Name: のpH依存性活性の検出エシェリヒア・コリシャペロンHdeBインビトロとインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぼう、大腸菌シャペロンHdeBのpH依存性活性をin vitroおよびin vivoアッセイで特性評価する方法。酸性条件下でのタンパク質保護メカニズムを解明し、細菌のストレス応答理解に貢献します。

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私たちは、シャペロンアッセイの彼女の有益な助言のために博士クラウディアCremersに感謝します。ケン・ワンはHdeB精製における彼の技術支援のために認められています。この作品は、ドイツ研究財団（DFG）が提供するポスドク研究フェローシップでサポートされている（航空局へ）ハワード・ヒューズ医学研究所と航空局とUJJ-UDへの健康助成金RO1 GM102829の国立研究所によってサポートされていました。

ペリプラズムHdeBの1発現および精製注：HdeBはEに発現していました大腸菌細胞はプラスミドpTrc- hdeB 10、およびポリミキシン溶解時のペリプラズムから精製を保有。 <ol><li> E.の一晩培養物を準備します200 / mlのアンピシリン（LB アンプ）を含有する 30ミリリットルのLB中でプラスミドpTrc- hdeB 10を保有する 大腸菌細胞。 LB アンプ 4つの1リットル培養物を接種し、0.7のOD 600nmまでに達するまで37℃、200rpmでそれらを成長させます。そして、HdeBの発現を誘導し、30℃の成長温度を低下させるために300μMのIPTGを加えます。 </li><li> 30℃でのタンパク質の発現の5時間後、4℃で5分間、8,000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li> 100で細胞ペレットを4℃で5分間、8,000×gで再び細胞を（50 mMトリス/塩酸、50mMのNaCl、pH7.5）で遠心バッファmlの洗浄。 </li><li>その後、再懸濁80で細胞ペレットは、ML 1mg / mlのポリミキシン硫酸塩を含む、緩衝液。外膜の効率的な破壊のために、穏やかに4°Cで1時間サスペンションをかき混ぜます。 </li><li>細胞質画分と細胞破片を除去し、4℃で15,000×gで20分間、懸濁液を遠心します。これは、可溶性HdeBを含む〜60ミリリットルの上清になります。 </li><li> 6 kDaのMWを持つ透析膜を用いて緩衝液B（20mMトリス/塩酸、0.5mMのEDTA、pH8.0）を150倍体積に対して一晩ペリプラズム抽出物を含む上清を透析カットオフ。 3キロダルトンの分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して、15 mlのタンパク質を濃縮します。 0.2μmの細孔フィルターを使用して、タンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li> 2.5ml /分の流速で5カラム容量の緩衝液Bで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（カラム体積5ml）中にタンパク質を適用します。タンパク質をカラムにロードされると、10分のための緩衝液Bでカラムを洗浄します2.5ml /分の流速。 2.5ml /分6の流量で50分の期間にわたって緩衝液B中の0.5 M NaClの0からの直線勾配で溶出HdeB。 </li><li> 15％SDS-PAGEを使用してHdeBを含む画分を特定します。 5μlの5倍還元SDSローディング緩衝液と20μlのサンプルを混ぜます。負荷10μlのゲル上及びトリス - グリシン緩衝液（14.4グラム/ Lグリシン2.9グラム/ LのTris、を1g / Lのドデシル硫酸ナトリウム、pHが8.3）で実行します。ブロモフェノールバンドがゲル（〜45分）の底に近い移動するまで、150Vでゲルを実行します。 </li><li>プールのすべてのHdeB含有画分、4 L HdeB貯蔵緩衝液に対して4℃で一晩透析（50mMトリス/塩酸、200mMのNaCl、pH8.0）に、および分子量遠心分離フィルターユニットを用いて、約300μMにタンパク質を集中3キロダルトンのカットオフ。吸光係数εの280nmの = 15595 Mを使用して280nmでHdeBの濃度を決定-1 cm -1 で 。 100μlのアリコートとフラッシュフリーの準備液体窒素でアリコートをZE。 注：HdeBは、少なくとも6ヶ月間-70℃で保存することができます。 </li></ol> 2.シャペロン活性アッセイリンゴ酸脱水素をアンフォールディング熱の使用（MDH） 注：下記のように熱的に異なるpH値でのブタのミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素（MDH）のアンフォールディングの凝集で精製HdeBの影響をモニターしました。リストされたすべてのタンパク質濃度は、モノマー濃度を参照してください。 <ol><li> 、MDHを準備4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩MDHを透析し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約100μMにタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：MDHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されるようMDHの慎重な透析が必要となります。 </li><li>凝集物を除去するために、4℃、20,000×gで20分間、タンパク質を遠心します。 ε（280nmでの吸光度によってMDH濃度を決定します&lt;サブ&gt; 280ナノメートル= 7,950 M -1 cm -1で）。 50μlのMDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li>温度制御サンプルホルダー、撹拌機を備えた蛍光分光光度計に1ミリリットルの石英キュベットを置きます。 350 nmのλEX /全角を設定します 。 </li><li>キュベットとセットに：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値で予め温めた（43℃）緩衝液D（150 mMリン酸カリウム、150mMのNaCl）の適切なボリュームを追加します。 43℃にキュベットホルダーの温度。総容量1000μlです。 </li><li> 0.5μMMDHを添加し、バッファ12.5μMHdeB（またはバッファ制御用HdeB記憶バッファの代わりに同量）を加えます。光散乱の監視を開始。 MDHの展開十分可能にするために360秒間の反応をインキュベートします。 </li><li> 2 MバッファなしのK 2 HPO 4の0.16から0.34容量を追加することによって、pHを7に上げ、再続けます別の440秒間光散乱をコーディング。 </li><li>中和後に定義された時点におけるシャペロンの非存在下で記録されたMDH凝集の程度を設定し、100％の（ここではMDHの最大光散乱が観察された500秒後）。各示されたpH値でHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号にHdeBの活動を正常化します。 </li></ol>分析超遠心（AUC）によるHdeB-LDH複合体形成の3検出注：HdeB単独で又は熱的に乳酸脱水素酵素（LDH）の展開との複合体の沈降速度実験は、分析用超遠心を用いて行きました。 <ol><li> 4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩LDHを透析、LDHを調製し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約200μmでタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：LDHの慎重な透析をLDとして必要とされていますHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されます。 </li><li>骨材、4℃20,000×gで20分間遠心分離LDHを削除します。 280nmでの吸光度によってLDH濃度を測定（ε280nmで = 43680 M -1 cm -1 で ）。 50μlのLDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li> 41℃で15分間（それぞれpHは4と7、）バッファーDで30μMHdeBの存在下および非存在下で3μMのLDHをインキュベートします。 注：その完全な凝集のより高い温度の結果でLDHのインキュベーション、およびHdeBの無シャペロン効果を観察することができます。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。次に、標準的なセクターを含む細胞への負荷サンプルを1.2センチ路長と2チャンネルのセンターピースを形。超遠心分離機に細胞をロードし、前の沈降に少なくとも1時間、22℃に平衡化。 </li><li> 22°Cと12時間それぞれのローター中で167,000×gでスピンサンプル、SEDを監視連続して280 nmでのタンパク質のimentation。以前に実証されているように、各チャネルの透過光強度はなく吸光度より測定した場合、信号対雑音比が改善されます。これはまた、後続のデータフィッティングの品質を向上させます。 </li><li>連続C（s）は分布モデル17を使用して、SEDFIT（バージョン15.01b、2015年12月）でのデータ分析を行います。 SEDFITを使用する方法を記述したチュートリアルでは、参照18で見つけることができます。 <ol><li> 0.7 ME（最大エントロピー）正則の信頼レベルを設定します。 </li></ol></li><li> SEDNTERP 19を使用して、バッファ密度だけでなく、粘度を計算します。凝集したクライアントタンパク質の量を推定するために、参照としてpH7にpHを4に沈降LDHの積分を比較します。 注：沈降分布プロットの統合はSEDFITで直接行うことができます。沈降速度データを分析するための代替ソフトウェアは、最近のレビュー20に記載されています。