Name: 準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ脂質立方相を用いた膜タンパク質微結晶の調製法。シリアルフェムト秒結晶学により、室温で最小限の試料消費と放射線損傷を抑えつつ、膜タンパク質の構造決定を実現する技術です。

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この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていました私たちは、原稿準備の支援のためのA.ウォーカーに感謝R01 GM108635とU54 GM094618、メイヨークリニック-ASU共同シードグラント賞、NSF STC賞1231306.を付与します。

1.フィルタリングソリューションと脂質注：このプロトコルで使用される全ての試薬およびツールは、LCPインジェクタを詰まらせることができ、試料中の粒子状汚染物質の導入を避けるために、可能な限りきれいにする必要があります。 <ol><li> 5μmのスピンダウンフィルタを介してすべての沈殿剤溶液を、溶融脂質をフィルタリングします。きれいなシリンジ徹底的に乾燥させるために圧縮空気を適用します。必要に応じて、サンプル調製手順の間ダスト粒子または繊維をトラップ防止するために、携帯用のクリーンルームフードを使用しています。 </li></ol> LCPでのMPの2の再構成注：結晶化のための最良のLCPホスト脂質の選択は、対象MPに依存し、典型的にはホスト脂質スクリーニング結晶化試験14中に識別されます。モノアシルグリセロール（MAGのは）、LCP結晶15に使用される脂質の最も一般的なクラスを表します。プロトコルは、以下のように9.9 MAG（モノオレイン）を使用してに基づいていますこの日付から16 メソ結晶化のための最も成功した脂質であることから、脂質をホストします。 9.9 MAGは、それらの相挙動におけるアカウントの違いを考慮した後に他のLCPホスト脂質または脂質混合物によって置換することができます。例えば、GPCRの場合には、モノオレインは、典型的には、受容体の安定化のためにコレステロールがドープされています。 （w / w）の9.9 MAG 1：ホスト脂質としてコレステロールの混合物をここでは、9を使用します。 <ol><li>混合物は、以前に13のように、2つのシリンジ（＃1及び＃2）を使用して、適切なLCPホスト脂質とカプラーと、界面活性剤ミセル溶液中で精製されるMPをターゲット。 </li><li>簡単に言えば、MP溶液で溶融脂質とシリンジ＃2と負荷シリンジ＃1。ちょうど対応するLCPホスト脂質の最大の水和容量を下回るレベルに対応した脂質、水性MP溶液との間の比率を使用して、 例えば 、3：9.9 MAG 2 V / V脂質/ MP液、1：1 V / V他のほとんどの短鎖のMAGのための脂質/ MP溶液（7.9 MAG9.7 MAG など ）。 </li><li>シリンジカプラを介してシリンジを接続し、試料が均一かつ透明になるまで、シリンジの間で前後に混合物を移動するためにプランジャーを押すことにより、物質を混合開始します。 LCP-SFXによって完全なデータセットを収集するためにLCPサンプルの約50μLを準備します。最終的な試料体積は、典型的には、サンプルの統合と脂質滴定（第5節）後（〜100μLまで）約2の係数で増加します。 </li></ol> 3.注射器で結晶化を設定します<ol><li>透明で均質なLCPが形成された後、シリンジ＃2にサンプル全体を移動します。シリンジ＃2に接続されたカプラを維持しながら、シリンジ＃1を切り離します。 </li><li>別の100μlのクリーンシリンジ（注射器＃3）とそれへの沈殿剤溶液の吸引約70μlに取り外し可能な針（ゲージ26S）を接続します。 Fをトリガする沈殿剤溶液の組成高密度微結晶のormationは、各ターゲットのMPのためのユニークであり、これらのプロトコルに進む前に決定されるべきです。ここで、A 2A受容体の微結晶のシャワー（40 mMのチオシアン酸ナトリウム、100mMのクエン酸ナトリウムpHは5、26から28パーセントPEG400）が得られる最適化された沈殿剤溶液組成物を使用しています。 </li><li>シリンジ内のテフロンフェラルを維持しながらシリンジ＃3から針を外します。 </li><li>テフロンフェルールは、両方の注射器の代わりに、正しくあることを確認して、カプラを介してシリンジ＃2、＃3を接続します。慎重に所定の位置にしっかりとカプラーをネジ止めします。 </li><li>オリエント底部にシリンジ＃2と垂直に結合された注射器とLCP文字列がシリンジ＃3のプランジャに触れるまでゆっくりと着実にシリンジ＃3にシリンジ＃2からのタンパク質を含んだLCPのサンプルを注入します。注入されたLCPのボリュームは、シリンジ＃3（〜7マイクロリットル）で、約1/10の初期沈殿剤の体積のに達するだろう。両方のシリの目盛読み取りにより音量を確認してくださいNGES（両方のプランジャが約7マイクロリットルによって移動する必要があります）。 </li><li>外しシリンジ＃2。カプラーは、現在のみ沈殿剤溶液中に浸漬したサンプルを含んでいる注射＃3に接続されています。 </li><li>完全にプランジャーシリンジインターフェイス、カプラの開口端と、針ナットを含むシリンジ＃3を、密封するためにパラフィルムを使用してください。この工程の間の不完全なシールは、沈殿条件を変化させることができ、試料を脱水します。 </li><li>繰り返しは、LCPのサンプル（各シリンジあたりLCPの〜7マイクロリットル）の〜50μlの合計を利用し6追加の注射器に（9＃4-＃）の結晶化を設定するには3.3から3.7を繰り返します。 </li><li>ストアは、1または2つのファイバー・フリーの洗浄組織サンプル脱水から保護するために、水で予め浸漬してプラスチック製の密閉可能な袋で注射器を密封されました。結晶成長中に20℃のインキュベーター内でバッグや店舗の注射器を封印。 </li></ol> 4.クリスタル検出<ol><li> LC画像にインキュベーターからシリンジを取り外し直接注射器内部のP個のサンプル（＃3-＃9）は、クロス偏光を持つ実体顕微鏡下でのすべての12-24時間。 LCPフィラメントから均一なグローなどの小さい結晶サイズの場合には、密集した光沢のある粒子のような結晶を特定したり。 </li><li>バッグに密封された注射器を戻し、将来の使用のために20℃で保存します。 </li></ol> 7.9 MAGと5.サンプルの統合と滴定注：ここで説明した脂質滴定ステップは、2つの目的があります：a）は、過剰な沈殿剤液を吸収すると、b）XFELビームへの注入時に凍結脂質を防ぐために。 9.9 MAGからなるLCP試料をデータ収集のために真空チャンバ内に注入されると、集中的な蒸発は、層状結晶相へのサンプルの一部を変換し、平衡相転移温度（〜18℃）以下の温度まで試料を冷却することができます（LC）。