Name: 野生类型阻止PCR结合直接测序作为低频体细胞突变的检测的高灵敏度的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解野生型阻断PCR结合直接测序技术，用于检测骨髓样本中myd88基因的低频体细胞突变。该方法具有高灵敏度和准确性，可应用于肿瘤基因突变分析与微小残留病灶监测。

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作者无致谢。

伦理声明：所有人体样本的检测均在获得机构审查委员会（IRB）批准后进行。
1. 从福尔马林固定石蜡包埋组织、外周血和骨髓穿刺液中提取DNA
<ol>
	<li>对于骨髓FFPE组织使用DNA FFPE提取试剂盒
	<ol>
		<li>从未经染色的切片开始（5–10张切片，厚度为5–10 µm）。 
		注意：若起始材料为组织碎屑，则使用3–6张切片（厚度为5–10 µm），并直接跳至步骤1.1.6。</li>
		<li>将切片放入切片篮中，并准备四个洗涤槽（两个用于二甲苯，两个用于100%乙醇）。每个篮中加入至少600 mL溶液。</li>
		<li>在第一个托盘中用二甲苯洗涤5分钟以脱蜡。将切片转移至第二个二甲苯洗涤槽中，再洗涤5分钟。</li>
		<li>脱蜡后，用100%乙醇洗涤切片5分钟。再将切片转移至第二个乙醇洗涤槽中，继续洗涤5分钟。</li>
		<li>在通风橱下使切片完全干燥，然后用刀片刮下组织并转移至微量离心管中。 
		注意：若有标注肿瘤区域的H&amp;E染色切片，可对齐切片并仅刮取肿瘤区域。</li>
		<li>按照试剂盒中所附制造商说明书的指导继续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于骨髓穿刺液及外周血
	<ol>
		<li>根据试剂盒说明书中的以下具体参数进行DNA提取。 
		注意：目前市面上有多种可用于FFPE组织和细胞DNA提取的试剂盒和方法。实际上，大多数方法均可使用。请选用实验室已建立的标准方法。
		<ol>
			<li>使用200 µL外周血（PB）或100 µL骨髓液加100 µL PBS。</li>
			<li>使用4 µL RNase A储存液。</li>
			<li>用100 µL洗脱缓冲液进行洗脱。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA定量
	<ol>
		<li>使用分光光度计测定DNA浓度，确保260 nm/280 nm比值约为1.8（纯DNA）。若比值明显偏低，可能提示存在蛋白质、苯酚或其他可能干扰后续实验的污染物。</li>
		<li>用适当的洗脱缓冲液将DNA浓度调整至约50–100 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 野生型阻断PCR
<ol>
	<li>引物设计
	<ol>
		<li>根据先前描述的PCR引物设计通用指南设计并获取目标基因的引物13。在PCR引物中包含M13正向和反向通用测序引物。 
		注：MYD88检测旨在扩增MYD88的第5外显子（G259 - N291）以及位于5'内含子区域的110个核苷酸，以覆盖剪接位点和部分内含子4。正向和反向引物在5'端设计有M13序列（M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt；M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc），以便互补测序引物的退火（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>锁核酸寡核苷酸设计
	<ol>
		<li>设计阻断寡核苷酸，长度约为10 - 15个碱基，并与希望实现突变富集的野生型模板互补。 
		注：较短的寡核苷酸可提高错配识别能力。为实现高靶标特异性，应避免使用过多的阻断核苷酸，否则可能导致寡核苷酸过于&#34;粘滞&#34;。阻断核苷酸的组成、长度和数量应根据需要阻断的具体核苷酸进行优化。重要的是在不破坏二级结构和避免自互补风险的前提下，实现高结合特异性。</li>
		<li>设计阻断寡核苷酸，使其在热循环延伸温度下的Tm比延伸温度高10 - 15 °C。通过添加或去除阻断碱基，或用DNA碱基替换部分阻断碱基来调节Tm，同时避免出现较长的（3 - 4个碱基）阻断G或C碱基连续序列。
		<ol>
