Name: Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a analizar funciones de células NK mediante citometría de flujo optimizada para muestras pequeñas. Este método permite evaluar degranulación y producción de citoquinas en pacientes pediátricos e inmunodeficientes.

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Los autores fueron apoyados por la Ayuda Alemana contra el Cáncer (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; UE), el Centro LOEWE de Terapia Celular y Génica de Frankfurt (EU, ST) financiado por el Ministerio de Educación Superior, Investigación y Artes de Hesse, Alemania (III L 4- 518/17.004) y por la "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Alemania (UE). BJ fue financiado por una beca postdoctoral Mildred Scheel de la Fundación Dr. Mildred Scheel para la Investigación del Cáncer. ST fue fundada por una beca postdoctoral GO-IN (PCOFUND-GA-2011-291776). Los autores agradecen a Becton Dickinson (BD) por proporcionar los analizadores de citometría de flujo FACSCanto II y Canto10c utilizados en este estudio.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito es un método fácil, rápido y fiable para estudiar las funciones de las células NK a partir de muestras de sangre entera de donantes sanos o pacientes. Este método ofrece la gran ventaja de purificar directamente a las células NK de la sangre entera, evitando el tiempo de centrifugación en gradiente de densidad, que es obligatorio para muchos otros métodos de purificación 15. Por otra parte, se requiere un tamaño de muestra más pequeño en comparación con métodos de enriquecimiento / &quot;cl...