ビームが当たっLC相、これらのパッチは、強烈な粉末DIFFRを生成しますこのようなコーネル- SLACピクセルアレイ検出器（CSPAD）などの敏感な検出器6を 、損傷する可能性がアクションリング。このような混合物は、低い相転移温度を有するような短鎖脂質（9.7 MAGまたはMAG 7.9）と9.9 MAGサンプルの滴定は、この問題を軽減します。ここでは、7.9 MAGで9.9 MAGで構成されるLCPの滴定を記述する。短鎖のMAG（9.7 MAG、7.9 MAG など）を結晶化するために使用されるシリアル結晶学データは、周囲圧力で収集された場合、ステップ5.11において滴定が依然として必要とされているが、ときにそれがために使用さ元のLCPホスト脂質を用いて行うことができます結晶。 <ol><li>データ収集の開始前に約1時間、20℃のインキュベーターからサンプルでシリンジを取り外します。 </li><li>結晶化条件の似た結晶外観との類似性に基づいて、試料の統合のための2-4シリンジを選択します。 </li><li>厳選されたシリンジからシールパラフィルムを除去します。 </li><li>削除します注射器のカプラーとは、最初に選択された注射器にきれいなリムーバブルニードル（ゲージ26S）を添付します。ゆっくり、ゆっくりとマイクロチューブに針を通して沈殿剤を絞り出すために前方プランジャーを押してください。このステップでは、プランジャーに高い圧力を適用することは、サンプルの部分的または完全な損失につながる、沈殿剤溶液と一緒に結晶を含んだLCPの一部を取り出す可能性があるため、このステップでは注意してください。 </li><li>沈殿剤のほとんどが削除され、LCPが針入り口に蓄積してきたときに、プランジャを停止します。 </li><li>他の選択された注射器と繰り返しステップ5.4から5.5まで。 </li><li>結果として得られるLCPのサンプルを統合するには、クリーンカプラを介して一緒に2つのシリンジを接続します。 </li><li>別の注射器の1から試料全体を転送するために、1つのシリンジにプランジャーを押し下げます。 </li><li>空のシリンジを外します。 </li><li>繰り返し、二から四前から結晶を含んだLCP材料のすべてを統合するために5.7から5.9の手順1シリンジに注射器を-selected。できるだけ多くの沈殿剤を削除します。 </li><li>空のシリンジに7.9 MAGまたは元の短鎖のMAGホスト脂質の〜5μlを添加します。シリンジカプラを介して連結サンプルでシリンジにこの注射器を接続し、代わりにシリンジプランジャーを押し下げることによって混合します。すべての残液が吸収され、均一で透明なLCPが形成されるまで繰り返します。滴定後のLCPの最終量は、過剰な沈殿剤およびその組成物の体積に応じて20から35μlに変化させることができます。 </li><li> 1シリンジ内に全体の混合LCPのサンプルを移動し、空のシリンジを外します。 </li></ol>微結晶の6キャラクタリゼーション<ol><li>連結サンプルでシリンジにLCP-インジェクタローディング針（ポイントスタイル3、ゲージ22、長さが1インチ）を取り付けます。 </li><li>慎重にガラススライド上にLCPサンプルの〜1μLを取り出し、ガラスカバースリップでそれをカバーしています。静かに押してくださいサンドイッチにカバースリップサンプル。 </li><li>明視野照明とクロス偏光板を使用して、可能な限り最高の倍率（典型的には100倍）でステレオ顕微鏡下でLCPのサンプルの画像を撮影します。可能な場合は、サンプル中のタンパク質微結晶の存在を確認するために、UV蛍光顕微鏡及び（キラル結晶の二次非線形イメージング）SONICC 17イメージャーを使用して追加の画像を撮影します。 </li><li>結晶の大きさと密度10を推定します。データ収集実験のための理想的な結晶密度は、結晶の大きさ、X線ビームの直径及びLCPストリームの直径に依存し、約10〜40％の結晶ヒット率をもたらすはずです。 </li></ol>結晶密度の7調整注：ステップ6.4で見つかった結晶密度が高すぎる場合は、複数の結晶ヒットの大きな割合で、その結果、結晶が最適化するために、以下の手順以下に希釈する必要がありますデータ収集のためのサンプル。結晶密度は、全ての調製したサンプルで効率的なデータ収集のために低すぎるとLCPでMP結晶を濃縮するための信頼できる方法がないため、その後の結晶成長条件は、再最適化されるべきです。 <ol><li>ニートLCPの必要量を調製することは希釈する必要がある結晶を元のサンプルのLCP組成（同じ脂質および沈殿剤）を模倣することによって希釈するために使用されます。 </li><li> 1シリンジにすべてきちんとLCPを移動します。空のシリンジを外したが接続カプラーを残します。 </li><li>微結晶とLCPのサンプルが含まれている注射器から針を外します。カプラを介してきちんとしたLCPを含むシリンジにサンプルシリンジを接続します。 </li><li>均質性が達成されるまで、カプラを介して前後にそれを押して注射器の内容を混ぜます。 </li><li>繰り返しセクション6は、調整された試料中の微結晶の密度を再評価します。 </li></ol> 8. LCPインジェクタのロードAND LCP-SFXデータ収集<ol><li>サンプルでシリンジからカプラーを外し、注射器に1「ローディング針を取り付けます。 </li><li> LCPインジェクタのリザーバーにサンプルの20から40μLを移します。 </li><li>試料室18内にLCPインジェクタを挿入する注入器を起動し、流量を調整し、LCP-SFXデータを収集します。 </li></ol> LCP 9.設立可溶性のタンパク質結晶注：このようなLCPのような粘性の高いメディアを、使用して、可溶性タンパク質の結晶の配信のために1が劇的シリアル結晶学実験でタンパク質の消費量を減少させることを可能にします。これらの手順では、LCP中の可溶性タンパク質の結晶を組み込む方法について説明します。結晶は、任意の技術によって得られた結晶懸濁液の形態で一緒に連結し、必要に応じて濾過することができます。 <ol><li>約百分の10から40までの結晶ヒット率を確保するために、懸濁液中に結晶密度を調整します。 </li><li> Tエスト7.9 MAG、9.7 MAGまたは1使用してLCPと沈殿剤溶液の互換​​性：7.9 MAGの1混合物とホスト脂質として9.9 MAGを。 </li><li>均質なLCPが形成されるまでシリンジミキサーを使用して、ホスト脂質の〜25μlの結晶懸濁液の〜25μlのを混ぜます。 </li><li>第6節で説明したように結晶サイズや密度を評価するLCPインジェクタにサンプルをロードし、セクション8に記載されているようにデータを収集します。 </li></ol>

