2 140 ve -11 -9. MCherry kanal için, aşağıdaki lazer gücü, HV kullanın ve sırasıyla seviyeleri, ofset; 3-6, 120-140, ve -3-8. parametreleri ayarlandıktan sonra, numunenin fototoksisite ve photobleaching neden olabilir gereksiz lazer maruz kalmasını önlemek için tarama kapatın. </li><li> 2x hat ortalama simgesini seçin. &quot;Ortalama 4x hattı&quot; büyük ölçüde tarama süresini artırırken &quot;Hayır ortalama&quot; bir grenli bir görüntü oluşturur. 2x hattı Ortalamanın kullanılması görüntü kalitesi ve hızlı tarama süresi sunuyor. </li><li> deney için gerekli olan uygun zaman aralığı ve süreyi seçin. Vahşi tip bölümleri için, 2 saat, iki dakikalık bir zaman aralığı (Şekil 1, 2, 3A ve 3B&#39;de kullanılan) mitotik süresinin belirlenmesi için uygundur. Daha uzun bir süre 30 dakika mili düzeneği kontrol noktasında aktive Bölümler Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi floresan korumak için, dört saat süre ile, beş dakikalık aralıklarla için daha uygundur. </li><li> &quot;Dosyaya Kaydet&quot; kutusunu işaretleyin ve edinsel ediliyor otomatik olarak dosyayı kaydetmek için dosya adı. Tüm pa Çift çeknütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel doğru ayarlanmış ve &quot;run start&quot; vuruluyor. </li><li> iktisap tamamlandıktan sonra, üç boyutlu biçimde dosyasını görüntülemek ses eşik simgesine tıklayın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre kültürü sistemleri üzerinden avantajlıdır el...

Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir. Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır). Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z&#39;nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur. Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vektörleri</td><td>K. Kwan'dan</td><td></td> Hediye <td>İlgilenilen plazmid için</td></tr><tr><td>NotI-HF kısıtlama enzimi</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Plazmidin kısıtlama sindirimi için</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1340</td><td>in vitro transkripsiyonu için</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>mRNA'yı saflaştırmak için</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Embriyoları barındırmak için</td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon kalıbı</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>Mikroenjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Embriyoları gömmek için</td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Embriyoları uyuşturmak için</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>içinde çözülmüş Embriyo suyu (E3 Mavi) için, UltraPure H2O içinde çözülmüş</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür Dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506 içinde çözülmüş</td><td>Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Metilen Mavisi Hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>içinde çözülür Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm kültür tüpü</td> içinde çözülür <td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Erimiş agar için</td></tr><tr><td>35 mm cam lamel alt kültür kabı&nbsp;</td><td>MatTek A.Ş</td><td>. P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>0, 20 mm cam, embriyoları gömmek için</td></tr><tr><td>#5 cımbız</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Embriyoların dekoryonasyonu için</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge iğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Embriyoları agarda konumlandırmak için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Embriyoları taramak ve gömmek için, herhangi bir diseksiyon kapsamı işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>Hızlandırılmış görüntüleme için</td></tr><tr><td>Konfokal yazılım</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Görüntü alma ve işleme için</td></tr></tbody></table>

canlı zebra balığı embriyo mitotik bölümü ve dinamikleri gözlemleme

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.

Şekil 2 AB vahşi tip Zebra balığı kuyruk geniş bir alan görünümünü kullanarak birçok hücre bölünmeleri gözlemlemek yeteneği gösterir. Yedi mitotik hücreler 14 dakika süre (Film 1) &#39;de görüntülü. İki saat zaman Ders kapsamında, 40 mitotik olayların ele geçirildi. Ortalama olarak, 50 bölünen hücreleri AB gözlendi ve aur B a / a embriyolar (Şekil 2B) 30 bölünen hücreler. Görüntülü hücre sayısı, (Şeki...

