Name: Etkin Sporlanma Saccharomyces cerevisiae 96 çukurlu Formatında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'nin 96 çukurlu formatta etkin sporlanma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli tarama için optimize edilmiş havalandırma teknikleriyle maya genetiği çalışmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH Massachusetts Boston (LSH) ve R15 GM86805 Üniversitesi (LSH) bir Joseph P. Healey hibe ile desteklenmiştir. SMP Massachusetts Boston Üniversitesi&#39;nde Sanofi-Genzyme Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmektedir.

1. Sporulationun için hazırlanıyor Not:. Bu protokol açıklanan medya standart reçeteleri ve yöntemleri kullanılarak yapılan olan 13,17 Tablo 1 Bu protokolde kullanılan çeşitli medya 1 L formülasyonu verir. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto Pepton </td><td style="width: 50px;"> Maya Özü </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> üzüm şekeri </td><td style="width: 70px;"> Potasyum Asetat </td><td style="width: 60px;"> gliserin </td><td style="width: 60px;"> GKD 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPG plakalar </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 mi </td><td> 970 mi </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD plakaları </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 mi </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD sıvı </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 mi </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA sıvı </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1000 mi </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> sporülasyon ortam </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1000 mi </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Ortam formülasyonlar edilmiştir ortam 1 ​​L için verilmiştir. medya konusunda Özelliklerimaddeler Malzeme Tablo bulunabilir. <ol><li> Tüm sporlanan Hücreler aynı genotip olacaksa, bu yordamı uygulayın: <ol><li> Çözülme maya suşu, bir YPG (YPGlycerol) plaka kullanılır. 30 ° C&#39;de 12-16 saat boyunca maya büyümek. Önemlisi, SK1 hücreleri de o kadar SK1 suşları YPG plakalar üzerinde çok uzun bırakılmamalıdır, sporlanmalanna gurur duyuyoruz, ya da plaka üzerinde sporlanmalanna olabilir. Not: YPG üzerinde büyümüş bir taze çözülmüş soyu, bir karbon kaynağı olarak gliserol kullanımı gibi oksidatif fosforilasyon gerektirir tercih edilir ve bu durumda işlevsel mitokondriyal DNA sahip hücreler için seçim yapmaktadır edilir. SK1 hücreler fonksiyonel mitokondriyal DNA kaybetmek ve petites olma eğilimi var. Fonksiyonel mitokondriyal DNA, sporlanma için gereklidir. </li><li> tek koloniler için YPD bir (YPDextrose) plaka üzerine YPG plakasından Streak maya. 30 ° C&#39;de YPD plaka 24-28 saat üzerinde maya büyür. </li><li> YPD katı ortam üzerinde büyüme yaklaşık 36-48 saat sonra, tek bir koloni ile 25 ml&#39;lik bir YPD kültürünü başlatmakYPD plaka dan. Hücreler 7.0 = 4.0 OD 600 hakkında kadar bu kültürü büyütün. 220 rpm&#39;de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe gece boyunca 30 ° C &#39;de bu adımı gerçekleştirir. </li><li> YPD kültüründen (220 çalkalanarak 30 ° C&#39;de ve çalkalama inkübatöründe maya büyümek 2. Bölüm, her 96 yuvalı plaka ihtiyacı için OD 600 = 0.1 olduğunu YPA (YPAcetate) kültür 1000 ml başlangıç ​​hücre, uygun bir miktarda kullanımı OD 600 1,5-1,3 arasında kültür kadar rpm). Not: Dört 96 çukurlu levhalar tarama, her 96 çukurlu levha YPA kültürü 100 ml inoküle Örneğin, Bölüm 2&#39;de elenecek, YPA kültürü 400 ml gereklidir. YPA kültür içinde% 10 ekstra hacim başlayarak buharlaştırıcı birim kaybına karşı korumak için gereklidir. Hücreler uygun OD 600 ulaşması için Tipik olarak, 12-16 saat arasında sürer; süre maya suşu genotipine bağlı olarak değişebilir. YPA presporulation ortamıdır. Pregrowthasetat içinde gen ekspresyonunu (örneğin IME1 gibi) etkili ve eş zamanlı sporlanma 6 için gerekli neden olur. </li><li> 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj 1.800 x g&#39;de Spin YPA yetiştirilen hücreler pelet. Yıkama Hücreler, steril otoklavlanmış deiyonize su, 0.5 hacim 1x. Tekrar Spin ve yıkama atın. 1x hacim sporlanma medyada yeniden süspanse hücreleri. Bölüm 2 devam ediyor. </li></ol></li><li> Farklı genotipleri, vardır sporlanma için hücreleri kullanarak (farklı plazmidler ile transforme, yani veya farklı tipik elde dondurulmuş stoklar olarak saklanır mutasyonları içeren) 96 çukurlu bir biçime farklı genotip, dizi hücrelerini edin. Sonra, bu yordamı izleyin: <ol><li> YPG katı ortam üzerinde 96 oyuklu bir plaka (lar) içinde çözülmüş, dondurulmuş stoklar hücreleri aktarmak için bir steril 96 çatal Frogger kullanın. 