			<li>访问寡核苷酸工具网站（见材料表），选择&#34;阻断寡核苷酸Tm预测&#34;工具。</li>
			<li>将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至&#34;寡核苷酸序列&#34;框中。在碱基前添加&#34;+&#34;以表示阻断碱基。</li>
			<li>点击&#34;计算&#34;按钮，以确定DNA-阻断剂杂合体的近似Tm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设计阻断寡核苷酸时应避免形成二级结构或自二聚体。
		<ol>
			<li>访问寡核苷酸工具网站（见材料表），选择&#34;阻断寡核苷酸优化器&#34;工具。</li>
			<li>将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至输入框中。在碱基前添加&#34;+&#34;以表示阻断碱基。</li>
			<li>选中&#34;二级结构&#34;和&#34;仅自配对&#34;两个选项，点击分析按钮，检查寡核苷酸是否存在潜在问题的二级结构或自二聚体。 
			注：得分是对二级结构和自二聚体Tm的粗略估计，因此较低得分为佳，可通过限制阻断剂-阻断剂配对来实现。MYD88的阻断寡核苷酸[MYD88blocker (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)]设计用于覆盖氨基酸Q262-I266，并在3'端带有倒置dT，以抑制DNA聚合酶的延伸和3'-外切酶的降解。该特定阻断寡核苷酸为17聚体，包含10个阻断碱基，以&#34;+N&#34;表示，其余7个碱基为普通DNA核苷酸。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>WTB-PCR设置与热循环
	<ol>
		<li>配制WTB-PCR主混合液（MMX），每反应使用2.5 µL 10倍PCR反应缓冲液（含20 mM MgCl2）、250 µM dNTPs、0.2 µM正向和反向引物、1.2 µM MYD88blocker，并用无DNA酶、无RNA酶的超纯H2O补足至终体积21.75 µL。 
		注：工作浓度基于最终反应体积25 µL（加入DNA模板和聚合酶后）。常规PCR MMX只需省略阻断剂即可配制。WTB-PCR与常规PCR的所有操作步骤均相同，可用于验证并确定添加阻断剂所实现的富集效果。
		<ol>
			<li>计算所需MMX总量时，需额外计入3个反应（阳性对照、阴性对照和无模板对照以检测污染）以及至少1个反应以补偿移液误差。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>充分涡旋混匀MMX。MMX可在-80 °C保存长达一年。</li>
		<li>每反应加入0.25 µL Taq DNA聚合酶至MMX中，轻柔颠倒混匀。加入聚合酶后，MMX应始终置于冰上。</li>
		<li>将新的96孔PCR板置于预冷板上，每孔加入22 µL含聚合酶的MMX。</li>
		<li>向每孔含MMX和聚合酶的反应体系中加入3 µL基因组DNA（50 - 100 ng/µL）。</li>
		<li>密封PCR板并短暂离心，确保溶液沉至各孔底部。</li>
		<li>将PCR板放入热循环仪。
		<ol>
			<li>设定WTB-PCR反应的热循环条件如下：95 °C初始变性6分钟；40个循环，每循环包括95 °C变性30秒、56 °C引物退火30秒、72 °C延伸1分20秒；最后72 °C终延伸10分钟。 
			注：最佳操作实践建议在物理上独立的区域完成后续步骤，以避免扩增子对后续实验的污染。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前描述的方案进行凝胶电泳14，以判断WTB-PCR是否成功，并确认无模板对照中无扩增产物。</li>
	<li>磁珠法纯化PCR产物
	<ol>
		<li>将磁珠从4 °C取出，恢复至室温。</li>
		<li>将10 µL PCR产物转移至新的PCR板中。</li>
		<li>剧烈涡旋磁珠，充分重悬磁性颗粒。</li>
		<li>向新板的每孔中加入18 µL磁珠，用移液器吹打混匀10次。</li>
		<li>室温孵育5分钟。</li>
		<li>将PCR板置于侧边带磁架的磁力板上2分钟，使磁珠与溶液分离。</li>
		<li>用多通道移液器吸除上清液，避免接触磁珠沉淀。</li>