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenecek olan floresan işaretli kromatin ve hücre zarı proteinlerini kullanarak, canlı bir zebra balığı embriyosundaki mitoz sırasında kromozom ayrılmasının doğruluğunu izlemektir. Bu yöntem, mitoz alanındaki temel soruların, örneğin mitotik kusurların canlı bir omurgalı organismada nasıl gelişimsel kusurlara veya tümör oluşumuna yol açtığının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fizyolojik olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak tanıyan canlı bir omurgalı organismada mitozu gözlemliyor olmamızdır.Yetişkin zebra balıkları çiftleştirilip yumurtalar H2A. F/Z-EGFP ve/veya pCS2 mCherry-CAAX RNA ile enjekte edildikten sonra, görüntülemeden yaklaşık iki saat önce, GFP-pozitif embriyoları belirlemek için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Parlak yeşil, GFP eksprese eden embriyoları, E3 mavi ortam içeren yeni, 100 x 15 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.E3 blue içerisinde %1 düşük erime noktalı agarozdan oluşan stok çözeltiyi kaynatın. Eriyen agarozdan üç mililitreyi 17 by 100 milimetrelik bir kültür tüpüne paylaştırın. Kullanıma hazır olana kadar kültür tüpünü 42-degree Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda tutarak agarozu sıcak tutun.15-millimolar trikayn, taranmış embriyolar, düşük erime noktalı agaroz, E3 blue, 35-milimetrelik lamel tabanlı kültür kabı ve bir diseksiyon ışık mikroskobu hazırlayın. Ardından, beş numara cımbız kullanarak üç embriyonun korionlarını dikkatlice çıkarın ve embriyoları anestezi uygulanmak üzere ayrı bir kaba yerleştirin. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, embriyoların ve beş mililitre ortamın bulunduğu kaba üç damla 15-millimolar trikayn ekleyin.%1'lik eritilmiş agaroz tüpüne üç ila dört damla 15-millimolar trikayn çözeltisi ekleyin. Embriyolar yeterince anestezi edildiğinde, ucundan bir santimetresi kesilmiş bir P200 Pipetman kullanarak, anestezi edilen embriyoları lameli tabanlı kaba aktarın. Fazla E3 mavi trikayn çözeltisini uzaklaştırın.Embriyoların birbirine yaklaşmasını önlemek için, her damlayı ayrı tutarak üzerlerine yavaşça 5 ila 10 µL düşük erime noktalı agaroz-trikayn çözeltisi ekleyin. Ardından, 21 gauge bir buçukluk bir iğne kullanarak, embriyoları agaroz içinde nazikçe istenen konuma getirin; eğer ters mikroskop kullanılıyorsa, ilgi duyulan bölgeyi mümkün olduğunca lamel camına yakın şekilde konumlandırın. Oluşabilecek kaymalar nedeniyle, embriyoların gerekli pozisyonda kaldığından emin olmak için her bir embriyoya tekrar dönmek gerekebilir.Agar katılaşırken ideal konum elde edilene kadar bu işlem birden fazla kez tekrarlanmalıdır. Birkaç dakika sonra, donup donmadığını test etmek için bir iğne yardımıyla küçük bir agaroz parçasını ayırın. Parça damladan ayrılabildiğinde, gömülü embriyoların üzerine bir kubbe oluşturmak ve tüm lameli kaplamak için ek düşük erime noktalı agaroz kullanın.Agaroz katılaşırken, görüntüleme sırasında gömülü embriyoların üzerine yerleştirilmek üzere, beş damla 15-millimolar trikayn içeren üç mililitre E3 blue besiyeri hazırlayın. Canlı zebra balığı embriyolarının 5D konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımını açın ve mikroskobu 60X sayısal açıklığı 1.4 olan bir lensle ayarlayın. Lense imersiyon yağı uygulayın ve kültür kabını mikroskop tablasındaki lam tutucuya yerleştirin.Eksen kontrol cihazını kullanarak, incelenecek embriyoyu objektif merceğin üzerine ortalayın ve merceği kültür kabına değecek şekilde yükseltin. Agar içine gömülmüş embriyoların üzerine E3 blue ve trikayn çözeltisi dökün. Ardından, embriyoları okülerden görüntülemek için Göz Portu simgesine tıklayın.Eye Port seçimini devre dışı bırakın ve A1 Tarama Alanı aracını açmak için Görünüm, Edinme Kontrolleri, A1 Tarama Alanı seçeneklerini belirleyin. GFP kanalını seçin, taramayı yeniden başlatın ve lamel yakınındaki bir ilgi bölgesine odaklanın. Taramayı durdurun, GFP ve mCherry kanallarını seçin ve çizgi ortalama seçeneğini normal olarak ayarlayın.