30 ° C de bir gece boyunca, maya büyümek. </li><li> steril 96 diş Frogger kullanarak, YPD katı ortam veya seçici üzerine YPG katı ortam hücreleri aktarmakKatı ortam (hücre seçimini gerektirir plazmidler içeriyorsa, yani sentetik minimal medya, amino asitler eksik). Seçici ortam gerekirse koloniler 2 gün YPD tipik haliyle 1 gün, her bir suş için oluşturulur ve kadar 30 ° C &#39;de maya büyütün. </li><li> Kısım 96, derin 2 mi çukurlu plakanın her oyuğuna YPD sıvı ortam veya seçici sıvı ortam 1.2 mi. Bir Frogger kullanılarak sıvı ortam içine bir katı ortam transfer hücreleri, bant ile yerinde tutulan plastik bir kapak ile kapatın ve 220 rpm&#39;de çalkalanarak, 30 ° C&#39;de çalkalayıcı içinde gece boyunca büyür. Not: kontaminasyonu en aza indirmek için, dikdörtgen bir petri tabak plastik kapaklar kullanarak kapak plakaları. Bu hava sirkülasyonu minimal sınırlıdır, bu yüzden bir parça bant kullanarak yerine kapaklarını tutun. </li><li> adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 5 dakika boyunca 1.800 xg&#39;de santrifüj plakalar, 96 gözlü plakalar karşılamak için. hücrelerden medya dökün; YPA pelet hücreleri her 500 ul Ypa de ekleme ve yeniden süspanse edin. kapakbant ile yerinde tutulur plastik kapak ile. </li><li> 220 rpm&#39;de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe 30 ° C&#39;de 15 saat boyunca hücreler büyür. Bölüm 2 devam ediyor. </li></ol></li></ol> 96 çukurlu Format 2. sporlanan Hücreler <ol><li> Bir 3 mm steril katı cam boncuk ve 1.3 mi çukurlu bir 96 oyuklu plakanın her oyuğuna steril 5 mm x 2 mm boyutlarında manyetik bir karıştırma çubuğu, ya ekleyin. (Bir boncuk veya bir karıştırma çubuğu kullanmak konusunda bir tartışma için aşağıdaki Temsilcisi Sonuçları gör.) </li><li> elenecek tüm hücreler aynı genotip ise, 2.2.1 gidin. elenecek hücreleri farklı genotip ise, 2.2.2 gidin. <ol><li> 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna içine adım 1.1.5 ve kısım hücre ve ortam 500 ul hücreleri al. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin. </li><li> 96 kuyucuğu karşılamak için adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 1.2.4 den 5 dakika boyunca 1.800 xg&#39;de YPA olan Spin hücreleri. dökünhücrelerinden f medya. sporlanma medya pelet hücreleri her sporülasyon medya 500 ul iyi ekleyin ve tekrar süspansiyon. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin. </li></ol></li><li> Cam boncuk kullanılarak, bir yerde, 30 ° C&#39;de çalkalayıcı bir inkübatör içinde, örnekler ve sporlaşma 220 rpm&#39;de çalkalanır. sporlanma için 30 ° C inkübatör içinde bir karıştırıcı plaka üzerinde bir manyetik karıştırma çubuğu, Örnekleri kullanarak. Not: tüm barlar enerjik hareket ediyor ve kültür havalandırılır olarak manyetik karıştırma çubukları için tam karıştırma hızı sürece çok önemli değildir. </li><li> , Sporulationun ilerlemeyi izlemek görselleştirme sporlanan kültüründen örnekleri çekilme, 96 iyi lamel plakada sporülasyon medya 24 ul sporlanan kültürlerinden hücrelerin 6 ul ekleyin için (1: 5 seyreltme). ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin incelenmesi önce 5 dakika boyunca yerleşmek için hücreleri bırakın. Not: vahşi tip SK1 hücrelerinde, kompakt olgun sporlar 3 ile oluşturacaksporlanma medyaya transfer edildikten sonra 6 saat. Sporlanma ilerleme, örneğin nükleer işaretleyici olarak flüoresan işaretçileri kullanılarak mikroskop ile izlenebilir (yani, Htb2 mCherry 18), öz değişmesine ait bölünme veya prospore membran işaretleyici incelemek için (örneğin, G-20 19) spor morfojenezi incelemek. Seçenek olarak ise, refraktil sporların oluşumunu sporülasyon ortama transferinden sonra yaklaşık 12 saat başlayan Nomarski DIC mikroskopi kullanılarak görülebilir. </li></ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Burada 96 multiwell formatta SK1 maya sporlanan için bir protokol mevcut. Havalandırma Bir karıştırma çubuğu ya da her iyi bir cam boncuk ya kullanımını gerektirir verimli sporlanma için anahtardır. hücreler, bir tane veya bir karıştırma çubuğu ya da olmayan bir çalkalama inkübatöründe 96 çukurlu bir plaka içinde sporule zaman, hücreleri verimli sporlanmalanna yoktur. Hücreler bir boncuk ya da (çalkalama olmaksızın 30 ° C de Tablo 1 olmasına kıyasla bir çalkalama inkübatöründe Bir karıştırıcı çubuğu, ya...