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</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

ここに記載されているプロトコルは、LCPインジェクタと標準LCP-SFX実験用サンプル調製手順の概要を提供します。微結晶の大きさに応じて、;私たちの経験に基づいて、完全なデータセットを収集するために必要な最終的な微結晶を含んだLCPサンプルの合計量は、典型的には50〜100μlの（最初のタンパク質を含んだLCPサンプルの25-50μlの表1）であります、品質と密度。各100μlの気密性のガラスシリンジが適切とLCPへの沈殿剤溶液の均一な拡散を確実にするために、完全に拡張した文字列の形でLCPの約7マイクロリットルを収容することができますので、注射器内の少なくとも四から七サンプルがのために準備する必要があります各LCP-SFX実験。 試料は直径毛細管の狭い20-50ミクロンを通して押し出されるので、試料中の任意の外来粒状物質を回避するために重要です。時折LCPに導入することができる微塵および繊維サンプルまたは沈殿剤溶液は、インジェクタの毛細管を閉塞し、実験中のダウンタイムを増加させることができます。したがって、試料を調製する前に、5μmの細孔フィルターを通して脂質及び全ての溶液をフィルタリングすることが重要です。任意選択的に、クリーンルームや携帯クリーンルームフードは、試料調製のために使用することができます。 これらのプロトコルは、MPの結晶化のためのホスト脂質として9.9 MAG（モノオレイン）を使用してに基づいています。これらは、しかし、9.9 MAGに限定されるものではなく、容易に考慮脂質相の挙動の差を取った後、他のLCPホスト脂質または脂質混合物に適合させることができます。 LCPで結晶化MPの構造のほとんどは9.9 MAGは、これまでに15の最も成功した代表であると、のMAGのいずれかを用いて得られました。 SFXのために9.9 MAGを使用することの主な欠点は、データ収集を真空中で行われる場合、多くの場合、発生する18°C未満に冷却する層状結晶相への転移です。 titratiこのプロトコルのセクション5で説明7.9 MAGとでこの問題に良い解決策を提供します。我々の経験では、結晶は、任意の悪影響なしに、このような滴定に耐えます。しかし、7.9 MAGまたは他の短鎖MAGの添加が望ましくない場合、滴定9.9 MAGを行うことができます。この場合には、真空中への注入中LCPの流動を安定化させるガスは、より安定したサンプル流を有する犠牲にして、ほとんどのサンプル中の結晶脂質相の形成を防止することができる、窒素にヘリウムから切り替えられるべきです。 これは現代のXFELとシンクロトロン光源のシリアル結晶学データ収集に適した幅広い結晶流量を調整することができるので、LCPのゲル様のコンシステンシーは、結晶のキャリア媒体として使用するための大きな利点を有します。振幅Cの命令によって結晶消費の劇的な減少XFELパルス繰り返し率の結果と結晶流量と一致します液体注入にompared。 LCPはなく、可溶性タンパク質21の結晶のためだけでなく、その中で増殖させたMP結晶の送達に適した担体媒体です。シリアル結晶学の実験を行うためのツールおよび試薬の兵器庫を拡張し、24 -いくつかの代替粘性結晶キャリア媒体は、最近22を導入されています。また、結晶の送達媒体としてLCPシリアル結晶は、少なくともよく回折する結晶24,25のために、従来のシンクロトロン源で実証されています。将来桁違いによるX線強度を高めるシンクロトロンソースのアップグレードと同様に、検出器技術の改善は、シリアル結晶構造決意のためのさらに多くのアクセスと魅力的な方法になります。 LCP-SFXはMP構造決意のためにその効力を実証してきました。ここで、L（などのGPCRまたは高分子複合体など）に挑戦生物系のためのARGE、回折品質の結晶が成長することが困難である、LCP-SFXは、原子分解能構造を解決するために魅力的な場合だけではなく、実行可能な選択肢を提供してもよいです。そのすべての利点、 すなわち 、MPの結晶と結晶の送達のためのマトリックスとしてLCPを使用して、低タンパク質消費、放射線損傷の不在、室温データの収集、時間分解研究26,27と無結晶収穫要件の可能性、LCP-とSFXは、構造生物学の将来に重要な役割を果たすべきです。