&lt;/李&gt; </ol> HdeBの存在下での4モニタリングMDH不活性化と再活性化注記：pHを展開MDHのリフォールディングで精製HdeBの影響を中和時MDH活性をモニターすることによって決定しました。 <ol><li> 25μMHdeBの存在下または非存在下で37℃で1時間：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値でバッファDで1μMMDHをインキュベートします。その後、10分間、20℃まで温度をシフトします。 注：MDHは37℃より高い温度でインキュベートしたときにMDHのリフォールディングをもHdeBの存在下では観察されませんでした。 </li><li>酸変性MDHのリフォールディングを開始するために、0.5 Mリン酸ナトリウム、pH8.0の0.13から0.42の体積の添加によってpH7に試料を中和します。 </li><li> 20℃で2時間インキュベートした後、340nmの9におけるNADHの減少をモニターすることによってMDH活性を決定します。 注：MDHはL-リンゴにオキサロ酢酸のNADH依存性還元を触媒します。 <oL&gt; <li>アッセイ緩​​衝液950μL（50 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0、1mMのオキサロ酢酸、および150μMNADH）とのインキュベーション反応液50μlを混合します。 注：アッセイ緩​​衝液中MDHの最終濃度は44 nMであるべきです。 </li><li> 20℃に設定し、ペルチェ温度制御ブロックを備えた分光光度計を用いて吸光度の変化を監視します。 </li><li> pHを7.0に維持してきた44 nMのネイティブMDHにMDH活性の相対を報告します。 </li></ol></li></ol> E.上HdeB過剰発現の5効果酸ストレス下での大腸菌の生存注：E.大腸菌 MG1655のゲノムDNAは、公表されたプロトコル21を用いて単離しました。 <ol><li> E.からhdeBを増幅プライマーhdeBを用いたPCRによるコリ MG1655 - のBamH I-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATTとhdeB - のEcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li>次のように50μl中のPCR反応を設定します：10μlの5×ポリメラーゼバッファー、ゲノムDNA MG1655、0.5μlのDNAポリメラーゼngを、200μMのdNTP、0.5μMのプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、150は、50μlにのddH 2 Oを追加します。 </li><li>ステップ1：以下のようhdeBの増幅を行い、95℃、1サイクルで5分。ステップ2：95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃、40サイクルで30秒間。ステップ3：72℃で10分間。 </li><li>制限部位のクローニングのための標準的な方法を用いてプラスミドpBAD18のをEcoR IとのBamH I部位にPCR断片を得られたクローン。製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを精製します。シークエンス10によって得られたプラスミドを確認します。 </li><li> 、λ - - 、E14 - 、[araD139] B / R [F：株BB7224（ΔrpoH）（遺伝子型にHdeBまたは空ベクター対照pBAD18を発現するプラスミドをトランスフォーム6;（ARGF-LAC）169 flhD5301Δ（fruK-yeiR）725（fruA25）relA1 rpsL150（SM R）rbsR22Δ（fimB-FIME）632（:: IS1）ptsF25 zhf :: Tnの10（TC S）suhX401 deoC1 araDを + rpoH ::館 +; 16）化学的コンピテント細胞を用いました。 注：この株は温度感受性です。 </li><li> 45秒42℃で熱ショック前めっきした後、30℃、200 rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを実行し、30℃で一晩インキュベートします。 50ミリリットルのLB アンプで一晩培養を準備し、200rpmで、30℃で細胞を培養。 </li><li>一晩培養物を25 mlのLB アンプに40倍に希釈し、HdeBタンパク質発現を誘導するために30℃、ODを600nmで 200 RPM = 1.0で0.5％アラビノース（ARA）の存在下で細菌を増殖します。 </li><li> pHシフトの実験のために、LBを使用アンプ+アラ0.5のOD 600nmまでに細胞を希釈し、（ここではpHは2.0、pHが3.0、およびpH 4.0）それぞれのpH値に調整して5 M HClを適切なボリュームを追加することによって。 </li><li>示された時点（; pHは3、2.5分; pHは2、1分pHは4、30分）した後、5 M NaOHを適切な容量の添加により培養液を中和します。 </li><li> OD測定値を用いて30℃で12時間培養液中の中和培養物の増殖を監視します。 </li></ol>