		<li>向每孔加入150 µL 70%乙醇，室温孵育至少30秒。用多通道移液器吸除乙醇并丢弃吸头。重复此洗涤步骤一次。</li>
		<li>使用20 µL多通道移液器吸除每孔中残留的乙醇，并丢弃吸头。</li>
		<li>待孔内完全干燥（约10分钟）后，从磁力板上取下PCR板，向每孔加入40 µL无核酸酶水，吹打混匀15次或轻柔涡旋。</li>
		<li>室温孵育2分钟。</li>
		<li>将PCR板放回磁力板上1分钟，使磁珠与溶液分离。</li>
		<li>将35 µL纯化产物转移至新的PCR板中。此纯化后的PCR产物可直接用于双向测序，或在-20 °C保存待用。 
		注：在开发新检测方法时，可能需要对纯化后的PCR产物进行定量。双向测序的最佳扩增子DNA浓度为1 - 3 ng/µL。若浓度持续偏低，可按比例（1:1.8）增加PCR产物和磁珠用量；若浓度持续偏高，可用更大体积的水进行洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. WTB-PCR 产物的测序
<ol>
	<li>双向测序 
	注意：以下方案是对制造商说明书的修改版本，已优化为使用更少的试剂。
	<ol>
		<li>配制正向和反向测序反应混合液：每份反应中加入 0.25 µL Ready Reaction 混合液、1.88 µL 测序缓冲液、1.78 µM M13-F 或 M13-R 测序引物，并加入无 DNA 酶、无 RNA 酶的超纯 H2O，使每份反应的终体积为 9 µL。该测序反应混合液可在 -20 °C 下保存长达一年。</li>
		<li>将 9 µL 正向测序反应混合液加入新的 96 孔 PCR 板的每个孔中，用于正向测序反应。另取一块独立的 PCR 板重复上述操作，用于反向测序反应。</li>
		<li>向正向和反向测序板的每个孔中分别加入 1 µL 纯化的 WTB-PCR 产物。</li>
		<li>密封反应板并短暂离心，确保溶液沉降至各孔底部。</li>
		<li>将 PCR 板放入热循环仪中。
		<ol>
			<li>设置测序反应的热循环条件如下：96 °C 预变性 1 分钟；进行 30 个循环（96 °C 变性 10 秒，50 °C 退火 5 秒，60 °C 延伸 4 分钟）；最后在 4 °C 保存直至进行纯化。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化测序产物
	<ol>
		<li>新鲜配制 3 M 醋酸钠（pH 5.2）与 100% 乙醇按 1:25 比例混合的溶液。</li>
		<li>新鲜配制 70% 乙醇溶液。</li>
		<li>向正向和反向测序板的每个孔中加入 30 µL 醋酸钠/100% 乙醇混合液，并用移液器吹打混匀 5 次。</li>
		<li>重新密封反应板，在室温避光条件下孵育 20 分钟。</li>
		<li>以 2,250 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>移除板封膜，将反应板倒置于废液容器上方。 
		注意：仅倒置一次，以免沉淀从孔底脱落。</li>
		<li>将倒置的反应板置于干净的纸巾上，以 150 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>向每个孔中加入 150 µL 70% 乙醇。</li>
		<li>重新密封反应板，以 2,250 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.2.6 和 3.2.7。</li>
		<li>若孔内未完全干燥，可在室温下静置晾干。干燥过程中应确保样品避光。</li>
		<li>向每个孔中加入 10 µL 甲酰胺，并用移液器吹打混匀 10 次。重新密封反应板。</li>
		<li>在热循环仪中于 95 °C 变性 3 分钟，随后 4 °C 保持 5 分钟。</li>
		<li>变性完成后，将板封膜更换为隔垫，按照制造商说明书在测序平台上进行测序15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 测序结果分析
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用测序数据分析软件可视化测序痕迹16 并与相应的参考序列比对。将 MYD88 与 NCBI 参考序列比对 &#34;NM_002468&#34;.</li>
</ol>