X線結晶構造は、膜タンパク質（MPS）の原子分解能構造を解決するためのこれまでで最も成功した技術です。また、脂質立方相（LCP）として知られている脂質中間相からの結晶化、またはメソ結晶化においては 、このようなGタンパク質共役受容体のような挑戦的な目標（GPCRの高分解能構造の決意を有効にしているMP結晶学の主要な開発の1つを表し、 ）1。 LCPのツールと技術における最近の進歩は、世界2周りの構造生物学者の大規模なコミュニティにこの技術が利用可能になっています。しかし、多くの場合、LCPで形成MP結晶は、高解像度で十分な信号が3を得ることができる前に、サンプルは深刻な放射線損傷や劣化に苦しむさらには最先端のマイクロフォーカスシンクロトロンビームラインを使用するには小さすぎます。 結晶学的データ収集への新たなアプローチ第1のX線自由電子レーザー（XFEL）の試運転で有効になっていました。この方法は、最初に、理論的に4を導入した後、リニアックコヒーレント光源（LCLS）3、ハードXFELsで世界の先駆者で、生物学的サンプルに実験的に確認、 &quot;破壊の前に回折」の原理に基づいています。 XFELは、タンパク質の原子は、放射線損傷に応答して移動することができる前に、自然のままの結晶から回折フェムト秒の持続時間の数十内の高輝度X線パルスを発生します。最初の実験では、微結晶が連続的に薬液注入装置5によって製造された水性ストリーム中のXFELビームとの交点に供給しました。この実験は、シリアルフェムト秒結晶学（SFX）として知られています。 SFXのための液体注入器を使用する際の主な欠点は、結果的に、完全なデータセットを収集するために精製されたタンパク質のミリグラム数十〜数百を必要とし、その高流速、です。 EMPことで有意に減少したタンパク質で、9 -ゲル状のLCPのサンプルを処理することができる特殊なインジェクター（LCPのmicroextrusionインジェクタ）6を loying、我々が正常にLCPマトリックス中で成長させ、いくつかの異なるヒトGPCRの微結晶を配信し、その高解像度の構造体6を得ましたデータセットあたり0.3ミリグラムの下に消費。インジェクタは最大20、40または100結晶を含んだLCPμlのサンプルが（10,000までの高圧力を加えることによって押し出されるを通して狭いキャピラリー（直径10-50μm）を保持することができる貯水池で構成されていHPLC（高速液体クロマトグラフィー）ポンプからの液体によって駆動圧力増幅段を備えた油圧プランジャーからPSI）。毛細管ノズルを出るLCPの流れは不活性ガス（典型的には、ヘリウムまたは窒素）の並流によって安定化されます。 ここでは、サンプルを調製し、特徴付けるために必要な手順を視覚的にデモを提供しますLCP-SFX実験のため。その他の詳細は公表されたプロトコル10で見つけることができます。例として、SFXアプローチを用いてX線データ収集のためのLCPは、このタンパク質の結晶をアデノシンA 2A受容体11を使用し、作成します。我々のプロトコルは、XFELとシンクロトロン源のシリアル結晶学によってデータ収集のためのLCPをストリーミングすることが可能な任意のインジェクターと互換性があるが、説明のために、我々は、文献に記載されたLCPインジェクタを使用します。 LCPで高密度の微結晶を生成6.最適化された沈殿条件は、このプロトコルに進む前に、ハイスループット結晶化スクリーニング12,13によって識別されるべきです。このプロトコルのための典型的なフローチャートを図1に示されています。