Tomurcuklanan maya sporlanma mayoz 1, genetik rekombinasyon 2 mekanizmaları, 3 sinyal hücre tarafından gelişim kontrolü, geliştirme 4 besin kontrolü, transkripsiyonel sırasında kromozom ayrımı kontrolü de dahil olmak üzere biyoloji birçok açıdan, içgörü sağlamak için çalışılmıştır gelişim 5 düzenlenmesi ve spor oluşumu 6 incelenmesi. Spor Oluşumu koruyucu spor duvar 6 birikimi, ardından ana hücreden içinde yeni zar bölümlerine oluşturulmasını içeren yeni bir hücre bölünmesi olayını içerir. Sporlanan hücrelerini inceleyen Bu çalışmalar genellikle nispeten verimli bir şekilde 7,8 yaklaşık 24 saat içinde sporülasyonun sürecinden geçmeleri için hızla sporlanan maya suşu SK1, yararlanmak. Maya tomurcuklanan sporülasyon koşullarının optimizasyonu 9-13, bu deney, tarif edilmiş olmasına rağmens katı ortam üzerinde ya da sporlaşma kültür tüpleri veya şişeleri kullanılarak gerçekleştirilir büyük ölçekli sıvı kültürlerde sporlanmasını incelenmiştir. Burada, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, maya sporlanan için bir yöntemi tarif eder. Bu yöntem için, havalandırma senkron ve verimli sporülasyonun için kritik olduğunu bulmak ve küçük hacimli multiwell biçimi yeterli sporulasyonunu sağlamak için teknikler geliştirdiler. Hücreler, yüksek verimli teknikleri ve döşemeli kütüphane 14-16 kullanılarak yüksek kopya bastırma için çok oyuklu bir plaka biçiminde, bu tarama için optimize edilmiş reaktifler kullanılarak taranabilir için 96 çukurlu bir levha formatında sporlanan sağlar.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 ml DeepWell Plakaları</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Sporülasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 ml DeepWell plakaları</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Presporülasyon büyümesi için kullanılır, adım 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm cam boncuk</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Sporülasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm karıştırma çubuğu, 12'li paket</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Sporülasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>96 iyi kurbağa</td><td>V & P Scientific</td><td>VP407</td>, <td>adım 1.2</td></tr><tr><td>kütüphane fotokopi makinesi</td><td>V & için gereklidir P Scientific</td><td>VP381</td><td>adım 1.2 için gereklidir; kurbağa</td></tr><tr><td>dikdörtgen Petri kabı</td> ile kullanılmak üzere Adım <td>1.2 için gerekli</td><td>olan ThermoScientific</td><td>264728</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>medya için gereklidir</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td></td> medya <td>için gerekli</td>Bacto Agar BD <td>212750</td> medya için</tr><tr><td></td><td></td><td>gerekli</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Medya için Fisher</td><td>D16-3</td><td>gerekli</td></tr><tr><td>Ortam için Potasyum Asetat</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td></td></tr> gerekli <tr><td>Ortam için</td>Gliserol<td></td><td>Fisher</td><td>G33-500</td> gerekli</tr><tr><td>Siyah 96 kuyulu cam alt plaka</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>adım 2.4 için gerekli</td></tr></tbody></table>

etkin sporlanma<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; 96 çukurlu formatında