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<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的WTB-PCR检测采用一组通用引物，并设计了一条阻断寡核苷酸，用于在延伸过程中抑制野生型（WT）DNA的扩增（图1）。随后对WTB-PCR产物进行测序以开展突变分析。WTB-PCR联合Sanger测序的优势在于其操作简便、灵敏度高且通量大。根据本文所述的指导原则，大多数现有的基于Sanger测序的检测方法均可通过添加一条阻断寡核苷酸进行简单改造，从而显著提高检测灵敏度。在本示例检测中，在PCR反应中添加单条阻断寡核苷酸后，检测限由传统方法在野生型背景下的约16%突变等位基因比例显著降低至WTB-PCR检测中的&#62;0.5%3。这一改进使临床检测中假阴性结果减少了64%3。确认MYD88基因突变的存在具有重要的诊断和预后意义；若将阳性病例错误报告为阴性，可能对整体治疗方案和患者管理造成严重后果。因此，采用WTB-PCR进行检测尤为重要，特别是在异常细胞比例相对较低的患者中。
WTB-PCR 技术存在较大差异，有时会与 LNA、BNA 或 PN...

Sanger 测序传统上一直是检测已知和未知体细胞突变的金标准。Sanger 测序的一个局限性在于其检测下限（在野生型背景下约 10 - 20% 的突变等位基因）1。这一灵敏度水平不适合检测前恶性组织样本、循环肿瘤细胞较少的患者样本，或骨髓（BM）分布不均时存在的低水平体细胞突变。这也使得仅通过传统测序方法难以评估治疗后的残留病灶，或在治疗过程中检测新出现的耐药突变2。在 Sanger 测序中，若以锁核酸（LNA）介导的野生型阻断 PCR（WTB-PCR）替代传统 PCR，可将检测灵敏度提高至在野生型背景下低至 0.1% 的突变等位基因2,3,4。在 WTB-PCR 中，通过加入一段短的（约 10 - 14 nt）阻断型（LNA）寡核苷酸，优先结合野生型 DNA，从而抑制野生型 DNA 的扩增，实现对突变等位基因的富集。随后可对富集突变的 WTB-PCR 产物进行测序。由于 WTB-PCR 是通过阻断野生型 DNA 而非特异性选择特定突变，因此能够富集存在于极小细胞比例中的已知和未知突变。
目前有多种方法用于检测小细胞群体中的突变，包括等位基因特异性PCR、扩增阻滞突变系统（ARMS）、变性高效液相色谱法（DHPLC）、微珠-乳液-扩增-磁性法（BEAMing）、电场诱导释放与检测技术（EFIRM）、高分辨率熔解曲线分析及其他方法。然而，这些方法大多存在假阳性问题，且只能检测实验设计所针对的单一突变4。相比之下，WTB-PCR 允许用户直接观察测序峰图，从而能够识别多种类型的突变，并有助于排除因实验假象或脱氨事件导致的假阳性结果。下一代测序（NGS）可能作为传统测序的一种可行替代方案，但其较高的成本、复杂性以及较长的检测周期，使其在分子标志物较少的疾病类型中，或在监测治疗过程中出现耐药突变的患者时显得不必要。此外，在检测突变等位基因频率低于5%的变异时，基于扩增子的NGS可能出现较高的假阳性率5,6。
本文展示了WTB-PCR在筛查髓样分化因子88基因（MYD88）突变时所实现的灵敏度提升，该方法由Albitar et al.3描述。MYD88突变在华氏巨球蛋白血症（Waldenström's Macroglobulinemia, WM）、意义未明的IgM单克隆丙种球蛋白病（IgM-MGUS）、脾边缘区淋巴瘤（SMZL）以及弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中具有重要的诊断和预后意义。几乎所有的WM病例以及约50%的分泌免疫球蛋白M（IgM）的MGUS患者中均可检测到MYD88突变。相比之下，仅在0–6%的SMZL患者中发现MYD88突变，而在多发性骨髓瘤中则未见报道7,8。由于WM与SMZL或IgM型多发性骨髓瘤在形态学、免疫表型、细胞遗传学及临床特征方面存在重叠，常导致鉴别诊断困难，因此MYD88突变的存在可作为一项有用的鉴别指标9。此外，MYD88突变还与DLBCL患者更高的肿瘤负荷以及治疗后总体生存率较差相关7,10。另外，由于MYD88突变更常见于活化B细胞样（ABC）型DLBCL，而较少见于生发中心B细胞样（GCB）型DLBCL或原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL），因此MYD88突变状态可作为ABC亚型的替代标志物11,12。
本文提供的详细实验方案可作为模板，用于开发新的检测方法，或轻松改造大多数现有的测序检测方法，以准确检测各类样本中低频突变。该方法还可用于监测和检测肿瘤甚至细菌在患者接受靶向治疗或抗生素治疗过程中可能产生的耐药突变。此外，该方法解决了与突变富集相关联的诸多问题，特别是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的应用。