<table><tbody><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Hosting lipid for the protein to be crystallized</td></tr><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>結晶化するタンパク質の脂質をホスト</td></tr>します<tr><td>LCP宿主脂質モノパルミトレイン(9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>結晶化するタンパク質のホスティング脂質</td></tr><tr><td>LCP宿主脂質7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>サンプル注入中の層状結晶相(Lc)形成を避けるための遅延のためのホスティング脂質</td></tr><tr><td>精製タンパク質溶液を20-50 mg / ml</td><td></td><td></td>に濃縮 <td>標的タンパク質</td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ムフィッシャー科学的な</td><td>C606-1</td><td>脂質を溶かすために使用</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>注射器を洗うのに使用</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956;l ハミルトン ニードルなしのガスタイトシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7656-01</td><td>LCP調製用</td></tr><tr><td>8シリンジカプラー</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>LCP調製用</td></tr><tr><td>LCPインジェクターローディングニードル</td><td>ハミルトン</td><td>7804-01 ポイントスタイル3、長さ1インチ</td><td>LCPディスペンシングおよびインジェクターローディング用</td></tr><tr><td>取り外し可能なニードル</td><td>ハミルトン</td><td>7768-01</td><td>沈殿物溶液の除去用</td></tr><tr><td>パラフィルムM</td><td>パラフィルム</td><td>PM992</td><td>シリンジシーリングに使用</td></tr><tr><td>糸くずの出ないレンズクリーニングティッシュ</td><td>フィッシャー</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルターチューブ、ウルトラフリーMC、0.5ml、デュラポア5 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>沈殿物溶液と脂質のろ過に使用</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、1インチ x 3インチ&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>細い先端を持つ2つのウォッシュボトル。1つはミリQまたは蒸留水で満たされ、もう1つはメタノール</td><td>VWR</td><td>89094-640</td>で満たされますこれらは<td>、シリンジ、ニードル、カプラーの洗浄に使用されます。&nbsp;最初にメタノールを使用し、次に水を使用します。</td></tr><tr><td>グローブ</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>ブロー乾燥用シリンジ、ニードル、フェルール、カプラー</td></tr><tr><td>安全メガネ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加圧エア缶</td><td>オフィスデポ(ダストオフ)</td><td>527494</td><td>シリンジ洗浄用</td></tr><tr><td>デジタル温度コントローラー付きドライブブロックヒーター</td><td>フィッシャー</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>脂質の融解に使用</td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離</td><td>機フィッシャー05-413-340</td><td></td>スピン<td>ダウンソリューション</td></tr><tr><td>クリーンルームミニ-HEPAフィルター付き12インチポータブル正圧フード</td><td>セントリーエアシステムズ株式会社</td><td>SS-112-PCR</td><td>クリーニングサンプル調製</td></tr><tr><td>直線偏光子と回転アナライザーを装備したステレオズーム顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>SMZ1500</td><td>結晶密度チェック</td></tr><tr><td>UV顕微鏡</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>オプション、結晶イメージング用</td></tr><tr><td>SHGイメージャー</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>オプション、結晶イメージング用</td></tr></tbody></table>

準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

膜タンパク質（MPS）は、細胞膜と一次薬物標的の必須成分です。合理的薬物設計は、典型的には、結晶学により得られた正確な構造情報、に依存します。しかし、MPは結晶化が困難です。 MP構造決意の最近の進歩は、一般的によく回折得脂質立方相（LCP）の結晶化方法、が、シンクロトロン光源での伝統的な結晶学的データ収集中に放射線損傷に苦しむことが多い小さな結晶の開発から大きな恩恵を受けています。新世代のX線自由電子レーザー（XFEL）の開発非常に明るいフェムト秒パルスを生成源がないか、または無視できる放射線損傷と微結晶から室温データの収集を可能にしました。シリアルフェムト秒結晶（LCP-SFX）でLCP技術を組み合わせることで我々の最近の努力は、wは、いくつかのヒトGタンパク質共役型受容体の高分解能構造をもたらしていますHICH構造決意のために悪名高い困難な標的を表します。 LCP-SFX技術では、LCPは、結晶学的データ収集のためのXFELビームでインジェクタストリームの交差点までのMP微結晶の両方の成長とデリバリーのためのマトリックスとして採用されています。それだけサブ10μmの結晶が利用可能である場合LCP-SFXは、実質的に、または、回折分解能を向上させることができることが実証された室温での小さな結晶の使用は、このような欠陥の蓄積のようなより大きなcryocooled結晶に関連する種々の問題を克服することができる場合、高モザイク性および極低温冷却アーティファクト。 X線源と検出器技術の将来の進歩はXFELsで、だけでなく、よりアクセス可能なシンクロトロンビームラインではない唯一の実装のためのシリアル結晶は非常に魅力的で実用的にする必要があります。ここでは、シリアル結晶学実験のためのLCPでの準備、特性評価および微結晶の配信のために詳細な視覚的なプロトコルを提示します。これらのプロトコルは、注射器内の結晶化実験を行う検出し、結晶サンプルを特徴づける、結晶密度を最適化し、インジェクタ装置に微結晶を含んだLCPをロードし、データ収集のためのビームに試料を送達するための方法を含みます。

