Name: חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: למד לעקוב אחר שלבי הפגוציטוזה המוקדמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת הכניסה של פתוגנים לתאי מארח בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים וונדי סלמון וניקי ווטסון של מתקן קק בבית וייטהד מכון MIT הדמיה.

1. הכנת DC2.4 ו- RAW 264.7 שורות תאים הערה: שורת התאים דמוי מקרופאג RAW 264.7 ואת DC2.4 שורת תאים דנדריטיים הוא ממוצא בעכברים, ואת התנאים הבאים שמשו לגדל את התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול RAW 264.7 תאי DMEM (המדיום של הנשר המינימאלי של Dulbecco) בתוספת 10% בסרום שור עוברי מומת (FBS) על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים DC2.4 בתנאים דומים לזה של תאי 264.7 RAW, למעט שימוש RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני בתוספת L- גלוטמין במקום DMEM. </li></ol> 2. הכנת חלקיקים מצומדת פלורסנט: ג אלביקנס, Zymosan, חרוזים IgG מצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול קנדידה אלביקנס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן SC5314 זן ג אלביקנס ממלאי גליצרול קפוא ב 25 מ&quot;ל של YPD השלימו עם אורי (2% Bacto-peptone, 1%תמצית שמרים, גלוקוז 2% ו -80 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​uridine) לילה ב 30 מעלות צלזיוס. הערה: הימנע גדל בתרבות קנדידה יותר OD של 600 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מ&quot;ל של ג אלביקנס ומסובב אותו XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הכדור על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) של ג אלביקנס ביחס למספר פגוציטים והמשך עם assay phagocytosis כמתואר בסעיף 3. OD 600 של 1 שווה 2.5 x 10 7 קנדידה אלביקנס לכל 1 מ&quot;ל. הערה: הדור של קנדידה-BFP מתואר הפניה 13. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Zymosan וחרוזים מצופים IgG הערה: Zymosan הוא β-גלוקן המכילהכנה חלקיקי הפחמימות פטרייתי כי נגזר שמר האפייה. Zymosan ידוע לעורר אותות דלקתיים מקרופאגים ותאים דנדריטיים, וזה כבר נעשה שימוש נרחב במחקרים phagocytosis 13, 14, 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת הצינור שמכיל את החלקיקים, ו aliquot סכום מספיק עבור ניסוי לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הערה: בדרך כלל אנו משתמשים 1:10 יחס (עבור תא אחד, להוסיף 10 חלקיקי zymosan או חרוזים מצופים IgG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של קרח קר PBS, לאסוף את חלקיקי על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב g 10,000 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2.2-2.2.3 הערה: עבור לשלב 2.2.5 או לאחסן את הצינור ב 4 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate חלקיקים במשך 10 שניות ב sonicator באמבטיה קולי (120 וולט, 50-60 kHz) על מנת למנועאגרגציה NY. </li></ol></li></ol> 3. Phagocytosis הערה: Phagocytosis הוא תהליך מורכב שמתחיל המחייב של חלקיקים על פני התא של פגוציטים באמצעות אינטראקציה של PRRs עם ליגנדים על פני השטח של החלקיקים. כריכה ואחריו הרכבה של אקטין וחלבונים הקשורים אליו באתר של מגע, לבין היווצרות של כוס phagocytic. הפירוק יקטין העוקבות מתרחש בבית phagosome ותוצאות לבליעה המלאה של החלקיקים. להלן נתאר את השלבים השונים של phagocytosis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay כריכה הערה: מטרת ניסוי זה היא לפקח על הצעד הראשון של phagocytosis המערב את האינטראקציה בין הליגנדים על חלקיקי היעד ואת הקולטנים על פגוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. Alternatively, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או 96-גם צלחות זכוכית תחתונה. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer או בטכניקה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את השקף הקאמרי (או צלחת) ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את המדיום מבאר כל בעזרת פיפטה או aspirator. זהירות: בצע פעולה זו בזהירות כמו גם כל מערכת coverglass חדרים קטן; קל לטרוד תאים עם קצה פיפטה או זרימת אוויר חזקה של aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חלקיקים שכותרתו fluorescently עם תרבית תאים בינוניים (מוכן כמתואר לעיל). להוסיף קנדידה -BFP (ב משרד הפנים של 10), fluorescently מצומדות-zymosan או לטקס חרוזים ארנב IgG-FITC (10 חלקיקים לכל תא) אל התאים. השתמש נפח סופי של 200 מדיה μl עבור תא אחד טוב על מנת להבטיח את כל התאים מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במורד המגלשה הקאמרית ב 277XG 3 דקות ב C ° 10. הערה: צעד צנטריפוגה זה עוזר להגדיל את הקשר בין חלקיקי התאים, והוא מסנכרן את התהליך המחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להעביר את השקופית הקאמרית חממת humidified 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השקופית הקאמרית מן החממה לשאוב התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 3x עם PBS קר כקרח. הערה: בדוק את הנוכחות של חלקיקים מאוגדים עם מיקרוסקופ אור ולשטוף יותר פעמים עם PBS במידת צורך. זה חיוני כדי להסיר חלקיקים מאוגדים מן הבאר כדי למזער את רעש ברקע במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת paraformaldehyde 500 μl 4% (PFA) מדולל PBS על ידי דוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זהירות: שלב זה מחייב שימוש של 4% PFA שהוא מאוד רעיל, מאכל, ואת קרצינוגן פוטנציאלי. זהירות פרופר צריך לקחת בעת שימוש נוזל זה. כמו כן, להגן