Name: Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a regular el tropismo de picornavirus mediante elementos de respuesta a microARN en el genoma viral. Este método mejora la seguridad y utilidad en virología con mínima ingeniería genética.

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Al y Mary Agnes McQuinn, la Fundación Richard M. Schulze y una subvención de ayuda de los NIH de la Clínica Mayo financiaron el trabajo representativo descrito aquí.

Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño, composición y localización de los elementos de respuesta microRNA dentro del genoma viral dictarán la orientación eficacia y especificidad. La optimización de los cuales habrá que ensayo y error. Sin embargo, el diseño racional basado en el análisis estructural del ARN y estudios previos de la replicación viral y microARN firmas auxiliares en la aplicación de esta técnica de optimización con un mínimo de 10, 11, 12,</...

El desarrollo de un método ampliamente aplicable, fácil y eficaz para la ingeniería de un vector con tropismo restringido ofrece una gran oportunidad para mejorar la seguridad, la comprensión biológica y utilidad terapéutica de los virus. Existen varios mecanismos para orientar tropismo viral incluyendo transduccional, de la transcripción, y las técnicas basadas en la traducción. Sin embargo, estos métodos no son aplicables en general a todos los sistemas de vectores, pueden requerir vías de señalización defectuosos en las células diana o requerir la inserción de grandes secuencias de codificación en el genoma viral. Además, estos métodos pueden dar lugar a la atenuación del virus, lo que dificulta considerablemente su actividad terapéutica y la limitación de penetración en el sistema sin modificar. Los microARN son pequeñas (22-25 nucleótidos), los ARN no codificantes que median el silenciamiento de genes en células eucariotas. Los microARN función de secuencias diana complementarias (elementos de respuesta) en unión a ARN mensajeros (ARNm) resultadoi<html> ng en la desestabilización transcripción, la degradación o la represión de traducción. MicroARNs normalmente se unen elementos de respuesta con complementariedad parcial y producen pequeñas modificaciones en la expresión génica 1, 2, 3, 4, 5. Más alteraciones significativas en la expresión génica se puede lograr mediante el aumento de la complementariedad del elemento de respuesta a 6. Miles de microRNAs maduros se han identificado en una variedad de especies y muchos patrones de expresión diferenciales de exposiciones en una variedad de tipos de células y tejidos 7, 8, 9. Estas firmas de microARN pueden ser explotados para la restricción específica de la célula de amplificación de virus mediante la incorporación de elementos de respuesta perfectamente complementarias en el genoma viral 10,= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13. El objetivo general de esta técnica microRNA objetivo es controlar el tropismo de un genoma vector sin atenuación adicional. La utilidad de este método para regular el tropismo viral se demostró originalmente en vectores lentivirales para restringir la expresión del transgén en tejidos específicos 14, 15, 16. Esta técnica posteriormente se ha aplicado a una amplia gama de replicarse y no replicante vectores virales para la terapia génica mejorada, así como para mejorar los perfiles de seguridad de muchos virus oncolíticos mediante la eliminación de las toxicidades no deseadas en los tejidos normales 10, 11, 12, 13, 17 . También se ha utilizado para generar seguro y evacunas vivas atenuadas EFECTIVA, así como para mejorar virus y fabricación de vacunas procesos 18, 19, 20, 21. El microARN-focalización de un vector puede permitir que la atenuación en huéspedes vacunados o sistemas específicos, manteniendo los niveles de crecimiento de tipo salvaje en los sistemas de producción. MicroRNA orientación también puede utilizarse para mejorar la seguridad de la biotecnología de los virus para fines de investigación mediante la restricción de la transmisión en una especie (por ejemplo, seres humanos) mientras se mantiene la transmisión en otros huéspedes 22. Por último, microRNA orientación puede permitir el análisis en profundidad de los ciclos de vida virales y las funciones específicas de tipos de células en la patogénesis e inmunidad mediante la segregación de crecimiento viral 23, 24, 25, 26. Esta técnica ofrece una alternative método que se implementa fácilmente aplicable y la orientación para todos los sistemas de virus. Además, la colección cada vez mayor de los microRNAs maduros con los patrones de expresión diferencial en tipos específicos de células hace que esta técnica altamente versátil. la focalización basada en microARN ha demostrado su eficacia para una variedad de sistemas de virus sin comprometer la función del sistema. Las principales limitaciones de esta técnica incluyen el juicio y la optimización de error, el potencial de mutaciones de escape, y los posibles efectos fuera de la meta en transcripciones endógenos. Sin embargo, estas limitaciones se pueden superar por lo general con un diseño optimizado y racional elemento de respuesta. los virus de ARN de sentido positivo tienden a ser particularmente sensible a microRNA-orientación debido a la orientación de sentido positivo de su genoma y la disponibilidad de los transcritos a la maquinaria microRNA durante el ciclo de replicación completamente citoplasmática. Aquí se describe un protocolo para la generación de un picornavirus microRNA específico y la experimentales métodos para verificar la eficiencia y la especificidad de que la selección in vitro.

