Name: 分流手术，右心导管，血管形态计量学在大鼠模型中的流量引起的肺动脉高压 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习在大鼠模型中建立分流手术诱导的肺动脉高压，并通过右心导管和血管形态计量学评估血流动力学与组织学终点。该方法模拟人类肺动脉高压特征，为转化医学研究提供可靠平台。

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本研究由荷兰心血管研究倡议、荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰健康研究与发展组织以及荷兰皇家艺术与科学学院（CVON 编号 2012-08，PHAEDRA，Sebald 基金，Stichting Hartekind）资助。

涉及动物受试者的实验程序已获得荷兰中央动物实验委员会及格罗宁根大学医学中心动物护理委员会（NL）的批准。实验使用了体重在180至300克之间的Wistar和Lewis大鼠。
1. 动物饲养与适应
<ol>
	<li>到达中心动物房后，将大鼠以每笼5只进行群养。在为期7天的适应期期间，使大鼠适应人为操作，但不得进行任何实验操作。</li>
</ol>
2. 无菌野百合碱的制备与注射
<ol>
	<li>配制 1 mL 浓度为 60 mg/mL 的野百合碱（MCT）溶液时，称取 60 mg 野百合碱置于 2-mL 离心管中。加入 700 µL 的 0.9% NaCl 溶液，再加入 200 µL 的 1 M HCl。将离心管置于热水下温育并涡旋混匀。使用 6 N NaOH 将溶液 pH 调至接近 7.0。为啮齿类动物注射制备 MCT 溶液时，须采用无菌操作技术。</li>
	<li>按每千克体重皮下注射 1 mL 无菌的 60 mg/mL MCT 溶液（例如，300 g 大鼠注射 0.3 mL 的 60 mg/mL MCT）。注意：我们不推荐使用更小的注射体积，因为可能导致给药剂量不准确。</li>
</ol>
3. 腔静脉-主动脉分流手术
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>用5%异氟烷/100%氧气充满诱导室2 （流速：1 L/min）并将大鼠放入麻醉舱内。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。称量大鼠体重。</li>
		<li>剃除并清洁腹部约8 cm长、3 cm宽的区域。将大鼠仰卧置于加热垫上（37 °C) 覆盖无菌垫</li>
		<li>将动物鼻部置于通风面罩/罩中，通入 2 - 3% 异氟烷/100% 氧气2 （流速：1 L/min）。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分流手术
	<ol>
		<li>用氯己定擦拭皮肤进行消毒。皮下注射0.01 mg/kg布托啡诺，用于术后镇痛。</li>
		<li>使用无菌器械进行手术。用10号手术刀片在腹部正中线做切口，起始于膈肌下方1 cm处，向下延伸至接近外生殖器上方。</li>
		<li>用棉签轻轻抬起肠道，以无菌湿纱布（0.9% NaCl）覆盖肠道，并将其置于动物左侧。</li>
		<li>使用棉签分离将腹主动脉和下腔静脉与周围组织相连的膜。 
		注意：不要解剖主动脉与下腔静脉之间的膜。</li>
		<li>使用劈裂镊子，仅在主动脉分叉上方的主动脉右侧、即穿刺针将要插入的位置，去除血管周围脂肪组织。</li>
		<li>使用棉签在穿刺针插入部位上方2 mm处分离主动脉和下腔静脉，以腾出空间放置Biemer钳。</li>
		<li>在此区域，先在主动脉周围放置一根松紧适度的结扎线（5-0 缝线）。通过在结扎线上夹持一把柯赫钳（Kocher clamp）以施加张力，然后将柯赫钳置于切口上方图1A）。将Biemer钳置于结扎线稍上方（图e 1A).</li>
		<li>使用棉签尽可能远端地压迫腔静脉以阻断血流（图1A）。将一根针头（本方案中使用18 G针头）弯成45度角，针尖朝向外侧（图1A).</li>
		<li>以90度角将针插入主动脉分叉上方，针孔朝向左侧图1A将针尖向左移动并插入下腔静脉。 
		注意：此时针尖应在下腔静脉中可见（图1B).</li>
		<li>使用第二根棉签将主动脉内残留的血液从插入部位推出，以防止血栓形成。用无菌纱布擦干分流管周围的区域，以便胶水能够充分粘附。</li>
		<li>将整个针头从主动脉中拔出，立即在主动脉穿刺部位滴加一滴组织胶。注意勿将棉签粘附于组织上。松开主动脉夹。</li>
		<li>通过牵拉并释放分流近端主动脉上的结扎线，手动验证分流情况。松开时，应使分流远端的下腔静脉呈现鲜红色，并在分流部位产生湍流。 
		注意：加压后会使腔静脉中的血液恢复为深红色。</li>
		<li>将肠道放回动物体内。用可吸收的4-0缝线缝合肌肉层和皮肤。以100% O₂对动物进行通气2 从麻醉中恢复 
		注意：在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>假手术
	<ol>
		<li>除将针头插入主动脉外，执行上述所有步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理。
	<ol>
		<li>将大鼠放入单独的笼子，并置于恒温箱中 37 °C 直至第二天早晨。</li>
		<li>术后约6小时，皮下注射0.01 mg/kg的布托啡诺，用于术后镇痛。若大鼠次日早晨仍表现出不适症状，可重复给药。 
		注意：术后前3天，大鼠的进食和饮水量通常会减少（当饲料或饮用水中混有药物时，这一点尤为重要）。大多数大鼠在术后3天可恢复正常行为。若未恢复，需密切观察。若1周内体重减轻超过15%，视为异常，应在麻醉状态下通过放血法处死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肺动脉高压的发展
注意：本方案中，动物在麻醉状态下通过放血以处死。