דגימות מן האור. </li><li&gt; שוטף את התאים על ידי הוספת 500 μl של PBS לתוך התא לשאוב בעדינות את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 3.1.9 צעד פעמים. הערה: בשלב זה, למלא בקבוקון אחד מייד לאחר הסרת PBS הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את קיבעון על ידי דוגרים עם 500 μl של 50 מ&quot;מ NH 4 Cl ב PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמים עם PBS כמתואר בשלב 3.1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים ידי הוספת 250 μl חיץ מחייב (saponin 0.1%, 0.2% BSA ב PBS) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם F- אקטין על ידי הוספת phalloidin מצומדות fluorescently (מדולל 1: 500 במאגר מחייב). דגירה תאים עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS כמתואר בשלב 3.1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal (אובייקטיבי 63X, ו -402 ננומטר 488 ננומטר לייזר) ולנתח תמונות באמצעות ImageJ 16. הערה: חלקיק מוצלח כריכה מאופיין בנוכחות של מ&quot;ק phagocyticp באתר שבו קשר חלקיקי התא phagocytic (איור 1). ראה שלב 3.2.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phagocytosis Assay הספיגה הערה: ניסוי זה נועד לפקח על ההפנמה המלאה של חלקיקים שכותרתו fluorescently ידי פגוציטים באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. לחלופין, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או זכוכית תחתונה 96-גם צלחות. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer או בטכניקה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את השקופיות הקאמריות (או צלחת) ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: הקירור הוא הכרחי על מנת לחסום אנדוציטוזה וכן phagocytosis הרצויה, ולאחר מכן יש phagocytosis מסונכרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfצעדי ORM מ 3.1.3 ל 3.1.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השקופית הקאמרית חממת humidified 37 ° C עם 5% CO 2, דגירה במשך בנקודות זמן שונות. תקן תאים לאחר 30, 60 ו -90 דקות שלאחר זיהום. שים לב ג אלביקנס מתחיל להיוצר עובש בבית הזיהום שלאחר 60 דקות; פגוציטים מתחילים להראות מוות של תאים (pyroptosis) לאחר 90 דקות 8. הערה: זוהי המלצה, ואופטימיזציה חיוני תלוי בסוג התא ואת החלקיקים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע צעדים מן 3.1.7 כדי 3.1.15. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ 16. הערה: ספיגה מוצלחת מאופיינת הפנמה מלאה של חלקיקים בתוך הציטופלסמה של תָא בַּלעָן (איור 2). מכתים את פגוציטים בטוש פני התא כגון phalloidin מסייעת להתוות את קווי המתאר של תאים. כמו כן הוא חיוני לבצע ערימות z כדי לקבוע אם החלקיקים מאוגדים פני תא או Completely הפנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חיה של Phagocytosis הערה: בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ confocal ללכוד את השלבים השונים של phagocytosis באמצעות fluorescently מצומדות zymosan. אנו משתמשים שורת תאים דנדריטיים DC2.4 ביציבות מבטא mCherry-tagged F- אקטין 8, biosensor כי התפלגות אקטין פילמנטיות בתאים חיים. מאז phagocytosis היא תהליך אקטין מונחה הדמיה חיה בתא הזה לא רק מאפשר לנו ללכוד את התנועה והדינמיקה של רשת ה- F- אקטין, אבל גם לדמיין את האירועים phagocytic שונים בתוך תאים חיים (איור 3, סרט 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית בריכוז כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer אובטכניקה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את השקופיות הקאמריות על קרח למשך 10 דקות. הערה: הקירור הוא הכרחי על מנת לחסום ספיג רצוי, וכדי לקבל phagocytosis מסונכרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו צעדים מן 3.1.3 כדי 3.1.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את הבמה מיקרוסקופ כדי 37 מעלות צלזיוס, לאזן את החדר עם 5% CO 2. מתן 30-45 דקות עבור הטמפרטורה ואת CO 2 לייצב לפני תחילת ההדמיה. הערה: מאז CO 2 רמות הטמפרטורה הן קריטיות עבור phagocytosis, חשוב להדליק את החימום מיקרוסקופ לפני הניסוי כדי לאזן את בתא סביבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שקף התא המכיל את התאים במארז חממת מיקרוסקופ equilibrated על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהופעה חיה הדמיה 17, 18. הערה: ההגדרות עבור כוח לייזר (רווח, חריר, וכו &#39;) יכול להשתנות בהתאם לסוג של המיקרוסקופ אלקטרוני ו בדיקה ניאון בשימוש. לכן, אנו ממליצים להתייעץ במדריך של המיקרוסקופ למצב אופטימלי עבור הדמיה לחיות שלך 17,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ סורק לייזר confocal (ואת התוכנה הנלווית) עבור הדמיה לחיות. השתמש אובייקטיבי שמן 63X 1.4NA עם חריר של 1-1.1 יחידות אווריריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את ההדמיה, השתמש בשדה הבהיר למצוא באזור נציג בשקופית הקאמרית. לאחר מכן, בחר את השדה על ידי לחיצה על אפשרות מיקום על התוכנה. כדי לזהות GFP ב Track 1 השתמשה במערכת סינון עבור לייזר 488 ננומטר עם קרן splitter ב 582 ננומטר, לגלות אורכי-גל בין 488 ו 582 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסלול 2 לבחור לסנן להגדיר אופטימלי עבור mCherry (RFP) באמצעות מפצל קרן 578 ננומטר גילוי באורכי גל שבין 578 ו -600 ננומטר. השתמש 488 ננומטר 578 nm לייזרים עם כוח לייזר 50% וכן פלט רווח של 600-700. להשיג תמונות כל 30 שניות עבור סכום כולל של 90 דקות. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