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Beslenme stresi zamanlarında, Saccharomyces cerevisiae sporülasyon olarak bilinen gametogenez geçirir. Azot ve karbon için aç kalan diploid maya hücreleri, sporülasyon sürecini başlatacaktır. Sporülasyon süreci, mayoz bölünmeyi ve ardından haploid çekirdeklerin çevreye dirençli sporlar halinde paketlendiği spor oluşumunu içerir. Sporülasyon fenotipleri için tarama maya hücrelerinin verimini artırmak için 96 çok kuyulu plakada tomurcuklanan mayanın verimli bir şekilde sporlanması için yöntemler geliştirdik. Bu yöntemler, uygun minimal besiyeri kullanıldığında besin seçimi gerektiren maya içeren plazmitlerle tarama veya zengin bir presporülasyon rejimi kullanıldığında genomik değişiklikler içeren maya taraması ile uyumludur. Bu yöntem için, sporülasyon sırasında havalandırmanın spor oluşumu için kritik olduğunu bulduk ve 96 çok kuyulu plaka formatı ile uyumlu yeterli havalandırmayı sağlamak için teknikler geliştirdik. Bu yöntemler, büyük hacimli şişe bazlı deneylerde elde edilebilecek tipik ~% 80 sporülasyon seviyesine ulaşmasa da, bu yöntemler küçük hacimli çok kuyulu plakalarda güvenilir bir şekilde yaklaşık% 50-60 sporülasyon seviyesine ulaşacaktır.

<html> Bu protokol değerlendirmek için, (yukarıda anlatıldığı gibi) çukurlu levhalarda yer alan hücreler sporlanan elde sporülasyon verimleri şişelerinde (Tablo 2) &#39;de daha büyük hacimler ile sporule hücreleri karşılaştırılmıştır. multiwell plakaların kullanımı ~% 80 verimlilik rutin görülebilir matara, sporlanan zaman görülen yüksek verim elde etmedi. (Cam boncuk veya bir karıştırma çubukları tarafından sağlanır), uygun havalandırma ile çukurlu plakalarda sporlanan E...

Burada, Saccharomyces cerevisiae'nin sporlanması 96 çok kuyulu bir formatta gerçekleştirilir.

Etkin Sporlanma<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 96 çukurlu Formatında

