Name: 電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶマウス短軸心室スライスの調製法。振動ブレードマイクロトームを用いて生きた組織を取得し、ガラス微小電極で電気生理学的記録を行う。心臓電気生理学と細胞治療研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、神経生理学研究所のワークショップと動物施設が提供する支援を認めています。この作品は、Walter und Marga Boll-Stiftung、KölnFortune、Deutsche StiftungfürHerzforschungによって支持されました。

動物の取扱いは、地域の動物福祉委員会の指針と、欧州議会の2010/63 / EU指令に適合していなければならない。 1.ソリューションの準備<ol><li> NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5,2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）30を用いて、Ca 2+ （mMの組成）を含まないTyrode溶液を調製する。 4℃でNaOHで処理した。 </li><li> NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5、BDM 30、CaCl 2 0.9のCa 2+ （mM単位の組成）でTyrodeの溶液を調製する。 4℃でNaOHでpHを7.4に調整する。 </li><li> 4％低融点アガロースの調製：Ca 2+を含まないTyrode溶液15 mLに低融点アガロース0.6 gを入れます。アガロースが溶解するまで、混合物を電子レンジで750Wで10-15秒間2回加熱する。溶液を37℃の一定温度に保ち、＃176; Cを添加し、連続的に攪拌する。 </li><li> 37℃で血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）をカルボゲン（5％CO 2、95％O 2 ）で泡立てた状態に保つ。 </li></ol> 2.ミクロトームの準備<ol><li>ミクロトームのスイッチを入れる。 </li><li>外側のミクロトームチャンバーを氷で満たします。 </li><li>内部ミクロトームチャンバーをCa 2+を含まない氷冷Tyrode溶液で満たし、溶液を100％O 2で連続的に酸素化する。 </li><li>スチールブレードをミクロトームのブレードホルダーに置きます。 </li></ol> 3.マウス心臓の分離<ol><li> 2,500Uのヘパリンを皮下に注射する。 15分待ちます。 </li><li>頚椎脱臼によって動物を犠牲にする。 </li><li>胸骨を開ける。 </li><li>慎重に小さなはさみと鉗子＃5を使用して心膜を切開する。 </li><li>上行大動脈にカニューレを挿入し、 その場で冠状動脈を氷で冷やすTyrode&#39;s残りの血液が取り除かれるまで、Ca 2+を含まない溶液である。 </li><li>穏やかに鉗子とはさみで心臓を切除し、冷たいタイロードの溶液をCa 2+なしで乗せて移します。 </li><li>メスまたはハサミで心房を心室から分離する。 </li></ol> 4. 4％低融点アガロースへの心室の埋め込み<ol><li>アペックスを上向きにして心室をアガロースモールドに置きます（ 図1 ）。左心室の金型の中央にピンを置きます。 </li><li>心臓が完全に覆われるまで、37℃で4％低融点アガロースでモールドを満たす。 </li><li>金型を氷上に置き、アガロースのより速い硬化が組織の浮きを防止するようにする。 </li><li>メスを用いて、心室を含むアガロースブロックを金型から取り出す。 </li><li>ブロックを裏返しにして、心室と、アガロースブロックの裏側の隙間を満たします。