<table><tbody><tr><td>Codificación de oligonucleótidos RE</td><td>IDT</td><td>PAGE-Secuencia ultramerizada purificada</td><td>diseñada por el investigador</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos que codifican un sitio de restricción único</td><td>Secuencia IDT</td><td>25nM</td><td>diseñada por el investigador</td></tr><tr><td>Ampliar kit de PCR de alta fidelidad</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Muchos otros kits de PCR de polimerasa de alta fidelidad disponibles</td></tr> Sistema de ADN <tr><td>ligasa T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAscript</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAclear</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M</td><td>EDTA ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>sin ARNasa</td></tr><tr><td>5 M NH4 Acetato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Viene en MEGAclear Kit</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ThermoFisher Scientific BP2818100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Reactivo de transfección</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Reactivo de transfección</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; M filtro de jeringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubos con tapón de rosca</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA Imita Dharmacon</td><td>Ensayo</td> de <td></td> proliferación celular MTT variado <td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación DH5&alpha; Células competentes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vectores</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variable (p. ej. 212205)</td><td>Existen diferentes plásmidos con promotores T7 o T3 y sitios de clonación variables para permitir la clonación y la transcripción de ARN.</td></tr></tbody></table>

reglamento basadas en microarn de picornavirus tropismo

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

La restricción celular específica de la replicación viral sin atenuación concomitante puede beneficiar el desarrollo de vacunas, la terapia génica, la viroterapia oncolítica y la comprensión de las propiedades biológicas de los virus. Existen varios mecanismos para regular el tropismo viral, sin embargo, tienden a ser específicos de la clase de virus y muchos resultan en la atenuación del virus. Además, muchos virus, incluidos los picornavirus, presentan limitaciones de tamaño que no permiten la incorporación de grandes cantidades de material genético extraño necesario para algunos métodos de focalización. Los microARN son ARN cortos y no codificantes que regulan la expresión génica en las células eucariotas mediante la unión a secuencias diana complementarias en los ARN mensajeros, evitando su traducción o acelerando su degradación. Diferentes células exhiben firmas de microARN distintas y muchos microARN sirven como biomarcadores. Estos patrones de expresión diferencial se pueden aprovechar para restringir la expresión génica en células que expresan microARN específicos mientras se mantiene la expresión en células que no lo hacen. En lo que respecta a la regulación del tropismo viral, se incorporan al genoma viral secuencias complementarias a microARN específicos, generalmente en las regiones no codificantes 3', dirigiéndose a su destrucción en presencia de los microARN afines, evitando así la expresión y/o replicación de genes virales. La segmentación por microARN es una técnica que, en teoría, puede aplicarse a todos los vectores virales sin alterar la potencia del virus en ausencia de los microARN correspondientes. En este trabajo describimos los métodos experimentales asociados a la generación de un picornavirus dirigido a microARN y evaluamos la eficacia y especificidad de dicho picornavirus in vitro. Este protocolo está diseñado para un virus que se replica rápidamente con un ciclo de replicación lítico, sin embargo, la modificación de los puntos de tiempo analizados y las lecturas específicas de titulación de virus utilizadas ayudarán en la adaptación de este protocolo a muchos virus diferentes.

