בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד בו-זמנית קרדיומיוציטים חיים, תאי אנדותל ופיברובלסטים מלבב של חולדה לצורך ניתוחים בודדים in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקרדיווסקולרי הנוגעים למנגנוני האיתות המעורבים בהיפרטרופיה של הלב, פגיעה מאיסכמיה וreperfusion, תפקוד האנדותל ופיברוזיס של הלב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד בו-זמנית את כל תאי הלב העיקריים, מה שעשוי להפחית את עלויות המחקר הנלוות ואת מספר בעלי החיים בניסוי.

לאחר שטיפה אחת במים מזוקקים ושטיפה אחת ב-50 milliliter של מצע Powell, החליפו את המצע ב-80 milliliters של מצע Powell רענן, והשתמשו בפיפט פסטור מזכוכית מתוך גליל הזכוכית כדי לבצע פרפוזיה רציפה של המצע עם קרבוגן. לאחר מכן, השתמשו בשני זוגות של פינצטות דקות מעוקלות כדי לקבע לב של חולדה שנקצר זה עתה באמצעות האאורטה אל מערכת הפרפוזיה של Langendorff, והניחו את קצה הקנולה של מערכת הפרפוזיה בין הענף האאורטלי הראשון לבין המסתם האאורטלי. קבעו את האאורטה באמצעות תפס תנימים.

פתחו את שסתום הקנולה, ולאחר מכן קבעו את הלב באמצעות תפר כירורגי. הניחו ל-35 milliliters של תמיסת הפרפוזיה לעבור דרך הלב בטפטוף, כדי להסיר שאריות דם. הניחו את משפך האיסוף מתחת ללב, והפעילו את המשאבה הפריסטלטית כדי להזרים את תמיסת הפרפוזיה ממשפך האיסוף חזרה למאגר.

הוסיפו תמיסת קולגנאז למצע הפרפוזיה, ובצעו פרפוזיה ללב עם תמיסת הקולגנאז במחזוריות למשך 30 דקות. בסיום העיכול, השתמשו במספריים כדי להוציא את הלב ממערכת לנגנדורף (Langendorff) והניחו אותו בצלחת פטרי מזכוכית. כעת הסירו את שתי העליות וכל שארית של רקמת שומן מהלב.

כדי למנוע זיהום של תאי אפיתל, השתמשו בשתי פינצטות כדי לקלף בזהירות את פריקרדיום (קרום השבבת). חתכו את הלב לאורכו במרכז, והניחו את החצאים במקצץ הרקמות. קצצו את הלב שתיים עד שלוש פעמים, והעבירו את חתיכות הרקמה לפסולה קונית של 15 milliliter המכילה 12 milliliter של בופר עיכול מ퍼פוזיית Langendorff.

בצעו עיכול של פרגמנטי הרקמה בבן-מריה למשך חמש עד 10 דקות, תוך ערבוב מדי פעם בעזרת פיפטת פלסטיק חד-פעמית של 5 ml. לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים דרך נפה של 100 µm לתוך מבחנה קונית של 50 ml. שטפו את מערכת הפרפוזיה עם לפחות 1 L של מים מזוקקים, ולאחר מכן עם 100 ml של נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.1 N למשך 30 דקות; שטפו את המערכת שוב עם שניים עד שלושה ליטרים נוספים של מים מזוקקים, וייבשו את המכשיר באמצעות זרימת אוויר.

אספו את התאים המסוננים באמצעות סנטריפוגציה, והשתמשו בפיפט חד-פעמי כדי להעביר בזהירות את העילוי המכיל את תאי האנדותל ואת הפיברובלסטים למבחנה חדשה של 50 milliliters. השעיו מחדש את המשקע בשישה milliliters של תמיסת סידן אחת. לאחר דקה אחת, אספו את התאים בסנטריפוגציה שנייה, והשעיו מחדש את המשקע בשישה milliliters של תמיסת סידן שתיים.