20Gの針を備えたシリンジを用いて4％低融点アガロースを用いてモルトのピンによって放置された。 </li><li>メスでアガロースブロックをトリムして、ブロックの平坦な底部および心尖部の直立位置を達成する。 </li></ol> 5.心室のスライス<ol><li>シアノアクリレート接着剤を滴下してミクロトームの試料ホルダーにブロックを固定する。心尖部を上に向けます。 </li><li>標本ホルダーをミクロトームの内部標本チャンバーに置き、Ca 2+を含まない氷冷タイロードで満たします。タイロードの溶液でアガロースブロックを完全に覆います。 </li><li>さらなる適用（シャープな電極記録150-200μmの場合）に応じて150〜400μmの厚さの短軸スライスを準備し、ブレードの振動周波数を60〜70Hzに保ち、できるだけゆっくりとブレードを前進させる。 </li><li>細かいブラシを使用して、残りのアガロースをスライスから慎重に除去します。 </li><li>優しくトランスファー0.9mMのCa 2+を含むTyrode溶液にパスツールピペットでスライスし、100％O 2を通気し、スライス手順から回復するために氷上で少なくとも30分間貯蔵する。 </li><li>その後、37℃でDMEM中で30分間スライスし、カルボジェンを通気し、その後の使用の前にBDMを洗い流す。 </li></ol> 6.シャープな電極セットアップの準備<ol><li>予熱のために、録音が始まる30分前にすべての電気装置をオンにします。 </li><li> 3cmの細胞培養皿を、倒立顕微鏡上に置かれた加熱プレート上に置く。 </li><li>ディッシュにカスタムメイドのリング電極（ 図2 ）を置き、プリアンプと刺激電極のアース線を接続します。 </li><li>灌流システムのフレキシブルチューブを皿に接続します。 </li><li> carbogenを通気したDMEMで灌流システムのリザーバを満たしてください。 </li><li>灌流ポンプのスイッチを入れ、潅流を設定する2~3mL /分である。 </li><li>フローヒーターと加熱プレートを調節して、ディッシュ内のDMEMの温度を37°Cに調整します。 </li></ol> 7.アクション潜在的なレコーディング<ol><li> DMEMで満たされた皿に心室スライスを置く。 </li><li>倒立顕微鏡を用いて組織の構造的完全性および生存能力（収縮機能に基づく）をチェックする。 </li><li>記録用ガラス電極に3M KCLを充填する。 </li><li>刺激電極をDMEMで満たす。 </li><li>記録電極と刺激電極を電極ホルダーの上に置く。 </li><li>スライス上に刺激電極を注意深く置き、電気刺激装置をオンにします。 1〜2Hzの刺激周波数で開始する。 </li><li>マイクロマニピュレータを使用して記録電極を目的の記録位置に移動します。 </li><li>先端が組織に触れるまで、記録電極をゆっくりと下げる。 </li><li>短い長方形の電気パルスを記録電極が細胞膜を貫通する。 </li><li>安定した信号が得られるまで記録電極の位置を慎重に変えてください。 </li><li>活動電位の記録を開始する。 </li></ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li>
<li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).</li>
<li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+%28Fabaceae%29+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li>
<li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li>
<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