Como parte del sistema inmune innato células asesinas naturales (NK) contribuyen a la primera línea de defensa contra las células infectadas por virus o malignamente transformadas. Un sistema de receptores inhibidores y activadores les permite distinguir entre las células sanas y transformadas sin cebado antígeno antes en contraste con las células T. Al encuentro célula diana células NK liberan el contenido de sus gránulos citotóxicos (por ejemplo, perforina, granzimas) en la sinapsis inmune para matar a su objetivo. Por otra parte, las células NK producen y secretan diferentes tipos de citoquinas (por ejemplo, gamma interferón: IFN-γ; factor de necrosis tumoral-α: TNF-α) y quimiocinas (por ejemplo, proteína inflamatoria de macrófagos-1β: MIP-1 beta) sobre la célula diana interacción o citoquina estimulación 1. suficientes funciones de las células NK, tales como citotoxicidad, quimioquinas y la producción de citoquinas tienen un impacto importante en el destino de diversas disalivia. Los pacientes con leucemia muestran un aumento de las tasas de recaída si presentan un perfil de las células NK defectuosa al momento del diagnóstico que consiste en reducción de la producción de IFN-γ y la reducción de la expresión de la activación de los receptores de células NK 2. Una recuperación temprana del número de células NK y la función, incluyendo la producción de citocinas tras la interacción célula diana está asociada con una recaída reducida y una mejor tasa de supervivencia en pacientes que reciben un trasplante de células madre alogénicas 3. Por otra parte, al iniciar la terapia con interferón en pacientes infectados por el virus de la hepatitis C la capacidad de la desgranulación de las células NK periféricas es más fuerte en los primeros respondedores que en los no respondedores 4. El número de células NK (&gt; 80 / l) en el día 15 después del trasplante autólogo de células madre (autoSCT) en pacientes que padecen linfoma o mieloma múltiple son predictivos de la progresión de una mejora de la supervivencia global y libre de 5. En pacientes con melanoma la expresión de la célula T immunoglobulin- y mucina-dominio-containing molécula-3 (TIM-3), una proteína inmunorreguladora en las células NK, se correlaciona con la etapa de la enfermedad y el pronóstico 6. Los científicos han monitoreado funciones de las células NK en las últimas décadas. El análisis inicial de la citotoxicidad de las células NK contra las células tumorales sin imprimación previa se abordó usando un ensayo de liberación de 51Cr 7. Más recientemente, los científicos desarrollaron un método no radiactivo para evaluar la citotoxicidad de las células NK expandido 8. La producción de citocinas y quimiocinas se ha evaluado con frecuencia usando el ensayo de inmunoabsorción (ELISA) técnicas ligados a enzimas 9,10. Durante las últimas décadas estos métodos han sido complementados por ensayos basados ​​en citometría de flujo. El uso de inhibidores de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y la monensina) y los métodos de permeabilización de células en combinación con protocolos de tinción de superficie convencionales han permitido a los científicos estudiar de quimioquinas y la producción de citoquinas en diferentes linfático específicosubconjuntos ocyte (por ejemplo, T, B o células NK) 11. Por otra parte, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se han desarrollado para monitorizar T y NK citotoxicidad de las células. En 2004 Alter et al. Describe la expresión en la superficie de la proteína asociada a lisosoma CD107a (Lamp1) en las células NK en encuentro célula diana como un marcador para la desgranulación de gránulos citotóxicos 12. Dado que una amplia gama de diferentes fluorocromos y citómetros de flujo de múltiples canales están disponibles en nuestros días, se ha hecho posible para monitorear simultáneamente diversas funciones de las células NK (citotoxicidad, producción de citoquinas y quimioquinas) en diferentes subconjuntos de células NK. Esto es especialmente importante en situaciones donde el tamaño de la muestra es limitado, por ejemplo, en las biopsias o muestras de sangre de pacientes que sufren de leucopenia. Para probar las funciones globales de células NK, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se pueden combinar de manera eficiente. Theorell et al. Las células NK estimuladas de headonantes lthy con la línea de células tumorales K562 y analizada la producción desgranulación de las células, y la señal de quimiocina de dentro a fuera NK a través de citometría de flujo 13. Recientemente subgrupos de células NK, fenotipos y funciones en pacientes con tumor durante autoSCT se analizaron mediante citometría de flujo ensayos basados. Se demostró que las células NK fueron capaces de degranulación y producir citocinas / quimiocinas sobre el reconocimiento de células tumorales en puntos de tiempo muy tempranos después de autoSCT 11. Aquí se describe un protocolo para evaluar las funciones de células NK tras la interacción con las células tumorales, incluyendo la capacidad de la desgranulación, quimioquinas y la producción de citoquinas utilizando un flujo ensayo basado en citometría-que hace que sea posible controlar las funciones de las células NK en diferentes subconjuntos de forma simultánea.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 + glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>6187-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de fondo redondo</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal para terneros</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>inactivado por calor antes de usar</td></tr><tr><td>Matraz en T</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690195</td><td></td></tr><tr><td>K562 tumor línea celular</td><td>DSMZ GmbH</td><td>ACC 10</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK)</td><td>fabricado</td> <td>internamente/</td><td>los componentes se enumeran en el texto</td></tr><tr><td>Agua destilada: Ampuwa Sp&uuml; ll&ouml; sung 1.000 ml Plastipur</td><td>Fresenius Kabi 1088813</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40R Centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tubos colectores de sangre</td><td>Sarstedt</td><td>386453</td><td>S-Monovette 7,5 ml, K3EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Medios hematopoyéticos (XVIVO)</td><td>Lonza Group Ltd</td><td>BE04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>suero humano</td><td>DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M&nbsp;</td><td>/</td><td>donantes sanos con grupo sanguíneo AB; calor inactivado antes</td></tr><tr><td>de usar Cámara de recuento mejorada por Neubauer, línea brillante</td><td>Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.</td><td>0640030/ 1110000</td><td></td></tr><tr><td>solución de azul de tripano (0,4%)</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético al 3% con azul de metileno</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Pozos Microplacas transparentes con fondo en V tratadas con TC Corning</td><td>&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 Pozo Fondo Redondo Sin Tratar Microplacas</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>351177</tr><tr><td>DPBS (Ca2+- y Mg2+-free)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>524400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomicina&nbsp;</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1566-5</td><td></td></tr><tr><td>interleucina 15 (IL-15)</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (IL-2)&nbsp;</td><td>Novartis Pharma</td><td>730523</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Stop, Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene monensina)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Este producto se puede utilizar en combinación o en lugar de Golgi Plug. Hay que probar la mejor combinación para el entorno experimental deseado.</td></tr><tr><td>Golgi Plug, inhibidor del transporte de proteínas (que contiene brefeldina A)</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>AppliChem</td><td>UN2209</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>citómetro de flujo: Canto10C</td><td>BD Biosciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de notas</td><td>Teclado de gráficos Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Separador</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-308</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress NK kit de aislamiento</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-185</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Kit de depleción de eritrocitos, humano</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-196</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos MACSmix&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300412</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD3 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560366</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 PerCP</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-094-969</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD16 PE</td><td>Biolegend</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD16 PerCP</td><td>Biolegend</td><td>302029</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302216</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD19 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560353</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD45 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563204</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD56 FITC</td><td>Biolegend</td><td>345811</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD107a PE</td><td>Biolegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IFN-& gamma; AF-647</td><td>BD Biosciences</td><td>557729</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano MIP-1 y beta; APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>561280</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Kit de viabilidad reparable</td><td>Biolegend</td><td>423113</td><td>marcador de células muertas fijable</td></tr></tbody></table>

ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células nk

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Las células asesinas naturales (NK) son una parte importante del sistema de vigilancia inmunitaria de tumores humanos. Las células NK son capaces de distinguir entre células sanas y células infectadas por virus o transformadas malignamente debido a un conjunto de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal. Tras el reconocimiento de virus o células tumorales, se inician una variedad de funciones diferentes de las células NK, incluida la citotoxicidad contra la célula objetivo, así como la producción de citocinas y quimiocinas que conducen a la activación de otras células inmunitarias. Se ha demostrado que las funciones precisas de las células NK son cruciales para el resultado del tratamiento de diferentes infecciones virales y enfermedades malignas. Aquí se describe un método simple y confiable para analizar diferentes funciones de las células NK utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Las funciones de las células NK se pueden evaluar no solo para toda la población de células NK, sino también para diferentes subconjuntos de células NK. Esta técnica permite a los científicos estudiar fácilmente las funciones de las células NK en donantes o pacientes sanos con el fin de revelar su impacto en diferentes neoplasias malignas y descubrir nuevas estrategias terapéuticas.

<html> La estrategia gating para analizar la desgranulación, citoquinas y quimioquinas producción de toda la población de células NK y tres subconjuntos de células NK diferentes se ilustran en la Figura 1. Los resultados representativos de un donante sano se ilustran en la Figura 2. Las células NK sin ningún estímulo ni producen IFN-γ ni MIP-1β y no expresaron CD107a en su superficie (F...

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las funciones de las células asesinas naturales utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Las células asesinas naturales son cruciales para el resultado de diversas infecciones virales y enfermedades malignas. Para monitorear mejor las funciones de las células asesinas naturales, nuestro laboratorio ha perfeccionado aún más un ensayo basado en citometría de flujo que puede utilizarse tanto en investigaciones científicas como en evaluaciones clínicas.Optimizamos el protocolo para permitir el análisis de muestras pequeñas de células NK, lo cual es esencial para su uso en pediatría y en pacientes inmunodeficientes. Una ventaja adicional de esta técnica es la posibilidad de medir las funciones de las células NK no solo dentro de la población total de células NK, sino también en diferentes subpoblaciones de células NK. Para aislar las células NK, comience mezclando el volumen adecuado de la solución de cóctel de aislamiento de células NK con seis a 10 mililitros de sangre periférica total con EDTA de un paciente mediante varias inversiones.A continuación, homogenice aún más la muestra en un rotador de tubos durante cinco

flow-cytometry-based-assay-for-the-monitoring-of-nk-cell-functions

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

La evasión de la erradicación mediada por células mortales por asesinos naturales (NK) por las células cancerosas es importante para la iniciación y progresión del cáncer. Aquí, presentamos dos protocolos no basados en la radiactividad para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK hacia las células tumorales hepáticas. Además, se presenta un tercer protocolo para analizar la migración de células NK.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

Presentamos dos diversos protocolos de coloración para la detección del ligand de NKG2D (NKG2DL) en muestras agudas primarias humanas de la leucemia mieloide (AML). El primer enfoque se basa en una proteína de fusión, capaz de reconocer todos los ligandos conocidos y potencialmente desconocidos, mientras que el segundo protocolo se basa en la adición de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.

Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a analizar funciones de células NK mediante citometría de flujo optimizada para muestras pequeñas. Este método permite evaluar degranulación y producción de citoquinas en pacientes pediátricos e inmunodeficientes.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

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