アゴニストエルゴタミン8（PDB ID 4NC3との複合体中のセロトニン受容体5-HT 2B：下に、私たちは、私たちはSFXのデータを収集し、5人のGPCRの高分解能構造を解決するために許可された上記のプロトコルに従うことによって調製した試料を用いて得られた代表的な結果を説明します）、拮抗シクロパミン6（PDB ID 4O9R）との複合体中の二官能性ペプチドリガンドDIPP-NH 2 7（PDB ID 4RWD）、アンジオテンシン受容体との複合体で、δオピオイド受容体との複合体での平滑化受容体（SMO）ブロッカーZD7155 9（PDB ID 4YAY）、およびロドプシンの間及び（PDB ID 4ZWJ）19アレスチン複雑。そして可溶性タンパク質の2つのテスト：リゾチーム（PDB ID 4ZIX）およびフィコシアニン（PDB ID 4ZIZ）。 5-HT 2Bは、神経伝達物質セロトニンの様々な中枢および末梢生理学的機能を媒介します。この受容体光量子ソース（APS）で伝統的なmicrocrystallographyによって解決cryocooled構造とLCLSで得られた室温の構造を比較することにより、LCP-SFX法を確立し、検証するために使用されました。タンパク質微結晶（平均サイズは約5μm）との合計の〜100μlのLCPのサンプルを調製し、使用SFXデータ収集のため、および5HT 2BのLCP-SFX構造が正常に2.8Å（ 図2）8で解決しました。試料調製およびデータ収集のさらなる有用な詳細を表1に示します。 平滑化受容体（SMO）は、胚発生および腫瘍増殖のよく実証機能を持つクラスF GPCRのメンバーと催奇形物質シクロパミンの分子標的です。最初に、120×10×5ミクロンの平均サイズを有するSMO /シクロパミンの比較的大きな結晶が得られると、データコレクションVolために使用しました従来のゴニオメータベースの結晶を用いたシンクロトロン光源での上。しかし、これらの大きな結晶が（2-3度以上の）大きなモザイシティから、おそらく結晶成長欠陥の蓄積、または極低温冷却に関連する影響に苦しんでマイクロフォーカスビームライン（直径10ミクロン）で貧しい人々の回折を生じました。 LCP-SFXは、しかし、室温で5ミクロンサイズの結晶からLCLSで高品質な回折データを収集することができました。構造が明確に結合ポケット6（ 図3）にシクロパミンの場所を特定する、3の主軸に沿って異方性3.4、3.2および4.0Å分解能で分子置換により解決しました。 μオピオイド受容体を標的とモルヒネなどのアルカロイドアヘン剤、（μ-OR）は、重度の疼痛管理のために広く使用されています。しかし、彼らの大規模な使用法は、取得した耐性と依存症につながります。モルヒネの共投与δオピオイド受容体（δ-OR）アンタゴニストとこのように混合アゴニストμ-OR-δ-OR-アンタゴニストおよび機能を有する化合物の探索を推進し、上記の副作用を防止することが示されています。私たちは、δ-OR従来のゴニオメータベースのデータ収集戦略を採用したシンクロトロンX線源で3.3オングストロームに回折cryocooled結晶を用いた二官能性テトラペプチドDIPP-NH 2との複合体中に初期の回折データを得ました。これらのデータは、ペプチドリガンドのための部分的に曖昧な電子密度を明らかにしました。その後、室温でXFEL回折データが得られ、構造体は、リガンドと受容体7の明確な密度を示す2.7オングストロームの分解能で測定しました。この構造は、さらに理解オピオイド受容体機能と選択の機会を提供し、新しい鎮痛薬の開発のための貴重な洞察を提供しました。 GE（1 R AT）= &quot;1&quot;&gt;アンジオテンシンIIタイプ1受容体は、血圧の主要な調節因子としてのGPCRです。私たちは、LCPで拮抗薬ZD7155との複合体で1 R AT結晶化しました。最適化された結晶は、シンクロトロン光源でのみ〜4オングストロームに達する最高の回折で40×4×4μmの3の最大サイズに達しました。結晶化条件を変えることにより、我々は、XFELの放射線を用いて2.9オングストロームの分解能で室温構造を得るために使用されたより小さな結晶のシャワー（10×2×2μmの3）、得られました。 2764739検出器画像の合計は、タンパク質9の約0.29ミリグラムに相当する結晶を含んだLCPの約65マイクロリットルからの完全なデータセットを作るために収集しました。フレームの総数のうち、457275はの73130フレーム、17％のヒット率に対応し、結晶ヒットとして（ヒット数の16％）を同定し、正常にインデックス付けと統合されました。 GPCRは、Gタンパク質またはアレスチンのいずれかによって媒介される二つの主要な経路を介してシグナル伝達します。アレスチンとの複合体中のGPCRの構造は、とらえどころのない残っていたのに対し、ヘテロ三量体G のタンパク質に結合したβ2アドレナリン受容体の構造は、数年前に20を解決しました。私たちは、最長寸法で25-30ミクロンに達しLCPにおけるロドプシンアレスチン融合タンパク質の小さな結晶を得たが、大規模な最適化にもかかわらず、唯一のシンクロトロン源で〜7Å分解能に回折さ。 LCP-SFXの方法を用いることにより、XFELのビームタイムの12時間以内に、我々は18874パターンが正常に3.8オングストローム/ 3.8Å/ 3.3Å19の異方性解像限界に連動し、統合されたから、22262結晶ヒットを集めました。ロドプシンアレスチンは、伝統的なアプローチを用いた構造決意を抵抗し、非常に挑戦的なタンパク質複合体です。