著者は宣言することは何もない。

心室スライスは、組織構造のような保存されたインビボでの電気生理学的、薬理学的および機械的研究ならびに心臓のすべての領域への測定技術の直接アクセスを可能にする。生理学的作用潜在的特性は、胚、新生児および成人のスライス9,10,11において示されている。スライシング手順によって直接損傷された表面層を除いて、スライスの活性は、活力染色によって確認された9 。鋭利なガラス電極を用いたスライス内の活動電位記録を用いて、本明細書に記載の移植心筋細胞の統合および成熟、または心臓活性化合物を添加した後の薬理学的研究を調査することができる。個々の細胞で1時間以上の長期間の記録が可能です。この記録時間は、逐次灌流およびウォッシュアウトによる1つの細胞に対する異なる薬理学的化合物の影響。 重要な準備ステップ切片の品質を最適化するために、虚血組織損傷を避けるべきである。したがって、Tyrodeの溶液による心臓の心臓の灌流、急速な心臓切除および氷冷酸素添加Tyrode溶液における即時保存が重要...

YamamotとMcllwainは1966年に脳切片の電気的活動がin vitroで維持されていることを示して以来、薄い組織切片が基礎科学で頻繁に使用されています1 。それ以来、脳2 、肝臓3 、肺4および心筋組織5,6,7の切片について電気生理学および薬理学的研究が行われてきた。新生児ラット心臓からの心室スライスにおける最初のパッチクランプ記録は1990年8月に記載されていたが、この技術はしばらくの間忘れ去られた。 10年以上後、我々のグループは、マウス胚9 、新生児10および大人11の心臓スライスを調製するための新しい方法を確立した。これらの生存可能な組織切片は、急性実験（成人スライス数時間栽培することもできる）または短期間の培養実験（胚および新生児スライスを数日間培養することができる）。スライスは、電気生理学的特徴および鋭い電極活動電位およびマイクロ電極アレイ記録11によって評価される均一な励起広がりのようなインビボで示す 。 「2次元」形態のため、脳室内のすべての領域に記録電極を直接アクセスすることができ、電気生理学的調査のための興味深いツールとなり、Langendorff灌流心臓全体と比較して新しい実験的選択肢をもたらす。ベラパミル（L型Ca 2+チャンネルブロッカー）、リドカイン（Na +チャンネルブロッカー）、4-アミノピリジン（非選択的電圧依存性K +チャンネルブロッカー）およびリノパルジン（KCNQ K）のようなイオンチャネルブロッカーに対するスライスの薬物応答は、 +チャンネルブロッカー） 9,11 </sup&gt;は、解離した心筋細胞に対する既知の効果に対応した。等尺性力測定は正の力周波数関係を示し、無傷の収縮機能を強く示唆した10 。これらの発見は、マウス心室スライスが、生理学的および薬理学的研究のためのインビトロ組織モデルとして適切であることを実証した。さらに、鋭い電極記録と組み合わせたレシピエント心臓の心室スライスは、移植された胎児12,13,14および幹細胞由来の15の心筋細胞の電気的および機械的な統合ならびに成熟を特徴付ける非常に有用なツールであることが判明している。 要約すると、心室スライスは、価値ある、十分に確立した多細胞組織モデルであり、解離した心筋細胞およびランゲンドルフ灌流心臓に対して相補的であると考えられるべきである（解離した細胞とは対照的に） インビボのような組織構造を提供すること、および（心臓全体の準備とは対照的に）鋭い電極記録のような測定技術の直接的なアクセスを心臓の全ての領域に提供することの大きな利点がある。

<table><tbody><tr><td>ライカVT 1000s</td><td>ライカマイクロシステムズ、ウェッツラー、ドイツ</td><td></td>振動<td>ブレード付きミクロトーム。</td></tr><tr><td>ステンレス鋼の刃</td><td>カムデンインスツルメンツ、ラフバラ、イングランド</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>シグマ・アルドリッチ、セントルイーズ、アメリカ</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>ファインブラシ、例えばサイズ6(4/32")</td><td>VWR、インターナショナル、ラドナー、アメリカ</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>準備テーブル</td><td></td><td></td><td>は</td></tr>、<tr><td>心室を埋め込むための自作脱皮アガロース</td><td></td><td></td><td>自作</td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>ベクトン、ディキンソン;フランクリンレイクス、米国</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4 インチ 針</td><td>ブラウン、メルスンゲン、ドイツ</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2 インチ 針</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小さなはさみ</td><td>WPI、サラソタ、米国</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット #5、0.1 x 0.06 mm チップ</td><td>WPI、サラソタ、米国</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>酸素ガス (医療グレード O2)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>Henkel, D&uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイス・アクシオーバート 200</td><td>ツァイス, オーバーコッヘン, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低倍率マイクロマニピュレーター</td><td>習志重, 東京, 日本</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>高倍率・3軸マイクロマニピュレーター</td><td>楢重, 東京, 日本</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>蠕動灌流ポンプ</td><td>マルチチャンネルシステム、ロイトリンゲン、ドイツ</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2チャンネル温度調節器</td><td>マルチチャンネルシステム、ロイトリンゲン、ドイツ</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>方形パルス刺激装置</td><td>Natus Europe GmbH、プラネッグ、ドイツ</td><td>グラスSD9</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細血管</td><td>WPI、サラソタ、アメリカ</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

