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Imunoprecipitação de Cromatina
 
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Imunoprecipitação de Cromatina

Overview

Histonas são proteínas que ajudam a organizar o DNA em núcleos eucarióticos, servindo como "andaimes" em torno dos quais o DNA pode ser embrulhado, formando um complexo chamado "cromatina". Essas proteínas podem ser modificadas através da adição de grupos químicos, e essas alterações afetam a expressão genética. Os pesquisadores usam uma técnica chamada imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para entender melhor quais regiões de DNA associam a modificações específicas de histona ou outras proteínas regulatórias genéticas. Anticorpos são usados para isolar a proteína do interesse, e o DNA vinculado é extraído para análise.

Aqui, o JoVE apresenta os princípios por trás do ChIP, discutindo modificações específicas de histona e sua relação com a expressão genética e organização do DNA. Em seguida, revisamos como executar um protocolo ChIP e exploramos as maneiras como os cientistas estão usando essa técnica atualmente.

Procedure

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A imunoprecipitação de cromatina, ou "ChIP", é uma técnica usada por pesquisadores para avaliar interações proteína-DNA. Os fatores proteicos desempenham papéis importantes na regulação genética; não só organizam DNA em cromossomos, mas também se ligam a sequências específicas de DNA — chamados de sites regulatórios — para ativar ou reprimir a expressão. Durante o ChIP, a cromatina — que consiste em DNA e suas proteínas associadas — é "imunoprecipitada", o que significa que é isolada através do uso de anticorpos. Com esse método, os pesquisadores podem avaliar quais proteínas associam com as quais o DNA sequencia.

Neste vídeo, revisaremos as modificações da cromatina e seus papéis na regulação epigenética, e como o ChIP pode avaliar essas modificações. Em seguida, descreveremos um procedimento generalizado para esta técnica, e finalmente discutiremos como os cientistas estão usando o ChIP em pesquisa hoje.

Vamos começar revendo o que são modificações de cromatina e como estudá-las com ChIP.

Nos eucariotes, o DNA é armazenado em núcleos por ser "embrulhado" em torno de complexos proteicos. Essas proteínas são histones, e cada complexo de histona embrulhado em DNA é chamado de "nucleossomo". A expressão genética é regulada por "ocupação nucleossomo", ou se um trecho de DNA é embalado em nucleosmos. O DNA transcrito tende a ser localizado em regiões "livres de nucleossomo", que permitem que as proteínas se associem aos locais reguladores de um gene, e permitem que a polimerase de RNA realize a transcrição.

As evidências atuais sugerem que mudanças na estrutura da cromatina que regulam a expressão genética são mediadas por modificações químicas feitas em histones, geralmente em suas "caudas" em movimento livre. Os mais comuns são grupos de acetila, metila e fosfato que são adicionados ou removidos de aminoácidos específicos, e essas diferentes modificações de histona são observadas como associadas a diferentes níveis ou modos de expressão genética.

Por exemplo, a adição de três grupos de metila ao 27º resíduo de liseina no subunit de histona H3 — uma modificação chamada H3K27me3 — foi ligada ao silenciamento genético. Alternativamente, a modificação H3K9ac, onde um grupo de acetil é adicionado ao 9º resíduo de lise em histona H3, tem sido associada à ativação genética.

Modificações de histona são hipóteses para desempenhar um papel na regulação epigenética da expressão genética, marcando regiões de cromatina como "ativas" ou "silenciosas". Um mecanismo pelo qual acredita-se que as modificações de histona exerçam seus efeitos é recrutar fatores de transcrição ou enzimas de "remodelação" de cromatina, este último dos quais move fisicamente as posições dos nucleosmos.

Com o ChIP, modificações específicas de histona podem ser alvo de anticorpos, que podem ser "puxados para baixo" junto com o DNA circundante. Os pesquisadores podem então empregar PCR, microarrays ou sequenciamento para identificar regiões de DNA associadas a modificações histonas de interesse. Ao variar os anticorpos usados durante o ChIP, essa técnica também pode ajudar a identificar regiões de DNA vinculadas por fatores de transcrição e outras proteínas regulatórias.

Agora que você conhece os princípios por trás do ChIP, vamos passar por um procedimento generalizado para esta técnica.

