Name: 优化分析在体内和体外脂肪肝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习优化脂肪肝模型的体内外构建与表征方法，通过无创评估技术研究生理进展。该方法适用于脂肪肝、胰岛素抵抗及二型糖尿病等代谢疾病机制研究。

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感谢张菲菲的有益讨论。感谢高静和孙艺轩提供的技术支持，感谢刘正帅和马凤光在动物实验方面给予的帮助。

所有动物实验方案均经中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所（中国上海）机构动物护理和使用委员会批准。
1. DIO 小鼠模型
<ol>
	<li>高脂高蔗糖饮食喂养
	<ol>
		<li>将8周龄雄性C57BL/6小鼠喂饲含40 kcal%脂肪和40 kcal%蔗糖的高脂高糖饮食（HFHS），并在12小时光照-12小时黑暗循环条件下饲养。</li>
		<li>将小鼠置于高脂高糖饮食条件下喂养四至十六周，每周检测体重。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>身体成分分析与伪彩色图像分析
	<ol>
		<li>对小鼠进行体成分分析仪检测。
		<ol>
			<li>将清醒且未麻醉的小鼠固定在塑料管中。使用核磁共振（NMR）系统测量体脂含量、瘦体质量及体液含量，具体操作如前所述。2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用磁共振成像系统扫描每只小鼠的整个身体。
		<ol>
			<li>用1%阿佛丁通过腹腔注射（25 µL/g）麻醉小鼠，并在专用玻璃管中进行成像分析。 
			注意：每只小鼠的成像过程持续约0.5小时。测量完成后，将小鼠放回笼中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对小鼠进行背部、中部和腹部的全身扫描，并对肝脏进行垂直方向扫描。使用0.55 T磁体及以下仪器参数：K空间 = 192 x 256 µm，层厚 = 3 mm，TE = 14.8 ms，TR = 400 ms，FOVRead = 100 mm，FOVPhase = 100 mm，扫描次数 = 8。所有组别的小鼠均在相同的磁场条件下进行扫描。</li>
		<li>根据信号强度将灰度图像映射为伪彩色图像9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠安乐死
	<ol>
		<li>对解剖工具（如镊子和剪刀）进行灭菌。</li>
		<li>在纸巾上倒入足量异氟烷，置于玻璃罐中使其挥发。确保小鼠通过吸入异氟烷被安乐死。</li>
		<li>将小鼠固定在手术台上。用75%乙醇喷洒每只小鼠的腹部，用剪刀在剑突处的皮肤做切口，然后用手沿中线纵向撕开皮肤以暴露腹膜。</li>
		<li>用镊子夹住剑突，横向剪开肋骨下缘的腹膜，以暴露内脏。</li>
		<li>通过心脏穿刺采集血液至含EDTA的抗凝管中。</li>
		<li>沿肝脏剪开膈肌，使用精细剪刀小心地将肝脏从体腔中取出。取三份肝组织用于以下脂质含量测定：a) 6 × 3 × 3 mm 用于 H&amp;#38;E 染色，b) 6 × 3 × 3 mm 用于油红 O 染色，c) 20–40 mg 肝组织用于氯仿/甲醇提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>H&amp;#38;E染色
	<ol>
		<li>在4%磷酸盐缓冲甲醛醋酸溶液中4 °C下固定肝脏过夜，随后将其包埋于石蜡中。</li>
		<li>切取石蜡切片（5 µm）并将其贴附于玻璃载玻片上用于H&amp;#38;E 染色，方法如前所述3,10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>油红O染色
	<ol>
		<li>试剂制备
		<ol>
			<li>用10%甲醛、60%异丙醇、苏木精和明胶甘油配制油红O工作液。将0.5 g油红O粉末溶于100 mL异丙醇中，在60 °C水浴中加热溶解，配制成0.5%储备液。</li>
			<li>用双蒸水（ddH₂O）稀释2O) 按 3:2 的比例混合（3 mL 储备液与 2 mL ddH₂O）2O）。将工作液过滤，室温静置至少10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将肝脏组织置于塑料包埋盒中的最佳切割温度（OCT）包埋剂中，在 -20 °C 下冷冻 30 分钟。使用冷冻切片机将组织切成 8-µm 厚的切片，将切片贴附于载玻片上，并在室温下放置 30 分钟。</li>
		<li>在染色缸底部放置一张纸巾，倒入少量10%福尔马林以润湿纸巾。将载玻片放入染色缸中，在4 °C条件下用甲醛蒸气固定冷冻切片5分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入染色缸中的60%异丙醇3秒；重复一次。</li>
		<li>向载玻片上滴加数滴 Oil Red O 工作液，以覆盖所有组织，室温下避光孵育 15 分钟。</li>
		<li>在染色缸中用新鲜的60%异丙醇冲洗载玻片3秒；重复两次。</li>
		<li>用蒸馏水轻轻冲洗载玻片两次，并除去组织周围的水分。注意不要将组织干燥。</li>
		<li>将切片置于苏木精中染色1分钟，然后用自来水轻轻冲洗5-10分钟。用蒸馏水轻轻冲洗切片两次，并将切片保持在蒸馏水中，直至准备加盖盖玻片。</li>
		<li>将甘油胶在微波炉中加热，取数滴置于组织上。轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。</li>