<ol>
	<li>手术后1天处死（MF8），以研究肺血流量增加后的早期细胞和功能反应例如， 基因上调或早期转录因子</li>
	<li>术后1周处死动物（MF14），以获取早期肺动脉高压血管表型（中膜肥厚，无内膜增生性病变）。</li>
	<li>术后2周（MF21）处死动物，以获取晚期肺动脉高压（PAH）血管表型（表现为明显的中膜肥厚和新生内膜形成），伴右心室压（RVP）和平均肺动脉压（mPAP）轻度升高。</li>
	<li>术后3周（MF28）处死动物，以获取终末期肺动脉高压血管表型（显著的新内膜闭塞），此时右心室压（RVP）和平均肺动脉压（mPAP）显著升高。此阶段常出现右心室功能衰竭的临床体征。</li>
	<li>第28天后处死（MF-RVF），用于肺动脉高压相关右心室衰竭（RVF）的研究，临床定义为呼吸困难、严重嗜睡和体重减轻&lt; 1周内体重减轻10%）。当出现上述任一症状时，终止实验并处死大鼠。通常大鼠在第28至35天之间出现这些症状，若不加以干预，会在此期间自发死亡。</li>
</ol>
5. 右心导管检查
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>用5%异氟烷/100%氧气充满诱导室2 （流速：1 L/min）并将大鼠放入箱中。通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。称量大鼠体重。</li>
		<li>剃除大鼠颈部右侧腹面的毛发并清洁该区域，进行超声心动图检测时，还需剃除胸部和上腹部的毛发并清洁。</li>
		<li>将大鼠仰卧放置于加热垫上（37 °C）并将动物的吻部置于通风面罩/罩内，通入 2 - 3% 异氟烷/100% 氧气2 （流速：1 L/min）。鼻部应朝向研究人员。</li>
		<li>检查麻醉深度。对于患有严重肺动脉高压（PH）的大鼠需格外小心。若心率下降，应降低麻醉深度。建议在20分钟内完成所有测量。麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声心动图检查方案
	<ol>
		<li>根据Brittain所述的方案进行超声心动图检查 等 在 JoVE 中13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管插入操作规程 
	注意：本方案使用一种刚性 导管 采用预先弯成20度角的尖端引导15 cm硅胶 导管 尖端前方2 mm处带有一个小球。20-G 针 使用其管口稍向内弯曲的插管插入右侧颈静脉（参见材料列表）。本方案适用于处于PAH进展任意阶段及对照组的大鼠。
	<ol>
		<li>用氯己定消毒颈部。使用#10手术刀片在颈部右腹侧从右锁骨至下颌骨处做一1.5 cm的切口。</li>
		<li>用剪刀展开组织。用镊子轻轻将组织分开，直至颈静脉显现。使用拆线镊剥离颈静脉周围的膜。</li>
		<li>在颈静脉周围放置一根松紧适当的结扎线（5-0 缝线）以施加张力。增加张力后，将结扎线固定于呼吸面罩上图 2A).</li>
		<li>在插入位点的下游，于血管周围放置一个松缓的结扎线，待插管插入后收紧 原位 以防止泄漏和压力损失。</li>
		<li>使用镊子的手柄将20号针头的尖端轻轻弯曲，使开口朝内，以便引导套管和导管。</li>
		<li>将20 G针头的尖端插入静脉，迅速将带有导管的套管置入血管内。拔出针头，然后结扎第5.3.4步中准备好的结扎线。</li>
		<li>将带有导管的套管插入颈静脉。套管尖端呈20度弯曲（见步骤5.3.5）。操纵套管经过锁骨下方，并稍向前推进以进入右心房。图2C).</li>
		<li>为进入右心室，将导管尖端指向左侧，朝向心脏（图 2D）。在床旁监护仪上，应出现右心室压力曲线，且与之匹配 图 2D.</li>
		<li>当右心室压力曲线稳定时，记录右心室收缩压和舒张压1（sRVP1/dRVP1）。</li>
		<li>将套管针的尖端向左上方移动。推进导管进入套管内（图 2E).</li>
		<li>将导管推进至主肺动脉（PA）。通过肺动脉瓣时不应感到阻力。 
		注意：当导管进入主肺动脉时，舒张压将升高。在床旁监护仪上，应出现肺动脉压力曲线，与之匹配 图 2E.</li>
		<li>当肺动脉（PA）压力曲线稳定时，记录肺动脉收缩压、舒张压和平均压1（sPAP1、dPAP1、mPAP1）。</li>
		<li>将导管进一步推进套管内，直至导管尖端的球囊嵌入肺动脉分支。观察床旁监护仪上的压力曲线下降，并与楔压曲线相一致 图 2F.</li>
		<li>当楔压曲线稳定时，记录收缩期、舒张期和平均楔压。</li>
		<li>缓慢回撤导管，随后测量并记录床旁监护仪上显示的 sPAP2、dPAP2、mPAP2、sRVP2 和 dRVP2 数值。</li>
		<li>当导管位于右心室（RV）时，轻微回撤套管和导管以测量平均右心房压（RAP）。压力曲线应与 RAP 曲线相符。 图 2A. 
		注意：在本方案中，大鼠在麻醉状态下通过放血采集全部循环血量后实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 形态学评估与形态测量