<table><tbody><tr><td>1.5 或 2 mL 安全锁扣微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% 酒精</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>组织学级别；含 91.5% 乙醇、5% 异丙醇、4.5% 甲醇</td></tr><tr><td>3730XL 测序仪</td><td>ABI</td><td></td><td>或同等性能设备</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠纯化试剂</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于磁珠法 PCR 纯化</td></tr><tr><td>铝制密封箔</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>用于 PCR 及低温储存</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>用于双向测序，含 5× 测序缓冲液</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 系列离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>配备 A-2-DWP 转子（适用于 PCR 板）</td></tr><tr><td>96 孔板用冷板</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>无 DNA 酶、无 RNA 酶、超纯水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs（100 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 侧裙磁架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>用于 PCR 纯化</td></tr><tr><td>无水乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof，分子生物学级别</td></tr><tr><td>Exiqon 网站 Oligo Tools 工具</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA 聚合酶（5 U/&amp;micro;L）</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>含 10× 浓缩 PCR 反应缓冲液，含 20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td></td><td></td><td>2% 琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE 提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>含减少测序假象所必需的尿嘧啶 DNA 糖基化酶</td></tr><tr><td>Hi-Di 甲酰胺</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>用于测序</td></tr><tr><td>LNA 寡核苷酸</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/（+N = LNA 碱基）</td></tr><tr><td>M13-F 测序引物</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R 测序引物</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S 梯度 PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Model 5430 微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>配备 FA-45-30-11 转子（适用于 1.5/2 mL 微量离心管）</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 正向引物</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR 反向引物</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR 板</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td>20、200、1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>96 孔板用密封垫</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>用于骨髓穿刺液和外周血</td></tr><tr><td>SeqScape 软件 v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>用于测序分析</td></tr><tr><td>切片篮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（3 M，pH 5.2）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤吸头</td><td></td><td></td><td>20、200、1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Thermomixer C&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>洗涤储液槽</td><td></td><td></td><td>约 1,000 mL</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>组织学级别</td></tr></tbody></table>

野生型阻断pcr联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

在评估治疗后残留病灶、治疗期间筛查新出现的耐药突变，或患者循环肿瘤细胞数量较少的情况下，准确检测和鉴定低频突变可能具有挑战性。野生型阻断PCR联合测序分析作为一种检测低频突变的方法，具有高灵敏度、灵活性和操作简便的优势。通过在新建立或已有的常规基于PCR的测序检测中加入定制设计的锁核酸（LNA）寡核苷酸，可实现约每1,000个野生型等位基因背景中检出1个突变等位基因的灵敏度（1:1,000）。在提取过程中使用尿嘧啶DNA糖基化酶，可在一定程度上缓解福尔马林固定石蜡包埋组织中常见的脱氨事件所导致的测序假象。本文优化的实验方案专用于检测MYD88突变，但也可作为设计任何野生型阻断PCR（WTB-PCR）检测的模板。相较于等位基因特异性PCR和实时定量PCR等其他常用于低频突变检测的方法，WTB-PCR检测具有更少的假阳性结果、更高的灵活性和更简便的操作性，并且能够同时检测已知和未知的突变。

扩增过程中WTB-PCR的原理概述见图1。由于阻断剂DNA与模板DNA之间单个核苷酸的错配会显著降低其熔解温度（ΔTm=20 - 30 °C），野生型等位基因的扩增被抑制，而突变型模板DNA则可自由完成延伸17。通过这种方式，突变型DNA呈指数级扩增，而野生型DNA则呈线性扩增。
WTB-PCR 实现的突变富集效果如图2所示。分别采用常规PCR和WTB-PCR对携带突变和不携带突变患者的基因组DNA进行检测，随后进行测序，以展示WTB-PCR可实现的典型富集效果，并证实其在野生型DNA中不会产生假阳性结果。WTB-PCR MMX中阻断剂的工作浓度应通过滴定实验确定，需在实现理想突变富集水平的同时，避免出现假阳性，或完全抑制野生型DNA的扩增。对WTB-PCR产物的测序分析表明，在野生型背景中，突变等位基因的富集效果显...