לאחר דקה אחת, דללו את תרחיף התאים על ידי הוספה של 12 milliliters של תמיסת סידן שלוש, וערבבו היטב באמצעות הטיה עדינה. לאחר צנטריפוגה נוספת, השעיו את המשקע ב-20 milliliters של מצע CCT שחומם מראש. לאחר מכן, חלקו אליקוט של מיליליטר אחד של תאים לכל אחת מ-20 צלחות תרבית תאים סטריליות בנפח 35 millimeter המצופות מראש בלמינין, והניחו את התאים באינקובטור לתרבית תאים ללא פחמן דו-חמצמני, והחליפו את המצע בשני milliliters של מצע CCT טרי להסרת תאים מתים לאחר שעתיים.

כעת סנטריפוז את העל-נוזל המכיל את התאים האנדותליאליים והפיברובלסטים, והשהה מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של בופר לבידוד תאים אנדותליאליים. העבר את התאים לפח שמיכה של שני מיליליטר, והוסף לתאים נוגדן mouse anti-rat CD31 לדגירה של 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה. בסיום הדגירה, הוסף חרוזי Pan anti-mouse IGG לדגירה של 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב מקצה לקצה.

בסיום הדגירה עם החרוזים, הניחו את התאים במעמד מגנטי למשך שתי דקות, והשתמשו בפיפטה של 1 mL כדי להסיר בזהירות את העליון המכיל בעיקר פיברובלסטים. העבירו את הפיברובלסטים לצלח תרבית בן 10 cm המכיל 10 mL של מצע תרבית לתאי פיברובלסט, והניחו את התאים באינקובטור לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של באפר שטיפה למבחנה עם התאים האנדותליאליים וסגרו את המבחנה.

נער את התאים בעדינות ארבע עד חמש פעמים כדי להשעות מחדש את החרוזיים. לאחר מכן, החזר את המבחנה למגנט, והסר את תמיסת השטיפה לאחר דקה אחת. לאחר השטיפה האחרונה, החלף את תמיסת השטיפה ב-1 mL של מצע גידול לתאי אנדותל מסוג MV2, והשתיל את תאי האנדותל לתוך באער אחת של פלטת 12 באערים, לצורך גידול למשך לילה באינקובטור לתרביות תאים.

בסיום דגירת הפיברובלסטים, שטפו את התאים ההיצמדים עם נפח מתאים של PBS שחומם מראש, פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הוסיפו לתאים מצע גידול טרי ומחומם מראש עבור תאי פיברובלסטים, והחזירו את הפיברובלסטים לאינקובטור לתרבית תאים. למחרת בבוקר, החליפו את העל-נוזל (supernatant) בתרבית התאים האנדותליאליים במצע גידול טרי עבור תאים אנדותליאליים, והחזירו את התאים לאינקובטור, תוך החלפת המצע מדי יומיים עד שלושה, עד להגעה למצב של חצי-הסנכיות (semi-confluency).

לאחר מכן, שטפו את תרבית תאי הפיברובלסטים ההדבקים עם PBS טרי ומוחמם מראש כפי שהודגם זה עתה, והזינו את התאים במצע טרי ומוחמם מראש. פרוצדורת בידוד הקרדיומיוציטים מניבה אוכלוסייה של תאי לב מופסננים, דמויי מוט, חיוניים ובדרגת טוהר של 70 עד 80%. כעת ניתן לבצע ניתוח של תנודות סידן תוך-תאיים בקרדיומיוציטים מבודדים שנטענו ב-fura AM, בתגובה לאיסכמיה וreperfusion בקרדיומיוציטים, וכן ניתוח של שינויים באיתות סידן בתאי אנדותל ובפיברובלסטים שבודדו באמצעות חרוזי מגנט, לאחר הוספת ATP.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלימה תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר את מערכת הפרפוזיה בצורה נכונה, ולקבע את הלב במערכת באופן מיידי ברגע שהיא מוכנה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר המערכת קרדיו-וסקולרית לבחון את השליחויות המעורבות בפתולוגיות קרדיו-וסקולריות שונות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של העקרונות הבסיסיים של בידוד ותרבית תאי לב. זכרו כי עבודה עם מכשירים כירורגיים וריאגנטים לתרבית תאים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש זהיר במכשירים והרכבת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.