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<html>活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い上方調節発現を可能にします大腸菌株。この局面は、rpoH欠損株を利用した酸ストレス条件下でHdeBのin vivo過剰発現研究のために特に関連しています。この株は、シャペロンのほとんどを欠いているため、高温、低pHおよび酸化ストレス15を含む様々なストレス要因、に対してより敏感です。代替として、本明細書に提示したものと類似した生存研究は、目的の遺伝子を欠く変異株で行うことができます。 T &quot;&gt;任意のシャペロン活性のための実験設計またはリフォールディングアッセイは、クライアントのタイプ、クライアントタンパク質の濃度およ...

微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体1に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃（pH範囲1-4）、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件3の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります<sup&gt; 4,5：中性pHでは、HdeAは折り畳まれ、シャペロン不活性な二量体として存在します。 pHが3以下のpHシフトの際に、HdeAのシャペロン機能は、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。 ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ10 HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>NEB10-β E. coli細胞</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロスミックス、レノックス</td><td>LAB エクスプレス</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシンB硫酸塩&nbsp;</td><td>ICNバイオメディカルズ株式会社</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0.2 & マイクロ;m pore sterile シリンジフィルター</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸デヒドロゲナーゼ (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム (モノベーシック)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassiumリン酸塩(二塩基性)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500蛍光分光光度計</td>日<td>立</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>オキサロ酢酸</td><td>シグマ</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764//0/1/0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>センターピース、12 mm、エポンチャコール入り</td><td>ベックマンコールター</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti ローター、分析、8 プレース</td><td>ベックマン・コールター</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>ウィザード プラス ミニプレップ キット</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>プラスミド精製に使用 (プロトコル 5.1)</td></tr> <tr><td>L-アラビノース</td><td>ゴールド バイオテクノロジー</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>ドット サイエンティフィック</td><td>インク DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>蛍光細胞キュベット</td><td>ヘルマ アナリティクス</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP セット</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 分光光度計</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 透析膜 MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96ウェルサーマルサイクラー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

のph依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンhdeb<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイを使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果で得られたことを確認することが不可欠です。 このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびin vivoの方法で説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを。

HdeAとHdeBは、E相同であります酸ストレス条件10に対してペリプラズムタンパク質を保護することが知られている大腸菌タンパク質。私たちの仕事は、HdeAと同様に、HdeBはまた、分子シャペロンを活性化酸として機能することを明らかにしました。しかし、まだ潜在的に殺菌が、HdeA 6,9,10,22の最適pHよりも有意に高いpHでHdeA、HdeB機能とは対照的です。 インビトロで HdeBのシャペロン活性の最適pHを調べるために、天然のMDHはHdeBの存在下または非存在下で示されたpH値の予め温めた（43℃）緩衝液中に希釈しました。インキュベーションの360秒後、インキュベーション反応を中和しました。この中和は、43℃で9でMDHの凝集を誘発します。代表的な結果がHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号が原因MDHの凝集に中和時に劇的に増加させることを示している（ 図1、BL各pHにおけるACKライ​​ン）。 ...