注意：本方案中，动物在麻醉状态下通过放血以处死。处于肺动脉高压（PAH）发展任意阶段的大鼠以及对照组大鼠均可用于本方案。
<ol>
	<li>处死动物后，于支气管分叉上方约 5 mm 处切断气管，并切断连接肺与心脏的血管，取出肺组织，置于冷生理盐水中。分离左肺，在分叉处切断左主支气管。</li>
	<li>用50 mL注射器吸取4%多聚甲醛，将连接套管的导管安装在注射器上，并将注射器悬挂在工作台上方约一米处。将套管插入左侧主支气管，以被动灌注多聚甲醛充满肺组织。操作多聚甲醛时应谨慎小心。</li>
	<li>将左肺置于多聚甲醛中孵育 48 h。</li>
	<li>将左肺依次置于70%乙醇（1 h）、80%乙醇（1 h）、90%乙醇（1 h）、100%乙醇（3 h）、二甲苯（2 h）和石蜡（2 h）中孵育以进行脱水。</li>
	<li>将左肺以肺门朝向包埋盒的方向包埋于石蜡中。</li>
	<li>对石蜡包埋的 4-µm 根据制造商说明书，使用Verhoeff或Elastica-van Gieson染色法对肺组织切片进行染色29确保弹性膜清晰可辨（如 图3）。以 40 倍放大倍数扫描染色切片。</li>
	<li>将肺分为4个象限。在每个象限中，寻找10个外径 &lt; 50 µm （腺泡内）和10条外径 &gt; 50 µm （前腺泡）。拍摄图像（每肺2×40张）。随机放大至20倍，对视野中的每一条血管进行拍照，以尽量减少选择偏倚。</li>
	<li>排除最长直径与最短直径比值过大的血管 &gt; 2，不完整的环形结构，或血管壁塌陷超过四分之一。 
	注：图中展示了一个被排除血管的示例 图3b 每张图片均采用相同放大倍数（40X）拍摄，并包含比例尺。</li>
	<li>打开 ImageJ 和第一张图片。在图片的比例尺上绘制一条直线，通过“分析" 和 设置比例尺。”对于“已知距离，“请使用图片比例尺上的数值。使用微米（µm）作为单位。µm）作为长度单位。将比例尺设为全局。</li>
	<li>使用“徒手选择," 在管腔区域的内侧边界上画一条线（图3), 并使用 测量" (crtl m) 测量该区域。然后，在外弹性膜周围画一条线。图3) 以测量血管总面积。</li>
	<li>计算管腔和外径（<img alt="空集符号（∅），数学，逻辑，方程符号。" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">使用 <img alt="圆直径的计算公式：2×√(面积/π)，用于几何计算。" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">.</li>
	<li>使用以下方法计算壁厚 <img alt="横截面厚度公式：（外径 Φ - 管腔 Φ）/ 2；符号表示。" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">.</li>
	<li>使用以下方法计算管壁/管腔比值 <img alt="用于结构分析的壁厚与管腔直径比值方程" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">.</li>
	<li>使用以下方法计算阻塞分数 <img alt="管道壁厚计算公式，100×((外径−管腔直径)/外径)，工程计算示意图。" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">.</li>
	<li>根据血管肌化程度进行评分（无肌化、部分肌化或完全肌化）（图3B). 
	注意：管壁周长超过一半具有双层弹性膜的血管定义为完全肌化；管壁周长不足一半具有双层弹性膜的血管定义为部分肌化。</li>
	<li>根据是否存在新生内膜对血管进行评分（是或否）(图3C). 
	注意：缺乏明确内弹性膜且伴有（通常为偏心性的）管腔闭塞的血管被定义为新生内膜病变。</li>
</ol>