פגוציטים מקצועי, כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים, לבלוע ולחסל פולשים פתוגנים ולכן עושה phagocytosis מרכיב חשוב של מערכת ההגנה המארחת. במהלך תהליך זה פגוציטים לעבור ארגון מחדש קרום נרחב התארגנות cytoskeleton ב פני התא שלהם 8, 19, 20. כדי להבין טוב יותר בתהליך דינמי זה, ויזואליזציה של השלבים השונים של phagocytosis חיונית. כאן אנו תארנו שיטה מבוססת מיקרוסקופ ששמש כדי לפקח על השלבים השונים של ...

למרות החשיפה הממושכת פתוגנים כגון חיידקים, וירוסים ופטריות, הגוף שלנו הוא מאובזר עם מנגנון החיסון המספקים הגנה מפני זיהום. מערכת החיסון המולדת היא קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים פולשים והוא מסתמך בעיקר על תאי phagocytic שמזהים ולהפנים יעדים זרים. Phagocytosis היא תהליך הסלולר שמור באבולוציה שמקיף לבליעת חלקיקים לא רצויים יותר מ -0.5 מיקרומטר. תאי Phagocytic להביע מגוון רחב של קולטני חיסון (הידוע גם בשם קולטנים זיהוי תבניות, PRRs) על פני התא המאפשרים להם לזהות דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) בהווה על פתוגנים לפני היבלעות 3. פתוגן כריכה ואחריו אשכולות קולטן על פני התא ומפעיל היווצרות כוס phagocytic. התוצאה היא שיפוץ קרום מונחה יקטין שבולט סביבהמטרה, בסופו של דבר שעוטפת אותו ולצבוט פעמיים לגבש vacuole 2 דיסקרטי phagosomal, 5. Phagosome אז מתבגר acidifies ידי ההיתוך הבא עם endosomes מאוחר lysosomes המהווה phagolysosome 6. למרות phagocytosis מתואר אירוע קולטן בתיווך מונחה תקטין, תהליך זה מסתמך גם על שינוי מרחבית-טמפורלית של שומנים שמרכיבים קרום הפלזמה, כגון phosphoinositides (חוקרים פרטיים) ו ספינגוליפיד 7, 8. בעוד פילמור אקטין מוכתב על ידי הצטברות מקומית של phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI (4,5) P 2) בבסיס של כוס phagocytic, depolymerization אקטין תלוי המרה של (PI (4,5) P 2 עד phosphoinositol-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. שני שינוייםהם חיוניים כמו המוביל לשעבר הרחבה מוצלחת של pseudopods סביב המטרה ואת האחרונה מאפשרת שוקעת של חלקיקי cytosol של תָא בַּלעָן 10. תאים שיש להם את היכולת phagocytose הם או phagocytes מקצועי, כמו מקרופאגים / מונוציטים, גרנולוציטים / נויטרופילים, ותאים דנדריטיים (DCS) או phagocytes מקצועיים, כגון פיברובלסטים ותאי אפיתל 11. Phagocytosis מבוצע על ידי כל פגוציטים מלא תפקיד מרכזי תחזוקת רקמות שיפוץ, בעוד phagocytosis מבוצע על ידי פגוציטים מקצועי אחראי על התיאום של התגובה החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות נגד פתוגנים. פגוציטים מקצועי לא לבלוע רק ולהרוג את הפתוגן, אלא גם אנטיגנים ההווה אל תאי הלימפה של המערכת החיסונית אדפטיבית. זה תורם לשחרור הפרו דלקתי ציטוקינים להתקשרות של תאי הלימפה, ועל כך באהמצור המוצלח של זיהום 12. טכניקות ביוכימיות קונבנציונליות כבר סייעו צובר ידע לגבי המנגנון המולקולרי של תהליכים תאיים שונים במהלך phagocytosis, כגון שלאחר translational שינויים ואגודים גבוהה זיקה שונה בין חלבונים. עם זאת, קשה לקבל מידע לגבי הדינמיקה במרחב ובזמן של אירועי phagocytic בשיטות ביוכימיות הקונבנציונליות. הדמית תא חי לא רק מאפשרת לנו לפקח אירועים הסלולר באופן בתקופה רגיש אלא גם מאפשרת לנו לקבל מידע ברמת תא בודד. כאן אנו מתארים שיטה לחקור את השלבים השונים של phagocytosis, וכן לנתח את התהליך כולו spatiotemporally באמצעות מיקרוסקופ confocal.