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Bu protokolün genel amacı, tomurcuklanan mayayı 96 kuyucuklu formatta verimli bir şekilde sporülasyona uğratmaktır. Tomurcuklanan maya üzerinde birçok geniş ölçekli tarama yapılmış olsa da, mayoz ve sporülasyona odaklanan yüksek verimli çalışmalar sınırlı kalmıştır. Bu videoda açıklanan teknik, mayayı yüksek verimli tarama ile uyumlu olan 96 kuyucuklu formatta, maliyet etkin bir şekilde ve verimli olarak sporülasyona uğratma avantajına sahiptir.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, refraktil sporlar oluşturamayan bir mutantın yüksek kopya baskılayıcılarını taramak için döşenmiş bir iki mikron plazmit kütüphanesi kullanmak istemem üzerine geliştirdim. Başlangıçta, 96 kuyucuklu formatta sporülasyon verimliliklerim düşüktü. Bunun yetersiz havalandırmadan kaynaklandığını tespit ettim.Bu prosedüre, SK1 maya suşunu maya özütü pepton gliserol veya YPG plağı üzerinde çözerek başlayın. Gliserol stok içeren dondurucu tüpünden az miktarda hücreyi kazımak için steril bir çubuk kullanın ve bunları bir YPG plağına yayın. Mayayı 30 °C'de 12 ila 16 saat boyunca büyütün.Ardından, tek koloniler elde etmek için YPG plağındaki mayayı bir maya özütü pepton dekstroz veya YPD plağına ekimleyin. Mayayı YPD plağında 30 degrees Celsius sıcaklıkta 24 ila 48 saat boyunca büyütün. YPD katı besiyerinde 24 ila 48 saatlik büyümenin ardından, YPD plağından tek bir koloni kullanarak 25 milliliter YPD kültürü başlatın.Bu kültürü, hücreler 4,0 ila 7,0 arası bir OD600 değerine ulaşana kadar 30 °C sıcaklıktaki çalkalamalı inkübatörde 220 RPM hızında gece boyunca büyütün. Ertesi gün, YPD kültüründen uygun miktarda hücre kullanarak, OD600 değeri 0,1 olan 125 mL'lik bir mayas özütü pepton asetat (YPA) kültürünü başlatın. Kültürü, OD600 değeri 1,3 ile 1,5 arasına gelene kadar 30 °C sıcaklıktaki çalkalamalı inkübatörde 220 RPM hızında büyütün.Kültürü santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri peletlemek için masaüstü santrifüjde 1800X G hızında beş dakika boyunca döndürün. Hücreleri, 0,5 hacim steril otoklavlanmış deiyonize su ile bir kez yıkayın. Tekrar döndürün ve suyu dökün.Hücreleri 1X hacmindeki sporülasyon ortamında tekrar süspande edin. Farklı genotiplerdeki hücreleri hazırlamak için, 96 kuyucuklu plaka içindeki çözülmüş dondurulmuş stoklardan alınan hücreler önce YPG katı ortama aktarılır. 96 uçlu bir frogger'ı alevle sterilize edin ve ardından maya kolonilerine değdirmeden önce katı ortam plakasında kısa bir süre soğutun.Mayayı 30 °C'de gece boyunca büyütün. Ertesi gün, hücreleri suşun genotipine bağlı olarak YPG katı ortamdan YPD veya seçici katı ortama aktarın. Bu gösterimde YPD kullanılmıştır.Her suş için koloniler oluşana kadar mayaları 30 °C'de büyütün. 96 kuyucuklu derin kuyuk plakasının her bir kuyucuğuna 1.2 mL YPD sıvı besiyeri ekleyin. Hücreleri katı besiyerinden sıvı besiyerine aktarın.Plakayı dikdörtgen bir petri plağının plastik kapağıyla kapatın ve hava sirkülasyonunu minimum düzeyde kısıtlamak için kapağı bir parça bantla sabitleyin. Hücreleri 30 degree Celsius sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda 220 RPM hızında gece boyunca büyütün. Ertesi gün, 1800X G hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Besiyerini boşaltın ve her bir kuyucuğa 500 µL YPA ekleyin. Ardından peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse edin. Plakayı, bantla sabitlenmiş plastik bir kapakla kapatın.Hücreleri 30 °C sıcaklıktaki çalkalamalı inkübatörde 220 RPM hızında 15 saat boyunca büyütün. Verimli sporülasyon için uygun havalandırma sağlamak amacıyla, 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna ya bir adet 3 mm'lik steril katı cam boncuk ya da bir adet 5 mm x 2 mm'lik steril manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Tüm hücreler aynı genotipe sahipse, 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna medya ile birlikte 500 µL hücre alikotu ekleyin.Plakayı, bantla sabitlenmiş plastik bir kapakla kapatın. Hücreler farklı genotiplere sahipse, YPA içerisinde bulunan hücreleri 1800X G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve besiyerini dökün. Her kuyucuğa 500 microliters sporülasyon besiyeri ekleyin.Ardından çöktürülen hücreleri sporülasyon besiyerinde yeniden süspande edin. Plakayı, bantla sabitlenmiş plastik bir kapakla kapatın. Cam boncuk kullanılıyorsa, sporülasyon için örnekleri 30 °C'ye ayarlanmış bir çalkalamalı inkübatöre yerleştirin ve 220 RPM hızında çalkalayın.Manyetik karıştırma çubukları kullanılıyorsa, sporülasyon için örnekleri 30 degrees Celsius sıcaklıktaki bir inkübatör içindeki karıştırma plakasına yerleştirin. Tüm çubuklar enerjik bir şekilde hareket ettiği ve kültür havalandırıldığı sürece, manyetik çubuklar için kesin karıştırma hızı çok önemli değildir. 