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<li>Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf">http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf</a> (1506).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方法描述了对经MCT预处理的大鼠建立动静脉瘘以诱导血流依赖性肺动脉高压的外科手术步骤，以及评估该模型中肺动脉高压主要血流动力学和组织病理学终点的技术。
方案中的关键步骤与故障排除
手术及术后操作。在建立主动脉-下腔静脉分流术的过程中，最关键的步骤是主动脉与下腔静脉的分离。包裹主动脉和下腔静脉的膜组织应充分游离，以实现两个目的：1）获得良好的视野，便于观察针穿刺主动脉的位置以及穿刺后针在下腔静脉内的位置；2）在穿刺点上方为主动脉提供足够的空间以便夹闭。然而，这些膜组织也起到引导血流从主动脉经穿刺孔进入下腔静脉的作用（图1）。若过度剥离这些膜组织，将导致分流处发生渗漏。使用组织胶可封闭渗漏，但胶水也可能渗入分流通道，从而影响其有效直径。当胶水导致分流通道或任一血管血流受限时，可尝试轻柔地清除胶水，但此操作可能引起下腔静脉或引导分流的膜组织破裂。可通过使用棉签压迫并释放近端主动脉，观察下腔静脉内血液颜色的差异及血流湍流程度的变化，来评估分流通道的大小或通畅性。
<p class="jove_co...