この構造体の成功した決意は、大きな可能性を実証してきました困難な問題に取り組むためのLCP-SFX法とのGPCRでアレスチンに偏ったシグナル伝達のメカニズムを検討するユニークな機会を提供しました。 最後に、脂質相で成長させたタンパク質結晶を膜に加えて、我々の試料調製および送達方法は、正常劇的タンパク質の消費量を減少させるために、私たちができるように、LCPは、クリ​​スタルの送達のための担体媒体として使用される可溶性タンパク質結晶のために適合されました構造決意のために必要。 2モデルタンパク質、リゾチームおよびフィコシアニンの構造は、各タンパク質21の0.1mg未満を使用して、この方法により、それぞれ1.89Åと1.75Åの分解能で解決されました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> セロトニン受容体2B </td><td> 平滑化受容体 </td><td><strong&gt;δオピオイド受容体</td><td> アンジオテンシンII受容体タイプ1 </td><td> ロドプシンアレスチン </td><td> リゾチーム </td><td> フィコシアニン </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td>総サンプル使用*、μlの</td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>使用される全タンパク質、μgの</td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td>平均結晶サイズは、ミクロン</td><td> 5×5×5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5×2×2 </td><td> 10×2×2 </td><td> 5月10日</td><td> 5×2×2 </td><td> 10×10×5 </td></tr><tr><td>ヒット率、 ％ </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0.45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td>総データ収集時間、時間</td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td>索引付けされたパターンの数</td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td>空間群</td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td>解像度、Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3.3 / 3.8 / 3.8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> 代表的な構造のための試料調製及びデータ収集統計表1.は、LCP-SFX法を用いて解きます。 LCP-SFXの実験に必要なサンプルの量は、結晶の回折品質結晶密度、噴射ノズルの直径、ならびにXFELビームサイズ、強度およびパルス繰り返し率に依存します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> LCP-SFX。サンプル調製のための典型的なサンプル調製手順の 図1 のフローチャートは、気密ガラスシリンジ中の標的タンパク質のLCP結晶から始まります。結晶が得られた後、結晶を含んだLCPは1シリンジに集約し、追加の脂質で滴定され、absorします余分な沈殿剤溶液B。次いで結晶をXFELデータ収集に先立って、様々な顕微鏡法を用いて特徴づけている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> 図2. 代表的な結果、5-HT 2Bの構造 エルゴタミンとの複合体で、（a） は、5-HT 2B /エルゴタミンの微結晶は、明視野顕微鏡モード8を使用して画像化しました。この図は、 科学から著作権の許可を得て参照8から再利用されている。（b）は 5-HT 2B /エルゴタミンの微結晶は、クロス偏光顕微鏡モード8を使用して画像化しました。この図は、著作権で参照8から再利用されています科学の許可。（c）の LCP-SFXアプローチによって得られた5-HT 2B /エルゴタミン構造の漫画表現。モデルに建設された脂質はスティック表現で示されています。リガンドエルゴタミンは球表現で示されています。実線はおおよその膜の境界を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> 図3. 代表的な結果、シクロパミンとの複合体中のSMOの構造。左パネルには、SMO /シクロパミンの微結晶が交差偏波顕微鏡モード6を使用して画像化しました。この図は、 ネイチャー・コミュニケーションズから著作権の許可を得て参照6から再利用されています。右のパネル、漫画representatiをLCP-SFXアプローチによって得られSMO /シクロパミン構造​​の上。リガンドシクロパミンは球の表現で示されています。実線はおおよその膜の境界を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