Tabla 1 representa los resultados típicos de un ensayo de valoración para un picornavirus y describe cómo calcular la dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50%. Una representación esquemática del concepto general de la regulación basada en microRNA del tropismo viral se describe en este manuscrito se muestra en la figura 1. La orientación de microRNA a elemento de respuesta durante las interacciones intracelulares, un diseño adecuado de oligonucleótidos...

Describimos aquí un método para regular el tropismo de picornavirus mediante la incorporación de secuencias complementarias a microRNAs específicos en el genoma viral. Este protocolo se puede adaptar a todas las diferentes clases de virus con modificaciones basadas en la duración y la naturaleza de su ciclo de vida.

Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

El objetivo general de los siguientes experimentos es evaluar la eficiencia y especificidad de la regulación basada en microARN sobre el tropismo de picornavirus in vitro. Esto se logra preparando picornavirus que codifican elementos de respuesta a microARN en su genoma. Como segundo paso, utilice los virus para infectar células que expresen o no expresen los microARN correspondientes.Luego, evalúe la cinética de replicación viral, la propagación y la toxicidad para determinar la eficiencia y especificidad del direccionamiento. Este método de direccionamiento puede utilizarse en el campo de la virología para mejorar la seguridad, la producción y la utilidad de los virus, o para facilitar la investigación centrada en comprender los procesos biológicos implicados en una infección viral. Las principales ventajas de esta técnica son que requiere una ingeniería mínima del genoma viral y que es altamente versátil debido a que se han identificado un número significativo de firmas de microARN celulares.Para comenzar este procedimiento, siembre las células permisivas en una placa de 96 pocillos con medio de crecimiento completo. Añada medio sin suero y sin virus a la fila uno y a la fila 12

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma colección de cDNA clonado utiliza para identificar los genes miARN objetivos. Aquí nos demuestran su uso y aplicación.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y se ha demostrado que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. Para comprender mejor las interacciones entre UTR miRNA, hemos creado una colección de todo el genoma de tres periodistas UTR luciferasa se combina con un nuevo gen de luciferasa y reactivo de ensayo, el sistema de interruptor.

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Fuente: Ruiz, A. J. y Russell, S. J. Regulación basada en microARN del tropismo del picornavirus. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el uso de análogos sintéticos de microARN para inhibir selectivamente la replicación viral en células epiteliales cultivadas. Destaca cómo el silenciamiento del genoma dirigido por microARN puede bloquear la diseminación del virus y confirmar la especificidad del direccionamiento mediante análisis de infectividad posterior.

Evaluación de la inhibición de la propagación viral mediante el silenciamiento del genoma mediado por mímicos de microARN

En este trabajo proponemos una estrategia para estudiar el efecto de un factor de transcripción de interés en el transcriptoma de microARN utilizando datos disponibles públicamente, recursos computacionales y datos de alto rendimiento de matrices de microARN después de transfectar células con ARN de horquilla pequeña (sh)dirigido a un factor de transcripción de interés.

Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

RNA de doble hebra producido durante la replicación de virus de ARN puede ser reconocido por los receptores de reconocimiento de patrón para inducir una respuesta inmune innata. Virus de ARN de sentido negativo, la interacción entre el bajo nivel dsARN y PRRs sigue siendo confusa. Hemos desarrollado un método de microscopia confocal para visualizar arenavirus dsARN y PRR en células individuales.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a regular el tropismo de picornavirus mediante elementos de respuesta a microARN en el genoma viral. Este método mejora la seguridad y utilidad en virología con mínima ingeniería genética.

Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo

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