该方法的目的是建立一种可重复的大鼠严重血流诱导性肺动脉高压模型，并测量其主要的血流动力学和组织病理学终点指标。
肺动脉高压（PAH）是一种临床综合征，其特征是肺血管阻力进行性升高，最终导致右心室衰竭和死亡。在肺动脉高压性疾病（PH）这一大类疾病谱中，PAH 是最为严重的形式，目前仍无治愈手段1。PAH 的基础血管病变表现为典型的血管重塑，导致血管腔闭塞。正常无肌层血管出现肌层化以及血管中膜层肥厚被认为是 PAH 的早期病变，这些改变也可见于其他类型的 PH2，且被认为具有可逆性3。随着 PAH 的进展，内膜层开始发生重塑，最终形成特征性的新生内膜病变2。这种新生内膜型肺血管重塑为 PAH 所特有，目前认为不可逆转4。
由于肺动脉高压（PAH）是一种罕见疾病，其病理生物学机制的深入理解以及新疗法的开发在很大程度上依赖于动物模型。大鼠单克洛碱（monocrotalin, MCT）模型是一种简便的方法 单次打击 一种被频繁使用且至今仍被广泛采用的模型。MCT 是一种毒素，可导致肺小动脉损伤及局部炎症560 mg/kg MCT 在3至4周后会导致平均肺动脉压（mPAP）、肺血管阻力（PVR）和右心室肥厚（RVH）升高6组织形态学特征为孤立的中膜肥厚，无新生内膜病变5因此，MCT大鼠模型代表了一种中度的肺动脉高压（PH），而非肺动脉高压症（PAH），尽管该模型常被误称为后者。
在伴有先天性左向右分流的肺动脉高压患儿（PAH-CHD）中，肺血流量增加被认为是导致新生内膜病变发展的关键触发因素7,8,9。在大鼠中，可通过建立腹主动脉与下腔静脉之间的分流来诱导肺血流量增加，该技术最早于1990年被描述10。其他诱导肺血流量增加的方法包括单侧肺切除术或锁骨下动脉-肺动脉吻合术11。这些模型的概念性缺陷在于：单侧肺切除可能引起剩余肺组织的代偿性生长以及适应性通路的激活，而肺动脉吻合术则可能导致医源性肺血管损伤，二者均会干扰肺血流量增加本身所产生的效应。
当在MCT处理的大鼠中建立主动脉-下腔静脉分流并诱导肺血流增加作为二次打击时，会出现特征性的内膜下病变，并在血流增加后3周内发展为严重的肺动脉高压及相关的右心室衰竭（RVF）12该模型中肺动脉高压（PAH）的血流动力学进展可被评估 体内 通过超声心动图和右心导管检查。血管组织形态学、血管壁厚度、小动脉闭塞程度以及右心室衰竭的相关参数构成了 离体 多环芳烃的表征
本方法详细描述了主动脉-腔静脉分流术（AC-分流术）、右心导管术以及血管组织形态学定性和定量评估的实验方案。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;分流手术&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears 眼膏</td><td>Alcon</td><td>10380</td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl 组织胶</td><td>B. Braun Medical</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Safil 4-0 缝线 紫色 可吸收</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>Luer</td><td>NN1838R BD</td><td>针尖向外弯曲45度</td></tr><tr><td>纱布 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>镇痛新 布托啡诺</td><td>RB Pharmaceuticals</td><td>5429</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠通气面罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biemer钳 18 mm，5 mm开口&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.google.nl/url?sa=i&amp;amp;rct=j&amp;amp;q=&amp;amp;esrc=s&amp;amp;source=images&amp;amp;cd=&amp;amp;cad=rja&amp;amp;uact=8&amp;amp;ved=0ahUKEwitqICpkITNAhWiL8AKHe6iCC8QjhwIBQ&amp;amp;url=http%3A%2F%2Fwww.agnthos.se%2Fquote%2Fquote%2Fcaturl%2Fid%2F242%2FBiemer&amp;amp;psig=AFQjCNEnfRXuMQ6Doi4_-2KMYu3qeRovMA&amp;amp;ust=1464777707579746">AgnTho&lt;/a&gt;</td><td>64-562</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kocher钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃毛机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;右心导管术&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Duratears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纱布 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 缝线 黑色 不可吸收</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td>Luer</td><td></td><td>针尖轻微向内弯曲</td></tr><tr><td>20 G 套管</td><td>Luer</td><td></td><td>用于插入导管，针尖预弯20度</td></tr><tr><td>硅胶导管 长15 cm</td><td></td><td></td><td>距尖端2 mm处有0.5 mm球囊</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Ailtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>床旁监护仪 Cardiocap/5</td><td>Datex-Ohmeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃毛机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td></td><td></td><td>用于冲洗</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;血管形态学&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带管路的18 G 套管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff染色试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&amp;amp;region=NL">HT254&lt;/a&gt;</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>数字切片扫描仪</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹性纤维（结缔组织染色）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150667</td><td>http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html&lt;br /&gt;
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf</td></tr></tbody></table>