野生型阻断PCR结合直接测序法是一种高灵敏度的检测方法，可用于多种样本类型中低频体细胞突变的检测。

野生型阻断PCR联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

准确检测和鉴定低频突变在评估治疗后残留病灶、筛查新出现的突变时可能存在困难……

本实验的总体目标是检测多种样本类型中的低频体细胞突变。该方法可通过提高对极低频突变的检出能力，帮助解决体细胞突变检测中的关键问题。在此，我们将检测骨髓样本中 myd88 基因的突变。该技术的主要优势在于，即使肿瘤细胞数量极少，也能提供关于体细胞突变存在情况的高度准确且灵敏的信息。本检测基于一种野生型阻断PCR测序方法，旨在扩增 myd88 基因第5外显子的部分区域，确保覆盖L265热点突变位点。正向和反向引物在5'端设计有M13序列，以便兼容通用测序引物进行后续测序反应。设计阻断寡核苷酸的长度约为10至15个碱基，并与需要进行突变富集的野生型模板互补。较短的寡核苷酸可提高错配 discrimination（区分能力）。为实现高靶标特异性，重要的是不要使用过多的阻断核苷酸，否则会导致寡核苷酸非特异性结合过强。设计封闭寡核苷酸时，首先访问 Oligo Tools 网站。选择 Oligo TM 预测工具，新窗口将打开。将要被阻断的野生型模板序列粘贴到引物序列框中。在阻断碱基前添加加号以标记它们。点击计算按钮，以确定DNA阻断杂交体的近似解链温度（TM）。计算得到的熔解温度将显示在下方的框中。设计阻断寡核苷酸时，其熔解温度应比热循环过程中的延伸温度高10至15摄氏度。此处，延伸温度为72摄氏度。为了调整熔解温度，可添加、删除或替换阻断碱基。避免出现三到四个连续的阻断型C或G碱基。接下来，为避免形成二级结构或自身二聚体，返回Oligo Tools网站主页，然后选择Oligo Optimizer工具。新窗口将会打开。将需要被阻断的野生型模板序列粘贴到输入框中，并在需要阻断的位置添加加号以标记阻断碱基。选择二级结构和“仅自身”这两个选项，然后点击分析按钮，以查看杂交和二级结构的得分。这些得分分别是对自身二聚体和二级结构熔解温度的粗略估计。得分越低越佳，可通过限制阻断剂与阻断剂之间的配对来实现较低得分。通过移除或重新定位阻断核苷酸以获得更低的评分。此处所示针对 myd88 优化的阻断寡核苷酸在 DNA 阻断物杂交熔解温度与足够低的杂交及二级结构评分之间达到了平衡。该寡核苷酸设计用于覆盖氨基酸 Q262 至 I266 区域，并在 3' 端包含一个倒置的 DT，以抑制 DNA 聚合酶的延伸作用以及 3' 外切酶的降解作用。引物设计完成后，按照随附文件中的说明设置野生型阻断 PCR 并进行热循环。将磁珠从 4 摄氏度的储存条件下取出，恢复至室温。转移 10 µL 的 PCR 产物至新的 PCR 板中。剧烈涡旋磁珠，使磁性颗粒充分重悬，然后向新板的每个孔中加入18 µL磁珠。用移液器吹打10次以混匀。随后将板在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将PCR板置于侧边带裙边的磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。使用多通道移液器吸取上清液，注意避免触及磁珠沉淀。接下来，向每个孔中加入150微

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

野生类型阻止PCR结合直接测序作为低频体细胞突变的检测的高灵敏度的方法

本视频介绍了野生型阻断聚合酶链式反应（WTB-PCR），该技术用于检测体细胞突变。这种基于PCR的技术使用锁核酸（LNA），即一种寡核苷酸，可与其互补的野生型等位基因结合并阻断其延伸。该阻断作用可选择性地促进样本中低丰度突变等位基因相对于其野生型变体的扩增。...

野生型阻断PCR检测低频体细胞突变

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel...

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本视频旨在演示如何进行 从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中自动化提取DNA及数字滴定PCR (ddPCR) 分析用于在临床环境中检测稀有突变。在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中检测突变，证明了 ddPCR 在 FFPE...

采用数字滴定PCR检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的BRAF V600E突变

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off...

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

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患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。...

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

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野生型阻断PCR联合Sanger测序法检测低频体细胞突变

单细胞测序是一种日益流行且易于获取的工具，可用于高分辨率地研究基因组变化。我们提供了一种利用单细胞测序在单个细胞中鉴定拷贝数变异的实验方案。...

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