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דילקטט)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Minimal Eagle' s בינוני)</td> <td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (פוספט חומצי מלח</td>) <td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי לטקס מצופים IgG מצמד FITC</td><td>קיימן</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td> <td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד (4% ב-PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 תאים</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (מכון הזיכרון של רוזוול פארק)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפן (0.4% (w/v) ב-PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps תמיסת דטרגנט</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 בורוסיליקט מערכת כיסוי זכוכית (8 תאים)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 עם רשתות</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

חזותי בשלבים המוקדמים של phagocytosis

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

בגופם של יונקים מצויד שכבות שונות של מנגנוני המסייעים להגן על עצמה מפני פלישות הפתוגן. פגוציטים מקצועי של המערכת החיסונית - כגון נויטרופילים, תאים הדנדריטים, מקרופאגים - לשמר את היכולת המולדת לזהות ולנקות כגון פתוגנים פולש דרך phagocytosis 1. Phagocytosis כרוך האירועים כוריאוגרפיה של ארגון מחדש הממברנה שיפוץ אקטין על שטח פני התא 2, 3. Phagocytes בהצלחה להפנים ולמגר מולקולות זרות רק כאשר כל שלבי phagocytosis מתמלאים. צעדים אלה כוללים הכרה ומחייבת של הפתוגן על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) המתגורר על פני התא, היווצרות של כוס phagocytic באמצעות בליטות קרומיות מועשר תקטנה (pseudopods) להקיף את החלקיקים, וכן פרדה של phagosome ואחריו התבגרות phagolysosome כי תוצאותהרג של הפתוגן 3, 4. הדמיה וכימות של שלבים שונים של phagocytosis היא אינסטרומנטלית הבהרת המנגנונים המולקולריים של תהליך הסלולר זה. כתב היד הנוכחי מדווח שיטות ללמוד את השלבים השונים של phagocytosis. אנו מתארים גישה מבוססת מיקרוסקופ כדי לחזות ולכמת היווצרות הכוס המחייבת, phagocytic, והפנמת החלקיקים ידי פגוציטים. כפי phagocytosis מתרחשת כאשר קולטנים מולד על תאי phagocytic נתקלים הליגנדים על חלקיק יעד גדול מ -0.5 מיקרומטר, המבחנים אנו מציגים כאן מהווים את שימוש קנדידה אלביקנס פטריות פתוגניות וחלקיקים אחרים כגון zymosan וחרוזים מצופים IgG.