分流手术、右心导管检查及血管形态测量在血流诱导型肺动脉高压大鼠模型中的应用

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

在本实验方案中，通过联合使用60 mg/kg野百合碱（MCT）注射与经主动脉-腔静脉分流术（MCT+Flow）增加肺血流量来诱导肺动脉高压（PAH）。分流术通过将18号针头从腹主动脉插入邻近的腔静脉建立。研究表明，增加的肺血流量是诱发一种具有明确疾病进展阶段的重度PAH的关键触发因素，其特征为早期出现中膜肥厚，随后形成新生内膜病变，并逐渐导致小肺血管闭塞。为测量该模型中的右心及肺血流动力学，经右颈静脉插入带有柔性球尖导管的硬质套管进入右心室，进行右心导管检查。随后将导管推进至主肺动脉及更远端的肺动脉。肺血管系统的组织病理学评估采用定性与定量两种方法：定性评估通过评分肺小叶前和肺小叶内血管的肌化程度及新生内膜的存在情况；定量评估则通过测量血管壁厚度、壁腔比以及闭塞评分来完成。

代表性结果见图4。所示结果展示了以下各组Lewis大鼠中MCT+FLOW的特征：对照组（n = 3）、MF8组（n = 5）、MF14组（n = 5）、MF28组（n = 5）和MF-RVF组（n = 10）。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。
60 mg/kg MCT 与肺血流量增加导致第 28 天（MF28）收缩期右心室压（sRVP）（23 ± 6 至 56 ± 11 mmHg）、收缩期肺动脉压（sPAP）（20 ± 4 至 54.0 ± 10 mmHg）和平均肺动脉压（mPAP）（16 ± 3 至 36 ± 4 mmHg）显著升高。这些压力在右心室衰竭发生阶段（MF-RVF）之前持续维持在高水平（图 4）。在肺动脉高压早期阶段（MF8 和 MF14），未观察到 sRVP、sPAP 和 mPAP 升高。舒张期肺动脉压和右心房压在疾病晚期有所上升...