		<li>在显微镜下观察染色结果，并使用20X和40X物镜拍摄典型图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏脂质含量测定
	<ol>
		<li>将解剖得到的肝组织置于新的2 mL塑料离心管中，加入1 mL PBS，使用匀浆器进行匀浆，然后将裂解液转移至新的15 mL玻璃试管中。</li>
		<li>加入5 mL氯仿/甲醇（2:1，v/v）溶液，剧烈涡旋混合1分钟，冰上静置2小时。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,650 × g 离心 10 分钟；混合物应分为三层：上层为甲醇层，中层为蛋白质沉淀环，下层为氯仿和脂质层。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管将下层相转移至新的玻璃管中，无需完全转移下层的所有液滴。将试管置于冰上备用。</li>
		<li>加入 600 µL 的 4 mM MgCl₂2 向之前离心管中的上清液加入1.5 mL氯仿，充分涡旋混匀。冰上孵育30分钟，于4 °C以1,650 × g离心10分钟。</li>
		<li>使用巴斯德移液管将下层相与第一次分离的下层相合并，弃去上层和中间层。</li>
		<li>在37 °C水浴中用氮气吹干氯仿。用200 µL 1% Triton X-100/氯仿（v/v）充分冲洗玻璃管管壁。再次用氮气吹干。用200 µL ddH₂O溶解脂质。2O并涡旋混匀以制备终末乳剂。</li>
		<li>使用甘油三酯（TG）或胆固醇（TC）检测试剂盒，按照制造商提供的说明书测定总甘油三酯和总胆固醇水平3. 
		注意：脂质数值已根据初始匀浆中的蛋白质浓度进行标准化处理，蛋白质浓度由蛋白质定量测定确定。3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠原代肝细胞模型
<ol>
	<li>小鼠原代肝细胞的分离
	<ol>
		<li>用6%水合氯醛（10 µL/g，腹腔注射）麻醉每只小鼠。</li>
		<li>按照先前描述的方法分离原代肝细胞10。将细胞接种于胶原包被的玻璃盖玻片上，置于6孔板中培养，用于油红O染色。如需进行脂质提取，则将细胞接种至10 cm细胞培养皿中10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞处理与油红O染色
	<ol>
		<li>更换为2 mL饥饿培养基，在37 °C培养箱中孵育24 h。加入30 mM葡萄糖和100 nM胰岛素进行处理，继续在37 °C培养箱中孵育24 h。</li>
		<li>吸除培养基，加入2 mL PBS，轻轻摇动以冲洗残留培养基，重复一次。</li>
		<li>用橡皮圈将盖玻片固定在载玻片上，使细胞贴附面朝外。按上述方法（步骤1.5）进行油红O染色。 
		注意：血清饥饿后，通过高浓度葡萄糖联合胰岛素处理可刺激脂质积累的基础水平。脂滴可通过油红O染色进行可视化观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质含量测定
	<ol>
		<li>在相同条件下（步骤2.2.1）用高浓度葡萄糖联合胰岛素处理肝细胞。向每个10 cm细胞培养皿中加入1 mL PBS，刮取细胞并收集至新的15 mL玻璃试管中，从中取100 µL等分试样转移至新的1.5 mL离心管，用于蛋白质定量。</li>
		<li>向剩余的900 µL细胞悬液中加入4 mL氯仿/甲醇（2:1, v/v），超声处理约20次“哔”声，然后剧烈涡旋震荡以释放细胞内脂质。将混合物置于冰上孵育2 h。随后进行脂质提取（步骤1.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11961152">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
<li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fatty+liver+disease%3A+old+questions+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li>
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<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。
基金支持：本工作获得国家自然科学基金（编号 81270930、31471129 和 31671224）及中国科学院百人计划（2013OHTP04）对 Y.L. 的资助。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一组与代谢综合征、肥胖、胰岛素抵抗或2型糖尿病（T2DM）相关的进行性肝脏疾病11。NAFLD的特征是肝细胞脂肪变性（steatosis），即脂质在肝细胞中的积聚。本文介绍了一系列利用饮食诱导肥胖（DIO）小鼠和小鼠原代肝细胞来表征肝脂肪变性表型和相关参数的方法。该实验流程有助于阐明NAFLD及其他相关代谢性疾病的分子机制。
联合使用 体内 和 体外 检测方法，这些技术可对肝脏脂肪变性进行系统性分析与评估。目前，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的动物模型主要包括遗传性和营养性模型。本研究中使用的高脂高糖（HFHS）饮食旨在模拟现代饮食模式，足以诱导小鼠产生肥胖及肝脏脂肪变性。然而，在研究脂质代谢紊乱发生过程中的分子机制时，基于细胞的检测方法相较于动物实验具有明显优势，包括可通过基因突变或药物处理实现便捷干预，且成本相对较低、耗时较短。为在小鼠原代肝细胞中建立肝脏脂肪变性模型，采用高浓度葡萄糖联合胰岛素诱导脂质蓄积，该方法具有创新性且高效 体外 模拟...