בשיטה המבוססת על מיקרוסקופ כדי לפקח על השלבים השונים של phagocytosis מוצגת. האירועים השונים במהלך phagocytosis של חלקיקים שונים ניאון על ידי תאי DC2.4 מוצגים. באמצעות הטכניקות המתוארות כאן, חקרנו את תפקיד ספינגוליפיד בשלבים המוקדמים של phagocytosis. לשם כך, תאים דנדריטים DC2.4 גנטית חסר Sptlc2, האנזים המזרז את הצעד הראשון ומגביל הקצב במסלול biosynthetic ספינגוליפיד, שימשו. לעומת תאי סוג ברים, Sptlc2 - / - תאי DC2.4 צמצמו באופן משמעותי רמת ספינגוליפיד כולל ceramide, ספינ...

כאן אנו מתארים טכניקה מבוססת מיקרוסקופ כדי להמחיש ולכמת את מפלי האירועים המוקדמים במהלך פגוציטוזיס של פתוגנים כגון הפטריות קנדידה אלביקנס וחלקיקים הגדולים מ-0.5 מיקרומטר כולל חרוזים מצופים זימוזאן ו-IgG.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

מטרת העל של טכניקה זו היא לנטר את השלבים השונים של פגוציטוזיס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין פתוגנים. בעיקר כדי להבין כיצד פתוגנים נכנסים לתאי המארח במהלך הזיהום.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה ומאפשרת לנו לקבל מידע על תא הנגיף של האירועים שלנו המתרחשים במהלך פגוציטוזיס בצורה רגישה לזמן. כדי להתחיל, הכן את הזימוזאן המצומד פלואורסצנטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. יום קודם לכן, זרעו בערך חמש פעמים 10 לתאי DC 2.4 הרביעיים בשקופית תא, כך שהבארות יהיו 60 עד 70% מתכנסות בזמן הניסוי.לאחר שהתאים נמצאים בצפיפות מתאימה, הנח את שקופית התא על 10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. קירור התאים הכרחי כדי לחסום אנדוציטוזיס כמו גם מתי להחליף ציטוזיס. ובהמשך לקבל פגוציטוזיס מסונכרן.לאחר מכן, הסר בעדינות את המדיום מכל באר באמצעות פיפטה או שואב. לאחר מכן, מערבבים את הזימוזאן המצומד פלואורסצנטי עם מדיום תרבית תאים בריבוי של זיהום של 10. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום לכל תא היטב כדי להבטיח שכל התא מכוסה.לאחר מכן סובב את מגלשת התא כדי להגדיל את המגעים בין החלקיקים בתאים ולסנכרן את תהליך ההדבקה. לאחר צנטריפוגה, העבירו את מגלשת התא לאינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2. לאחר חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הסר את מגלשת החדר

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקה לניטור אירועי פגוציטוזה עצמאיים של תאי דם אדומים בתיווך מקרופאגים (RBC). אימונוגלובולינים של עכברים G (IgG)-opsonized RBCs אנושיים מודגרים עם מקרופאגים של עכברים ונצפים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. ה-RBCs נבלעים על ידי מקרופאגים דרך היווצרות גביע פגוציטי וממוקדים לפירוק ליזוזומלי.

הדמיה בזמן אמת של מקרופאגים פגוציטוזה של תאי דם אדומים מסוג IgG

סרטון וידאו זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירת פאגוזומים במהלך פגוציטוזה בתיווך מקרופאגים של תאי דם אדומים מסוג IgG (RBCs) המחוברים לפני השטח של צלחת תחתית זכוכית. המקרופאגים מרחיבים את הפסאודופודיה סביב ה-RBCs ובולעים אותם בתוך הפאגוזומים, ומנתקים אותם מפני השטח של הזכוכית.

הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדידת ה-pH והשטח הפגוזומלי וכן את ה-pH הציטופלזמי של נויטרופילים אנושיים ועכברים באמצעות האינדיקטור היחסי seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, או S-1. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים וניתוח תמונה.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה נותר לא מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים.

חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

מחקר זה מבהיר את העיבוד הפגוציטי של חלקיקי Godanti Bhasma (GB) בתאי יונקים, ומאפיין את ספיגתם התאית, דינמיקת הוואקואול, החמצה ופירוק. ממצאים אלה לא רק מקדמים את הבנתנו את מנגנוני הפגוציטוזה הבסיסיים, אלא גם מבססים את GB כמערכת מודל מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

חקר האירועים התאיים הרציפים של פגוציטוזיס המופעלים על ידי גודנטי בהסמה בתאי יונקים

למד לעקוב אחר שלבי הפגוציטוזה המוקדמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת הכניסה של פתוגנים לתאי מארח בזמן אמת.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

גלה סרטונים נוספים