本方案描述了一种在大鼠中建立血流诱导肺动脉高压（PAH）模型的手术方法，以及分析该模型主要血流动力学和组织学终点的实验步骤。

在此方案中，通过注射60 mg/kg野百合碱（MCT）并结合主动脉-腔静脉分流以增加肺血流量，诱导肺动脉高压（PAH）……

这些实验操作的总体目标是建立一种由血流诱导的大鼠肺动脉高压模型，并通过右心导管术和血管形态计量学分析其主要的血流动力学和组织学终点指标。我们介绍了一种与血流相关的肺动脉高压大鼠模型，该模型的特点是出现类似人类肺动脉高压的新型内膜型血管重构，且由临床上公认的诱因——肺血流量增加——所诱导。这些特征将有助于提升该模型研究结果向人类疾病的转化价值。我们还展示了使用定量形态测量法对血流动力学评估和组织病理学特征进行标准化分析的方法。这些技术的应用有助于发现和评估新的治疗策略，并能够评估其对肺部血流动力学和血管形态的特定影响。本次演示由本实验室的显微外科医生 Annemieke Smit-Van Oosten 和 Michel Weij 进行。手术开始前，使用氯己定对麻醉大鼠的皮肤进行消毒，并皮下注射布托啡诺以提供术后镇痛。接着，用剪刀沿腹部正中线做切口，切口从膈肌下方1厘米处开始，延伸至外生殖器上方。将肠管移至动物左侧浸有0.9%氯化钠溶液的无菌纱布上，并用更多湿润的无菌纱布覆盖器官。使用新的棉签分离腹主动脉和下腔静脉与周围组织相连的膜。在解剖显微镜下，用镊子去除主动脉分叉右侧上方血管周围脂肪，此处即为针头插入部位。然后，从针头插入部位向上分离腹主动脉和下腔静脉约2毫米，以腾出空间放置夹钳。现在，在主动脉周围放置一根松散的5-0缝线，并在缝线上夹一个科赫钳（Kocher clamp），以在切口上方的结扎处产生张力。将血管夹（beamer clamp）置于缝线上方稍远处，使用新的棉签尽可能向远端压迫下腔静脉，以阻断血流。接下来，将一根18号针头弯成45度角，使斜面朝外，将针头与动物体呈90度持握，将针尖插入主动脉分叉稍上方处，斜面朝向左侧。分离包裹主动脉和下腔静脉的膜，程度以能清晰暴露分流管插入区域为宜，过度分离会导致分流管漏液。操作针头尖端向左，将针插入下腔静脉，直至在血管内可见。为防止血栓形成，使用新的棉签通过插入部位将主动脉内残余血液推出，并用无菌纱布擦干分流管周围的区域。移除针头后，立即在穿刺部位滴加一滴组织胶。然后松开主动脉上的夹子，并手动释放吻合口近端主动脉上的结扎线。吻合口远端的下腔静脉应迅速变为鲜红色，并在吻合口处产生湍流。确认分流后，将肠管复位至腹腔内，使用可吸收的4-0缝线缝合肌肉层和皮肤层。随后用100%氧气对动物进行通气，以促进麻醉复苏。进行右心导管术时，用氯己定消毒颈部，并使用10号手术刀片从右侧锁骨至下颌骨处沿颈部右腹侧做1.5厘米切口。在解剖显微镜下，使用剪刀撑开组织，然后用镊子轻轻将组织分开，直至颈静脉显现。使用碎屑镊子剥离颈静脉周围的膜。随后在血管周围放置一根松散的5-0缝线，并将结扎线固定在通气面罩上，以增加静脉的张力。在插入部位的远端，于血管上放置一个松紧适度的结扎线。接着，用镊子柄轻轻弯曲20号针头的尖端，使斜面朝内，将针头尖端插入静脉。迅速将带有导管的套管插入血管内，然后撤出针头，并收紧套管远端的结扎线，以固定套管位置。现在将套管和导管插入颈静脉，操作套管经锁骨下方进入右心房。将套管尖端朝向心脏以进入右心室。床旁监护仪上应出现右心室压力曲线。当右心室压力曲线稳定时，记录右心室的收缩压和舒张压，并将套管尖端向左上方调整。将导管经由套管向前推进，随后将导管送入主肺动脉。当肺动脉压力曲线稳定时，记录肺动脉的收缩压、舒张压和平均压。然后将导管沿套管推进，直至导管尖端的球囊嵌入肺动脉分支。应在床旁监护仪上观察到压力曲线的下降。当获得稳定楔入压力曲线时，记录收缩期、舒张期及平均楔压。然后缓慢回撤导管，根据床旁监护仪上的波形曲线，记录肺动脉（PA）和右心室（RV）压力的相应数值。当导管到达右心室时，轻微回撤套管和导管，测量平均右心房压。在此项代表性实验中，给予MCT 28天后，伴随肺血流量增加，观察到右心室收缩压、肺动脉收缩压和平均肺动脉压均升高。从治疗后第14天直至右心室衰竭阶段，右心室与左心室及室间隔重量比显著升高，提示右心室肥厚。在右心室衰竭阶段，肝脏湿重与干重比也显著升高，提示肝脏水肿以及充血性右心室衰竭。随着肺动脉高压的进展，肺小叶间血管的肌化程度进行性增加，治疗后第14天时近半数血管已表现出完全的肌性中膜，至疾病终末期几乎所有微动脉均出现肌化。此外，在第21天首次观察到新生内膜病变，疾病进展结束时约有65%的小动脉表现出新生内膜层。这导致血管进行性闭塞，在疾病终末期管腔闭塞可达60%。一旦掌握，每种技术可在20分钟内完成。完成该操作后，可进一步采用超声心动图或压力-容积环等其他方法，以回答有关右心室功能的更多问题。该技术建立后，将为肺动脉高压领域的研究人员探索血流增加对肺血管系统的影响提供重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立大鼠血流诱导型肺动脉高压模型，以及如何分析其主要的血流动力学和组织学终点指标。

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