肥胖是发达国家和发展中国家日益严重的健康问题。据报道，肥胖是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）常见的共存疾病之一，在NAFLD患者中的患病率介于30%至100%之间1。由于脂肪肝与肥胖之间存在密切关联，饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠模型被广泛用于研究NAFLD发生发展的复杂分子机制2,3,4,5,6。肝脂肪变性是NAFLD的最早阶段，可进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化，最终导致肝癌7。因此，本方法的总体目标是建立肝脂肪变性状态的动物和细胞模型，并提供高效、准确的脂质检测详细方案。这些模型和检测方法也可用于其他代谢性疾病（如胰岛素抵抗和2型糖尿病）的研究。
由于肥胖被确认为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的关键风险因素之一，因此采用高脂高蔗糖饮食（HFHS）来模拟西方高脂饮食，以诱导小鼠产生肥胖。随后，可通过不同方法评估肝脏脂肪变性的程度。首先，通过核磁共振（NMR）进行体重和体成分分析，可显示喂养期间的脂质积聚情况，且脂肪量和瘦体质量可实现无创、实时的定量。
此外，磁共振成像（MRI）可用于显示全身及肝脏中的脂肪分布。MRI分析的灰度信号可转换为易于辨读的伪彩图像，其灰度和颜色强度具有半定量性。该技术在活体动物脂质蓄积的测量方面具有独特优势。其次，肝脏组织学分析是确定肝脂肪变性最常用的方法。苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色可提供肝细胞形态和巨噬细胞浸润等组织学信息，而油红O染色则可显示肝细胞内脂滴的大小和位置。第三，采用氯仿/甲醇提取法进行脂质含量分析，是测定肝脏脂质的一种准确且定量的方法。总甘油三酯和胆固醇水平可通过生化方法测定。重要的是，脂质提取分析和油红O染色也可用于基因操作或药物处理后的肝细胞。
本方法的优势在于采用多种优化策略构建肝脂肪变性模型，并对表型进行全方位表征 体内 和 体外DIO 小鼠模型能够重现人类脂肪肝疾病的病理特征和代谢表型。该模型还可复制人类的其他代谢参数。8高糖联合胰岛素诱导脂肪变性肝细胞模型的方法高效且实用，克服了成本高昂且耗时的小鼠实验的局限性。综上所述，这些方法对于研究营养过载条件下肝脏脂质代谢功能障碍和胰岛素抵抗至关重要且充分。