Para começar, as células de interesse são coletadas e tratadas com produtos químicos como o formaldeído, que atuam como reagentes "transfronteiriços" e ajudam a fixar proteínas às sequências de DNA que associam, facilitando a formação de ligações covalentes entre elas. Deve-se tomar cuidado para não "tratar" as células com formaldeído, pois isso pode impactar a capacidade dos anticorpos de reconhecer suas modificações de histona alvo em estágios posteriores de ChIP. Para parar o processo de ligação cruzada, a glicina é adicionada à solução de formaldeído com a qual as células estão sendo tratadas. As células são então coletadas e lísmidas para liberar a cromatina.

Para solubilizar a cromatina e definir precisamente as regiões de DNA que se associam a histonas modificadas, a cromatina é mecanicamente "ensaboada" em pedaços menores usando ondas sonoras — um processo chamado sonicação. Normalmente, os cientistas pretendem criar fragmentos de cromatina de 200 a 1000 pares de base de comprimento. Uma vez que fragmentos de cromatina do tamanho desejado são gerados, um anticorpo é adicionado à solução, e a mistura é incubada para dar ao anticorpo tempo para reconhecer sua modificação de histona alvo.

Contas magnéticas às quais os anticorpos podem se ligar são então introduzidas na mistura, imobilizando os complexos de cromatina associados a anticorpos. As contas são coletadas através do uso de racks magnéticos, e lavadas várias vezes para enxaguar qualquer cromatina ou anticorpos não ligados.

Para liberar a cromatina deles, as contas são colocadas em uma solução contendo o SDS detergente, e depois de coletar as contas com um ímã, o sobrenante é mantido. A enzima proteinase K é então adicionada a esta solução para degradar todas as proteínas, incluindo histones, para que o componente de DNA da cromatina possa ser isolado. O DNA resultante é então purificado e analisado.

Vamos agora dar uma olhada em como os cientistas estão usando ChIP em seus laboratórios.

Muitos pesquisadores usam o ChIP para avaliar as mudanças nas modificações de histona provocadas por sinais extracelulares. Aqui, células humanas cultivadas foram tratadas com uma citocina específica, ou molécula de sinalização, e foram avaliadas alterações na metilação de histona. Ao avaliar o DNA chip com PCR em tempo real, os pesquisadores determinaram que — em resposta ao tratamento — o gene de codificação de fatores de transcrição IRF1 ganhou uma marca de histona ativando, H3K36me3. Essa modificação permitiu que tanto uma proteína regulatória quanto a polimerase RNA II se associassem ao IRF1,resultando em sua transcrição.

O CHIP também pode ser usado para obter insights sobre mudanças na expressão genética que ocorrem durante a lesão e regeneração tecidual. Neste experimento, os pesquisadores danificaram um componente do sistema nervoso periférico em camundongos — o nervo ciático — e, em seguida, usaram o ChIP para procurar novas interações DNA-proteína em outras estruturas do sistema nervoso periférico, como as gânglios que flanqueiam a medula espinhal. Os cientistas concluíram que após a lesão nervosa, a proteína p53, que é uma reguladora da reparação de DNA, tornou-se associada a um gene implicado na regeneração tecidual, GAP43.

Finalmente, alguns cientistas estão trabalhando para simplificar os procedimentos do ChIP para aumentar o rendimento e a eficiência dos experimentos. Aqui, os pesquisadores foram capazes de "automatizar" o ChIP, fazendo com que uma máquina realizasse muitas das etapas do protocolo. Isso permitiu que os pesquisadores avaliassem simultaneamente o DNA associado a várias modificações diferentes de histona, usando um número relativamente pequeno de células — 10.000 — produzindo resultados semelhantes aos vistos com números celulares maiores, ou com técnicas padrão de ChIP "manual".

Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre imunoprecipitação de cromatina. Neste vídeo, discutimos como o DNA e as proteínas juntos formam a cromatina, e os passos de um protocolo, chamado ChIP, que pode ser usado para identificar sequências de DNA associadas a estados ou proteínas específicas de cromatina. Também exploramos como os pesquisadores estão usando e modificando o ChIP para entender melhor o papel das interações DNA-proteína durante a regulação genética. Como sempre, obrigado por assistir!

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