36 saat sonra, sporülasyon sürecindeki ilerlemeyi izlemek için örnekleri geri alın.Her bir sporülasyon kültüründen altı µL hücre çekin ve 96 kuyucuklu lam plakasındaki 24 µL sporülasyon besiyerine ekleyin. Hücreleri, ters mikroskop altında incelemeden önce beş dakika boyunca çökmeye bırakın. İki farklı suşun temsili sporülasyonu, ters mikroskopta 63X objektif kullanılarak görüntülenen bu hücre görsellerinde gösterilmiştir.Yabani tip kültüründe, ok başlarıyla belirtilen refraktil tetratlar görülebilmektedir. Ancak sporülasyon yeteneği olmayan smk1 delete hücrelerini içeren kültürde bunlar görülmemektedir. Çok kuyucuklu plakalarda sporüle olan hücreler ile erlenlerde daha büyük hacimler kullanılarak sporüle olan hücrelerin sporülasyon verimlilikleri arasında karşılaştırmalar yapılmıştır.Çok kuyucuklu plakaların kullanımı, erlenlerde sporülasyon yapılan daha tipik protokolde rutin olarak görülen yüksek verimliliğe ulaşmamıştır. Uygun havalandırma ile çok kuyucuklu plakalarda sporülasyon yapmak, %50'den fazla yeterli sporülasyon verimliliklerine ulaşabilir ve en iyi sonuçlar beş milimetrelik manyetik balık kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, küçük manyetik balıkların yüksek maliyeti göz önüne alındığında, cam boncuklar kullanılarak elde edilen verimlilikler bunlarla karşılaştırılabilir düzeydedir.Hem beş milimetrelik hem de yedi milimetrelik manyetik karıştırıcılar 96'lı çok kuyucuklu plakanın kuyucuklarına sığsa da, yedi milimetrelik karıştırıcı kullanımı düşük sporülasyon verimliliği ile sonuçlanmıştır. Bir kuyucuktaki yedi milimetrelik karıştırıcı, bitişik kuyucuktaki karıştırıcı ile etkileşime girme eğilimindedir. Bu durum, karıştırıcıların düzgün çalışmasını engelleyerek kültüre yeterli havalandırma sağlanmasının önüne geçer.Bu videoyu izledikten sonra, 96 kuyucuklu formatta sıvı kültürdeki maya hücrelerini nasıl verimli bir şekilde sporulasyon yaptıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Doğru şekilde uygulandığında, bu işlem uzmanlaşıldıktan sonra altı günde tamamlanabilir. Bu prosedür; farklı mutant suşların, plazmidlerin veya küçük molekül inhibitörlerinin mayoz ve sporulasyon üzerindeki etkilerini taramak için kullanılabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, meiyotik hücre döngüsünün düzenlenmesini ve Saccharomyces cerevisiae'de sporülasyon sırasında sitokinez ile mayozun nasıl eşleştiğini incelemek için kullanılmıştır.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Maya hücreleri Mikromanipülasyon diploid zigot seçmek için mayotik genetik analiz için gerekli. Bu micromanipulations diseksiyon mikroskobu microneedle kullanılarak yürütülmektedir. Microneedle, hücreleri taşınmaya kullanılır ve otomasyon çeşitli derecelerde mevcuttur mikromanipülatör tarafından kontrol edilir.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Yeşil Canavar yöntemi bir muhabir gen kodlaması yeşil flüoresan protein ile işaretlenmiş birden silme hızlı montaj sağlar. Bu yöntem, tekrarlanan delesyonlar cinsel çeşit döngüleri ve daha fazla silme taşıyan hücrelerin floresan merkezli zenginleştirme yoluyla maya suşu sürüş dayanmaktadır.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.

Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bir bakır büyüme testi olan ACT1-CUP1 testi, öncü mesajcı RNA (pre-mRNA) eklemesinin ve mutant ekleme faktörlerinin spleozomal fonksiyon üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde okunmasını sağlar. Bu çalışma bir protokol sağlar ve ilgilenilen ekleme sorusunu ele almak için mümkün olan özelleştirmeyi vurgular.

ACT1-CUP1 Testleri, Tomurcuklanan Mayadaki Splisozomal Mutantların Substrata Özgü Hassasiyetlerini Belirler

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'nin 96 çukurlu formatta etkin sporlanma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli tarama için optimize edilmiş havalandırma teknikleriyle maya genetiği çalışmalarını kolaylaştırır.

Etkin Sporlanma

Daha fazla video keşfet