<table><tbody><tr><td>O.C.T 包埋剂</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity 甘油三酯检测试剂盒</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity 胆固醇检测试剂盒</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（低糖）</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>用PBS溶解，储存液浓度为1 mM</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>核磁共振仪</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>高脂高蔗糖饮食（HFHS）</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

优化分析 体内 和 体外 肝脂肪变性

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

建立一套定性与定量表征的程序体系 体内 和 体外 肝脂肪变性对于肝脏代谢研究具有重要意义。本文描述了多种检测方法，可全面测定小鼠和肝细胞模型中肝脂肪变性的表型及各项参数。 
结合生理学、组织学和生物化学方法，该系统可用于评估肝脂肪变性的进展。体内实验中，通过检测体重和核磁共振（NMR）可无创地获得小鼠的整体状况。苏木精-伊红（H&amp;E）染色和油红O染色用于确定在营养过剩条件（如高脂饮食喂养）下肝脏组织的组织学形态和脂质沉积情况。随后，采用氯仿/甲醇提取法分离总脂质，并进行甘油三酯和胆固醇的生物化学分析。此外，利用高葡萄糖联合胰岛素处理小鼠原代肝细胞，以诱导脂质积聚，建立一种有效的体外模型，模拟体内饮食诱导的高血糖和高胰岛素血症。随后通过油红O染色和氯仿/甲醇提取法测定脂质沉积情况。油红O染色可直观显示肝脂肪变性表型，而脂质提取分析则可获得可用于统计学分析的定量参数。本实验方案对脂肪肝疾病、胰岛素抵抗及2型糖尿病领域的科研人员具有重要意义。

如图1A所示，小鼠经16周高脂高糖（HFHS）饮食喂养后，体重增加至45±1.2 g，约为普通饲料喂养组的1.5倍。核磁共振（NMR）体成分分析显示了小鼠的脂肪质量和瘦体质量（图1B）。通过磁共振成像（MRI）测定全身及肝脏的脂肪分布，并展示了清醒、活体小鼠的代表性伪彩图像（图1C-D）。在HFHS饮食喂养过程中，对小鼠的体重和体成分进行了测量与可视化分析。
为了进一步解析脂肪变性表型，处死小鼠并进行肝脏组织学分析。图2A-B展示了肝脏的H&amp;E染色和油红O染色结果，显示在高脂高糖饮食喂养4个月后，脂滴增大并占据大多数肝细胞内的空间。通过与普通饲料喂养小鼠比较，可直观观察到高脂高糖饮食喂养小鼠肝脏脂肪变性的程度。采用氯仿/甲醇提取法检测肝脏中脂质的主要成分（如甘油三酯和胆固醇）含量（图2C</st...