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

これらの一連のin vivoおよびin vitroシャペロンアッセイの全体的な目的は、酸性pH条件下における大腸菌（Escherichia coli）のシャペロンHdeBのpH依存的な活性を特性づけることです。酸活性化シャペロンの役割は唯一つであり、酸によって誘導されるタンパク質のアンフォールディング（変性）および分解からタンパク質を保護することです。この機能は、腸管内に正常に定着するために胃の酸性環境を生き抜かなければならない腸内細菌にとって特に重要です。ここで提示する手法を用いることで、酸活性化シャペロンを同定・特性解析し、その活性化を導くpH条件を定義することができます。このビデオを視聴することで、HdeBなどのシャペロンをin vitroおよびin vivoで特性解析する方法を十分に理解でき、その活性化メカニズムを解明するのに役立ちます。これらの手法は、HDAなどの他の酸保護シャペロンにも正常に適用されており、さらに他のシャペロンやストレス条件に合わせて修正して使用することが可能です。異なるpH値における、熱変性させたブタ心臓ミトコンドリアC-マレート脱水素酵素（MDH）の凝集に対する精製HdeBの影響をモニタリングします。透析後のMDHを、4 LのバッファーCを用いて4 °Cで一晩透析します。その後、分画分子量30 kDaの遠心ろ過ユニットを用いて、タンパク質を約100 µMまで濃縮します。凝集物を除去するため、タンパク質を4 °C、20,000 ×gで20分間遠心分離します。280 nmにおける吸光度によりMDH濃度を決定します。次に、MDHを50 µLずつ分注し、保存のために急速凍結させます。温度制御可能なサンプルホルダーと攪拌機を備えた蛍光分光光度計に、1 mLの石英キュベットをセットします。励起波長および吸収波長を350 nanometersに設定します。所定のpH値に調整し、あらかじめ加温したバッファーDを適切な量だけキュベットに加えます。全量は1,000 microlitersです。キュベットホルダーの温度を43 °Cに設定します。バッファーに12.5 µMのHdeBを加え、続いて0.5 µMのMDHを加えます。光散乱のモニタリングを開始します。MDHを十分にアンフォールディングさせるため、反応を360秒間インキュベートします。2 Mの緩衝剤を含まないリン酸二カリウムを0.16～0.34体積分添加してpHを7まで上げ、さらに440秒間、光散乱の記録を継続します。テキストプロトコルに記載されている方法でデータを解析してください。化学的コンピテントセルを用いて、HdeBを発現するプラスミドまたはMDベクターコントロールであるPBAD 18を、菌株BB7224 Delta RPOHに形質転換します。この菌株は温度感受性であるため、30 °Cで培養する必要があります。42 °Cで45秒間のヒートショックを行った後、プレートに播種する前に、細胞を30 °C、200 RPMでインキュベートします。陽性クローンのシングルコロニー画線平板法を行い、30 °Cで一晩培養します。Ampicillin含有LB培地50 mLで overnight培養液を調製し、200 RPM、30 °Cで細胞を培養します。overnight培養液を、Ampicillin含有LB培地25 mLで40倍に希釈します。HDEBタンパク質の発現を誘導するため、0.5%アラビノース存在下、30 °C、200 RPMの条件下で、600 nmにおける光学密度（OD 600）が1.0になるまで細菌を培養します。pHシフト実験では、アンピシリンおよびアラビノース含有LB培地を用いて、細胞をOD 600が0.5になるまで希釈します。5 M塩酸を適切な量添加し、それぞれのpH値に調整します。指定した時間経過後、適切な量の5 M 水酸化ナトリウムを添加して、培養液を中和します。中和後の培養液および液体培養物の増殖を、OD測定を用いて30 °Cで12時間モニタリングします。in vitroにおけるHdeBのシャペロン活性の最適pHを調べるため、HdeBの存在下、または不在下で、あらかじめ温めておいた指定pHの緩衝液にネイティブMDHを希釈しました。360秒間のインキュベーション後、中和により43°CにおけるMDHの凝集を誘導しました。HdeBが存在する場合、pH 4からの中和に伴って光散乱信号が著しく減少しており、これはHdeBがMDHの凝集を抑制することを示しています。凝集の測定は、温度や緩衝液組成の変化に非常に敏感です。偽陽性の結果を排除するため、シャペロン保存バッファーがクライアントの凝集に及ぼす影響を検討しました。HdeB保存バッファーはMDHの凝集に影響を与えませんでした。HdeBのin vivoでの効果を調べるため、温度感受性RPOH欠損株を用いてpH依存性生存アッセイを実施しました。この株はほとんどのシャペロンを欠いており、そのため高温、低pH、または酸化ストレスに対してより感受性が高い。中性pH条件下でのHdeBの過剰発現は、本株の増殖速度に影響を与えず、空ベクターPBAD 18を保持する対照株と同等の増殖を示した。対照的に、pH 3またはpH 4処理後の増殖再開能には明確な差が認められ、HdeB過剰発現株は対照株と比較して、低pH処理からの回復が再現性よく改善していた。習熟すれば、適切に実施することで、精製は3日、in vitro 散乱アッセイは1日、そして in vivo 生存アッセイは2日で完了できます。これらの実験を行う際は、クライアントタンパク質の種類、その濃度、および使用するバッファー条件に関して、実験デザインを慎重に検討してください。この手法の主な利点は、シャペロン活性化のメカニズムとその in vivo 環境における影響について、より詳細な理解を得られる点にあります。また、酸耐性シャペロンのpH最適値を調べることは非常に困難である可能性があることを忘れないでください。これは、使用するクライアントタンパク質の凝集挙動もpHによって変化する可能性が高いためです。したがって、シャペロンとクライアントタンパク質の双方に適した緩衝液系を選択するようにしてください。本手順に従って、SCS pageによるスピンダウンアッセイなどの他の手法を用いて、シャペロン介在性のクライアント凝集抑制を定量的に評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

出典: Dahl, J. ほか。 大 腸菌 シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitro および in vivo。 J. Vis. Exp.

モデルタンパク質の熱展開による細菌シャペロン活性の評価

出典:Dahl, J.ら。大腸菌シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitroおよびin vivo。J. Vis. Exp.(2016年)このビデオは、組換え大 腸菌...

酸ストレス下の 大腸菌 における酸活性化シャペロンの保護的役割の評価

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

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非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

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シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。...

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756...

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からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

学ぼう、大腸菌シャペロンHdeBのpH依存性活性をin vitroおよびin vivoアッセイで特性評価する方法。酸性条件下でのタンパク質保護メカニズムを解明し、細菌のストレス応答理解に貢献します。

のpH依存性活性の検出

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