Şimdi, A1 ND Acquisition aracını açmak için Görünüm, Edinme Kontrolleri, ND Edinme seçeneklerini belirleyin. Taramayı başlatın. Ardından, eksen denetleyicisini kullanarak, tarama alanının mümkün olduğunca fazla zebra balığı ile dolacağı şekilde embriyoları konumlandırın.Z-yığını üst sınırını, hücrelerin odak dışında kaldığı noktaya, numunenin üzerinde büyüme ve hücre hareketi için fazladan üç mikrometre boşluk bırakacak şekilde ayarlayın. Ardından, alt sınırı hücrelerin artık görünmediği noktaya ayarlayın ve Z-aralığı adım boyutunu iki mikrometre olarak belirleyin. Burada gösterilen deneyler için görüntüleme lazer gücünü, HV veya kazancı (gain) ve ofset seviyelerini sırasıyla aşağıda listelendiği gibi ayarlayın.Parametreler ayarlandıktan sonra, örneğin fototoksisiteye ve fotobeyazlamaya neden olabilecek gereksiz lazer maruziyetini önlemek için taramayı kapatın. Şimdi, en iyi görüntü kalitesini ve en hızlı tarama süresini sağlayan 2X hat ortalama simgesini seçin. Deney için gerekli olan uygun zaman aralığını ve süre boyunca devam edecek zaman süresini belirleyin.Yaban tip hücre bölünmeleri için, mitotik süreyi belirlemek amacıyla iki saatlik bir süre boyunca iki dakikalık zaman aralıkları yeterlidir. Burada gösterildiği üzere, iğ iplikleri montaj kontrol noktasını otuz dakikadan daha uzun süre aktive eden bölünmeler, floresan özelliğini korumak için dört saat boyunca dört ila beş dakikalık aralıklara daha uygundur. Dosyayı veri toplama sırasında otomatik olarak kaydetmek için Dosyaya Kaydet kutusunu işaretleyin ve dosyayı adlandırın.Son olarak, tüm parametrelerin doğru şekilde ayarlandığından emin olun ve Run Now düğmesine basın. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, dosyayı üç boyutlu formatta görüntülemek için Volume Threshold simgesine tıklayın. Bu şekil, AB yabani tip bir zebra balığı kuyruğunun geniş bir görüş alanı kullanılarak birçok hücre bölünmesinin gözlemlenebildiğini göstermektedir.Hücre bölünmeleri yıldızlarla belirtilmiştir. İlgili video burada gösterilmiştir. Ortalama olarak, AB'de 50 bölünen hücre ve aurora B mutantında 30 bölünen hücre gözlemlenmiştir.Aurora B mutant embriyosunda görüntülenen mitotik hücre sayısındaki azalmayı hesaba katmak için, mitotik hücrelerin görüntülenen toplam hücre sayısına oranı hesaplanmış olup, bu durum aurora B mutant embriyolarında mitoza giren hücre sayısının daha az olmadığını, aksine görüntülenen toplam hücre sayısının daha düşük olduğunu göstermiştir. Mitotik süreyi nicelendirmek için, bir hücre bölünmesinin gerçekleştiği zaman aralıklarının sayısı, her bir Z-stack arasındaki zaman aralığı ile çarpılmıştır. Bu grafikte görüldüğü üzere, ortalama AB wild-type bölünme süresi 25 dakika, aurora B mutantu için ise 58 dakikadır.Yabanıl tip embriyolarda görüldüğü gibi, her bir mitotik evre ayırt edilebilmektedir. Ancak, aurora B mutant embriyosunda, mitotik durma ve başarısız sitokinezle sonuçlanan, bunun sonucunda binükleat bir hücre ve ardından mikroçekirdek oluşumuyla seyreden mitotik kusurlar gözlemlenmektedir; bu durum, söz konusu mutantta ölçülen artmış bölünme süresini desteklemektedir. Uzmanlaşıldığında, embriyoların taranmasından konfokal mikroskop parametrelerinin ayarlanmasına kadar bu teknik bir saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken; ilgi alanı, süre, zaman aralığı ve Z-derinliği ile ilgili olan mevcut deneyin bağlamını hatırlamak önemlidir. Bu, verimliliği maksimize etmeye yardımcı olacağı gibi fotobeyazlama ve fototoksisiteyi de önleyecektir. Bu prosedürün ardından, gözlemlenen mitotik defektlerin nedenine dair ek soruları yanıtlamak için kromozom yayılımları gibi diğer yöntemler uygulanabilir veya mitotik ilerleme, süre veya hücre kaderi üzerindeki etkileri belirlemek için ilaç tedavisi kullanılabilir.Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyoloji alanındaki araştırmacıların zebra balığı kullanarak gelişimsel biyoloji ve kanser biyolojisi bağlamında mitozu incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra; zebra balığı embriyolarının nasıl gömüleceği, mitozun canlı görüntülemesinin nasıl yapılacağı ve mitotik frekansın, sürenin ve hücre kaderinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Güçlü lazerlerle ve floresan ışıkla çalışmanın gözlere zarar verebileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken lazerlerle doğrudan göz temasından kaçınmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında mitozu ve kromozom ayrışmasını yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile gözlemleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve kanser araştırmalarında fizyolojik olarak uygun veri toplamayı sağlar.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Daha fazla video keşfet