此处优化了生成方法 体内 和 体外 描述了肝脂肪变性模型的建立方法，以及对脂肪变性表型和相关生理参数的分析。

建立一套用于定性和定量表征体内与体外肝脂肪变性的操作流程系统，对于代谢研究具有重要意义……

本实验的总体目标是提供一种优化的方法，通过体内和体外手段建立并表征肝脂肪变性。该方法有助于解答在营养过剩和肥胖状态下，肝脏脂质与葡萄糖代谢机制研究中的关键问题。该技术的一个优势在于，可在进行组织学和生物化学分析之前，无创地评估肝脂肪变性的生理进程。该方法可为脂肪肝疾病提供研究依据，也可应用于其他代谢性疾病，如胰岛素抵抗、2型糖尿病和肥胖症。示范该实验操作的人员为Zhimin、Yamei和Aoyuan。他们都是我实验室中从事脂质和葡萄糖代谢转录调控研究的研究生。麻醉供体小鼠后，通过心脏穿刺采集血样，并将血液收集至含EDTA的采血管中。切除肝脏时，沿肝脏长度方向切开膈肌，并小心地将肝脏从肠系膜中分离取出。从肝脏中取两份组织块，分别用于苏木精和伊红（H&E）染色及油红O染色。剩余组织用于脂质含量测定，所需组织量至少为20毫克。将油红O粉末配制成0.5%的储备液，然后用水稀释至0.3%的工作液，并通过0.22 µm滤膜过滤。 然后，将溶液在室温下静置十分钟。接着，将肝脏置于塑料包埋盒中的OCT包埋剂中。然后，在零下20摄氏度冷冻30分钟。冷冻后，使用冷冻切片机切出八微米厚的切片。将切片贴附到载玻片上，并在室温下孵育30分钟。然后对切片进行染色。 在染色缸内，用10%福尔马林润湿一张纸巾。将载玻片置于染色缸中，在4摄氏度下进行五分钟的蒸汽固定。随后，将载玻片浸入60%异丙醇中三秒钟，重复此步骤两次。现在，向每张载玻片滴加数滴油红O工作液，确保覆盖全部组织。然后在室温下孵育15分钟。从此时起，应尽可能将载玻片避光保存。孵育结束后，用新鲜的60%异丙醇短暂冲洗载玻片两次，然后用蒸馏水轻轻冲洗两次。清洗后，尽可能去除切片上的水分，但不要使组织干燥。然后将切片浸入苏木精染液中染色一分钟。用流动的自来水冲洗切片5到10分钟，以去除苏木精染液。然后，用蒸馏水轻轻冲洗载玻片两次，并将其保存在新鲜的蒸馏水中，直至进行封片。进行封片时，将甘油明胶在微波炉中熔化，然后在组织切片上滴加数滴液化的明胶。在凝胶冷却前，小心地加盖盖玻片，避免产生气泡。实验起始材料为在六孔板中胶原包被的玻璃盖玻片上培养的分离原代肝细胞。在此模型中，首先将培养基更换为2毫升饥饿培养基，并将细胞孵育24小时。饥饿处理24小时后，调整培养基中含有30毫摩尔葡萄糖和100纳摩尔胰岛素，并让细胞继续孵育24小时。次日，移除培养基，并用2毫升PBS洗涤细胞，共洗涤两次。为了分析细胞，用橡皮筋将每张盖玻片固定在载玻片上，使细胞位于外表面。然后采用所述的油红O染色方法。该方法可应用于肝细胞以外的其他细胞。首先，将20至40毫克肝组织加入一个2毫升塑料离心管中。然后，加入1毫升PBS并匀浆组织。匀浆完成后，将裂解液转移至一个新的15毫升玻璃管中。接下来，加入5毫升氯仿与甲醇按2:1比例配制的混合液，剧烈涡旋振荡混合物1分钟。然后将

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

优化分析<em&gt;在体内</em&gt;和<em&gt;体外</em&gt;脂肪肝

油红O染色：一种用于体外检测肝细胞中性脂质以识别肝脂肪变性的技术

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。...

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

本报告描述了一种 体外 使用酶法测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性 利什曼原虫 细胞提取物。该实验基于放射性甲基从 S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至内源性磷脂酰乙醇胺。...

体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。...

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

本方案旨在作为研究肝细胞因脂质过度暴露而引发的脂肪变性，以及相关的分子、生化和细胞变化的工具 体外.

一种实验性脂肪变性的模型 体外肝细胞在脂质超载条件培养基中的培养

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

使用饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠模型，我们描述了一种新型方法的应用 体内...

新方法 在体 内 用于评估非酒精性脂肪性肝病进展的微型计算机断层扫描成像技术

基于三维重建技术分析荧光染色脂滴以评估肝脂肪变性

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。...

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

开发了一种光学系统，用于通过FITC标记的红细胞观察肝脏微循环，并利用激光辅助磷光测定法测量微血管中的氧分压。该方法可通过分析微血管结构、管径、血流速度和氧张力，研究生理和病理机制。...

肝微循环中血流与氧耗的可视化与分析：在急性肝炎模型中的应用

学习优化脂肪肝模型的体内外构建与表征方法，通过无创评估技术研究生理进展。该方法适用于脂肪肝、胰岛素抵抗及二型糖尿病等代谢疾病机制研究。

优化分析体内和体外肝脂肪变性

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优化分析 体内 和 体外 肝脂肪变性

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