X線自由電子レーザーおよびシンクロトロン源での連続結晶学のための脂質立方晶相における膜タンパク質微結晶の調製と送達の手順を説明します。これらのプロトコールは、可溶性タンパク質微結晶の取り込みおよび送達にも適用できるため、液体注入と比較してサンプル消費量を大幅に削減できます。

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

この手順の全体的な目的は、シンクロトロンおよびX線自由電子レーザー光源におけるシリアル結晶構造解析データ収集のために、リピディックキュービックフェーズ（LCP）中での膜タンパク質結晶試料を調製することです。この手法は、膜を介した輸送やシグナル伝達など、膜タンパク質の構造生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、最小限の試料消費量かつ無視できるほどの放射線損傷で、室温での天然の脂質環境における膜タンパク質の構造決定を可能にする点にあります。リピディックキュービック相は粘性の高いゲル状物質であり、専用の器具や事前の経験なしに扱うことは困難であるため、この方法に不慣れな方は苦労する可能性があります。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、シリンジ1およびシリンジ2を用いて、リピディックキュービック相（LCP）への膜タンパク質の再構成からこの手順を開始してください。透明で均質なLCPが形成された後、サンプル全体をシリンジ2に移します。カプラーをシリンジ2に接続したまま、シリンジ1を取り外します。取り外し可能な針を、シリンジ3と呼ばれる別の清潔な100 µLシリンジに接続します。そこに沈殿剤溶液を約70 µL吸引します。テフロン球をシリンジ内に保持したまま、シリンジ3から針を取り外します。カプラーを介してシリンジ2とシリンジ3を接続し、両方のシリンジ内でテフロン球が正しく配置されていることを確認します。カプラーを慎重にしっかりと締め付けます。連結されたシリンジを垂直に立て、シリンジ2を下に配置します。シリンジ2からシリンジ3へ、タンパク質を含むLCPサンプルを、LCPストリングがシリンジ3のプランジャーに触れるまで、ゆっくりと一定の速度で注入します。注入されるLCPの量は、シリンジ3にある初期沈殿剤量の約1/10になります。両方のシリンジの目盛りを読み取り、注入量を確認してください。次に、シリンジ2を切り離します。この時点で、カプラーは沈殿剤溶液に浸されたサンプルが入ったシリンジ3のみに接続されています。パラフィルムを使用して、プランジャーとシリンジの接合部、カプラーの開口端、およびニードルナットを含むシリンジ3を完全に密封します。このステップでの封印が不完全な場合、沈殿条件が変化し、サンプルが脱水する可能性があります。タンパク質含有LCPサンプルの注入ステップを繰り返し、さらに6本のシリンジで結晶化のセットアップを行います。この際、LCPサンプルを合計で約50 microliters使用します。サンプルの脱水を防ぐため、水に浸した糸くずの出ないクリーニングティッシュを1〜2枚と共に、封印したシリンジをプラスチック製の密閉袋に入れて保存してください。バッグを密閉し、結晶成長の間、シリンジを20 °Cのインキュベーターで保存します。結晶検出のためには、12〜24時間ごとにシリンジをインキュベーターから取り出し、直交ニコル下の実体顕微鏡を用いて、シリンジ内のLCPサンプルを直接観察します。結晶は、密集した光沢のある粒子として、または結晶サイズが小さい場合は、LCPフィラメントからの均一な輝きとして識別します。密封したシリンジをバッグに戻し、今後の使用に備えて20 °Cで保存します。脂質滴定の手順は、過剰な沈殿剤溶液を吸収し、X線自由電子レーザービームへの注入時に脂質が凍結するのを防ぐために必要です。データ収集を開始する約1時間前に、サンプルが入ったシリンジを20 °Cのインキュベーターから取り出します。結晶の外観や結晶化条件が類似していることに基づいて、試料の統合に使用するシリンジを2〜4本選択します。選択したシリンジからParafilmのシールを慎重に剥がします。シリンジカプラーを取り外し、1本目の選択したシリンジに清潔な取り外し可能な針を取り付けます。プランジャーをゆっくりと慎重に押し込み、沈殿剤を針からマイクロ遠心チューブ内へ押し出します。このステップでは注意してください。プランジャーに強い圧力をかけると、沈殿剤溶液とともに結晶を含むLCPの一部が排出され、サンプルの部分的なまたは完全な喪失につながる可能性があります。沈殿剤の大部分が除去され、針の入り口にLCPが蓄積したところで、プランジャーを止めてください。他の選択したシリンジについても、この操作を行います。得られたLCPサンプルをまとめるには、きれいなカプラーを介して2本のシリンジを接続します。一方のシリンジのプランジャーを押し、サンプル全体をもう一方のシリンジに転送します。空になったシリンジを取り外します。この操作を繰り返し、結晶を含むすべてのLCP材料を1本のシリンジにまとめます。沈殿剤を可能な限り除去してください。約 5 µL の 7.9 MAG または元の短鎖 MAG ホスト脂質を空のシリンジに加えます。このシリンジをシリンジカプラーで統合サンプルが入ったシリンジに接続し、シリンジプランジャーを交互に押して混合します。残りの溶液がすべて吸収され、均一で透明な LCP が形成されるまで、この操作を繰り返します。混合したLCPサンプル全体を1つのシリンジに移し、空になったシリンジを取り外します。統合したサンプルが入ったシリンジに、LCPインジェクター用ローディングニードルを取り付けます。LCPサンプルを約1 µL、ガラススライド上に慎重に滴下し、ガラスカバーガラスで覆います。カバーガラスをそっと押し、サンプルを挟み込みます。明視野照明と直交ニコルを用い、ステレオ顕微鏡の下で可能な限りの高倍率でLCPサンプルの画像を撮影します。可能であれば、UV蛍光顕微鏡およびイメージャーを用いて追加の画像を撮影し、サンプル中にタンパク質微結晶が存在することを確認してください。結晶のサイズと密度を推定します。データ収集実験における理想的な結晶密度は、結晶サイズ、X線ビームの直径、およびLCPストリームの直径に依存し、結晶のヒット率が約10%から40%になるように調整する必要があります。最後に、LCPインジェクターに充填し、テキストプロトコルに記載されている通りにLCPシリアルフェムト秒結晶学（LCP SFX）データ収集を行います。ここでは、エルゴタミンと複合体を形成したセロトニン受容体のマイクロ結晶を、明視野顕微鏡モードおよび直交ニコル顕微鏡モードで撮影した画像を示しています。セロトニン受容体エルゴタミン複合体の構造は、LCP SFX法によって得られました。ここでは、直交ニコチン受容体とシクロパミンとの複合体微結晶を、直交偏光顕微鏡モードで撮影した画像を示しています。受容体シクロパミン複合体の構造は、LCP SFX法によって得られました。この手順を習得し、適切に実施すれば、2時間以内に完了させることができます。この手法は膜タンパク質標的の構造に関する知見を提供しますが、わずかな改変を加えることで、他のタンパク質にも適用可能です。本技術の意義は創薬にまで及びます。高解像度の構造は、標準的なリグナンとタンパク質の相互作用における優れたテンプレートとなり、より効率的な薬剤の設計に役立つためです。

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Research

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Biochemistry

生物化学

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学ぶ脂質立方相を用いた膜タンパク質微結晶の調製法。シリアルフェムト秒結晶学により、室温で最小限の試料消費と放射線損傷を抑えつつ、膜タンパク質の構造決定を実現する技術です。

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