マウス心筋細胞は、心臓生理学および新しい治療戦略のインビトロ研究に広く使用されている。しかし、解離した心筋細胞の多細胞調製物は、心臓の機械的および電気生理学的特性の両方に影響を与える、心筋細胞、非心筋細胞および細胞外マトリックスの生体内構造の複合体を代表するものではない。ここでは、保存されたインビボのような組織構造を有する成体マウス心臓の実行可能な心室スライスを調製する技術を説明し、電気生理学的記録のためのそれらの適合性を実証する。心臓の切除後、脳室を心房から分離し、2,3-ブタンジオンモノオキシムを含有するCa 2+不含溶液で灌流し、4％ 低融点アガロースブロックに包埋する。このブロックを振動刃付きミクロトーム上に置き、厚さ150〜400μmの組織切片を作製し、振動をfreブレードを60-70Hzで回転させ、ブレードを可能な限りゆっくりと前進させる。スライスの厚さは、さらなる用途に依存する。スライスを、0.9mMのCa 2+および2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含む氷冷Tyrode溶液に30分間保存する。その後、スライスを37℃のDMEMに30分間移してBDMを洗い流す。スライスは、収縮機能を分析するための力測定、または移植された幹細胞由来の心筋細胞と宿主組織との相互作用を調べるために、鋭利な電極または微小電極アレイを用いた電気生理学的研究に使用することができる。鋭い電極記録のために、スライスを倒立顕微鏡の加熱プレート上の3cm細胞培養皿に入れる。スライスを単極電極で刺激し、スライス内の心筋細胞の細胞内作用電位を鋭利なガラス電極で記録する。

心筋梗塞は、実質的に不可逆的な心筋細胞の喪失をもたらす。外因性心臓再生のための幹細胞由来心筋細胞を用いる細胞補充療法は有望な治療アプローチである。移植された細胞の電気的統合および成熟は、細胞置換療法の安全性および効率のために重要である。 組込みおよび成熟を評価するために、本発明者らは、成熟マウスの健康な心臓に、増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現する、誘発された多能性幹細胞（iPSCM; 0.5×10 6 iPSCM /10μLの2回の注入）に由来する心筋細胞を移植した（Peinkofer et al。方法の詳細な説明については15 ）。移植の6日後、レシピエント心臓の心室スライスを記載のプロトコールを用いて調製した。代表的な録音は図3移植されたiPSCMを含むスライスを37℃でDMEMに入れ、宿主組織中に配置された単極性電極によって局所的に刺激した（ <...

ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

この手法の全体的な目的は、電気生理学的記録に適した生存可能な心室心臓スライスを得ることにあります。この方法は、移植された心筋細胞の電気的な統合や、心臓活性薬の効果など、組織レベルでの心臓電気生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、生存可能な心室組織スライスがin vivoに近い組織構造を維持していることであり、心臓のあらゆる領域で直接的な測定が可能になることです。この手法はマウスの心臓電気生理学に関する知見を提供できますが、ウサギやモルモットなどの他の動物にも適用可能です。この手順を開始するには、まず動物の皮膚を70% ethanolで拭きます。胸腔を開いた後、小鋏とピンセットを用いて心膜を慎重に剥離します。左心室にカニューレを挿入し、残存血液が除去されるまで、氷冷したカルシウム不含Tyrode液で心臓をin situで灌流させます。その後、心臓を慎重に摘出し、氷冷したカルシウム不含Tyrode液に移します。メスまたは鋏を用いて、心房を心室から分離します。次に、心室を心尖部が上を向くようにアガロース型に配置します。続いて、型の中心かつ左心室腔にピンを挿入します。心臓が完全に覆われるまで、37 °Cの4%低融点アガロースを型に満たします。次に、組織の浮上を防ぐため、アガロースを速やかに硬化させる目的で、型を氷上に置きます。1分後、メスを用いて、脳室を含むアガロースブロックを型から取り出します。その後、ブロックを裏返しにし、シリンジを用いて脳室腔およびアガロースブロック背面の隙間に4%低融点アガロースを充填します。次に、メスでアガロースブロックをトリミングし、底面を平らにし、心尖部を直立させます。この手順では、心尖部を上にした状態で、シアノアクリレート系接着剤を少量用いてブロックをミクロトームの試料ホルダーに固定します。続いて、カルシウムを含まない氷冷Tyrode液を満たしたミクロトームの内側試料チャンバーに試料ホルダーを設置します。アガロースブロックがタイロード液で完全に覆われていることを確認します。今後の用途に応じて、切片を 150 から 400 micrometers の厚さで作製します。ブレードの振動周波数を 60 から 70 Hertz に維持し、可能な限りゆっくりとブレードを前進させます。その後、細筆を用いて切片から残りのアガロースを慎重に取り除きます。次に、パスツールピペットを用いて切片を、100%酸素でエアレーションした0.9 millimolarカルシウム含有Tyrode溶液へと静かに移します。切片作製の手順から回復させるため、氷上で少なくとも30分間保存します。スライスをネットの上に置くことで、平坦な状態を維持できます。その後、フィルターペーパーと2枚目のネットを用いて、37°Cでカルボゲンをバブリングした

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

高周波ドップラー超音波は、局所的な心筋機能を評価するための新しい技術です。この作品は、心筋の歪み、DP / dtは、虚血 -...

高周波高分解能心エコー検査：虚血 - 再灌流マウス心臓における心筋ストレイン、収縮性、および僧帽弁閉鎖不全の非侵襲的な反復測定に関する最初の証拠

外科手術による外傷、炎症反応を誘導する。サイトカイン、内因性リガンドは、虚血再灌流後に心筋梗塞サイズを調節することが知られています。我々は、開胸の影響を最小限に抑えるためにぶら下がって重みを使用してマウスの虚血再灌流の変更されたクローズド·胸のモデルを提示します。...

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

このビデオは、ブタの心臓の生存可能な超薄切片を生成するためのビブラートムベースの手順を示しています。調製した組織切片は培養し、薬理学的試験のモデルシステムとして使用することができます。...

ブタ心室スライスの生成:ブタ心臓組織の超薄スライスを調製するためのビブラトームベースの技術

若いマウスで脊髄の斜めスライスを準備する方法を示します。この調製により、腹根の刺激が可能になります。...

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。...

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。...

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

このプロトコルは、6日間の生理学的条件下で心臓組織をスライスおよび培養する方法を説明する。この培養システムは、3D心臓モデルにおける急性心毒性の信頼性の高いテストと同様に、新しい心不全治療薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用することができる。...

生理学的条件下での豚の心臓のスライスと培養

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

複雑な解剖学的構造のため、心臓サンプルの一貫して再現可能な解剖および採取プロトコルを実装するのは難しい場合があります。この原稿は、いくつかの標準的な心臓解剖プロトコルの重要な要素を提示し、肉眼検査アプローチと組織病理学的検査に一般的に使用されるサンプリング部位の両方を強調しています。...

循環器疾患大型動物モデルにおける心臓の解剖技術と組織学的サンプリング

我々は、ヒト心室心筋組織の エクスビボ 培養のためのプロトコールを提示する。これは、収縮力および動態の詳細な分析、ならびに インビボ 生理学的環境をより密接に模倣するための前負荷および後負荷の適用を可能にする。...

長期培養のためのヒト心筋組織の作製

学ぶマウス短軸心室スライスの調製法。振動ブレードマイクロトームを用いて生きた組織を取得し、ガラス微小電極で電気生理学的記録を行う。心臓電気生理学と細胞治療研究に有用です。

電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス

さらに動画を探す