Name: 在低温下测量水性玻璃的密度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解低温下测定水性玻璃态密度的实验方法，用于分析微升至皮升级水溶液样品在低温生物学和低温晶体学中的物理性质变化。该技术可快速测定样品密度和相态。

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本工作获得美国国家科学基金会（NSF）MCB-1330685 项目资助。DWM 承谢康奈尔大学分子生物物理学培训项目（NIH T32GM0082567）提供的部分支持。

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。使用压缩气体时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用经过适当校准的气体调节器和阀门，以及经过认证的气体管路。接触液态低温液体可能导致严重的冻伤和组织坏死。使用液态低温液体时，应穿戴适当的个人防护装备（如面罩、手套、实验服、长裤、不露脚趾的鞋子），所有防护装备必须能够防止液氮渗透。操作液态低温液体时应保持站立姿势，并确保设备周围有畅通无阻的撤离通道。使用压缩气体和液态低温液体时，需警惕窒息风险，应在通风良好、具有充足补风的区域进行操作（如通风橱或高换气频率的房间）。
1. 密度测量用 aqueous 溶液的制备
注意：由于质量比体积更容易精确测量，因此溶液浓度以质量/质量（w/w）单位表示。所有密度以及熔点或沸点均基于大气压力约为 100 kPa 的条件。以下步骤描述了 35% w/w 甘油溶液的配制方法。相同方法也可用于其他浓度和溶质的溶液制备。
<ol>
	<li>针对每种关注的溶质类型和浓度，大致估算所需溶质质量，以获得目标终浓度（例如，25% w/w 至 100% w/w 之间），总体积为 Vtot = 10 mL 溶液。例如，对于 35% w/w 的甘油溶液（ρs = 1.26 g/mL），溶质质量 ms 为： 
	<img alt="静态平衡公式；方程显示质量计算；含 xV_tot、ρ_s、ρ_w 符号。" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
	其中 x 为溶质质量分数（0.35），ρw = 1 g/mL 为水的密度。</li>
	<li>将一个 15 mL 离心管（或其他体积标定的防水容器）置于分析微量天平的秤盘上。向管中加入所需质量的溶质/冷冻保护剂（例如，配制 35% w/w 溶液时加入 3.77 g 甘油），并记录实际溶质质量。</li>
	<li>加入高纯度（>18 MΩ）去离子水，使溶液总质量达到 10.0 g。</li>
	<li>对容器进行涡旋振荡，液体溶质持续 30 秒，固体溶质持续 5 分钟，直至溶液在光学上均匀一致。</li>
	<li>测量并记录溶液的最终质量。用密封盖封存容器，并在恒定温度（293–298 K）下保存。</li>
</ol>
2. 样品冷却室的制备
<ol>
	<li>将下述实验装置置于密闭容器中，并通入干燥空气（&gt;5% 相对湿度（r.h.）进入封闭空间。 
	注意：该 enclosure 可以是一个简单的金属框架，顶部和三个侧面用透明塑料片密封，第四个侧面覆盖柔性塑料片以供实验操作。实验人员应佩戴面罩并穿着全身防护服，以尽量减少实验者引入的湿气。冷凝水和冰的形成可能从多个方面干扰低温密度测量，因此必须尽量减少。</li>
	<li>在4.5 L玻璃杜瓦瓶底部放置一片氯丁橡胶垫，以保护杜瓦瓶免受损坏。</li>
	<li>小心地将一个高导热性铜室（底部密封的空心圆柱体）插入烧瓶中，直至其底部接触橡胶垫片。调节从铜室向外伸出的支撑杆，使其与杜瓦瓶壁接触，确保铜室居中且无晃动倾向。 
	注意：杜瓦瓶将用于盛装液氮，而体积小得多的铜制腔室将用于盛装液氮2-氩气混合物。液氮提供一个恒温热浴，使铜室及其内容物保持在77 K的恒定温度，同时减少腔室内的沸腾和蒸发损失。腔室的小直径可抑制可能干扰浮力测量的表面波，并有助于将腔室内的液体与装置其他部位形成的霜和冰隔离。</li>
	<li>插入一根带有干燥 N₂ 气体的气体管出口2 以约 2 L/min 的流速将气体通入铜制腔室底部，以置换腔室内的潮湿空气。</li>
	<li>将液氮缓慢倒入铜室外部的杜瓦瓶中，留出足够时间让氮气挥发。 
	注意：停止加热沸腾后，最终液面应距离铜室顶部约 4 cm 处。</li>
	<li>用环形泡沫隔热盖覆盖杜瓦瓶的外部。移除干燥的 N2 将气体吹扫管从铜室中取出，并插入盖子上的对应孔洞中。 
	注意：N 的组合2 杜瓦瓶蒸发的气体以及吹扫气流可排出潮湿空气，防止其在冷表面凝结并形成晶体。</li>
	<li>缓慢将液氮倒入铜腔室中。待沸腾停止后，最终液面高度应距离铜腔室顶部约 4 cm。</li>
	<li>在盖子的中央开口或通气孔上放置一层薄而光学透明的塑料膜，并降低 N2 气体流速调至约0.2 L/min，使氮气保持轻微正压2 低温液体上方气相空间中的气体。 
	注意：只要杜瓦瓶和腔室内存在低温液体，就需持续调节 N2 根据需要调节气体流量，以维持此正压并防止湿气进入杜瓦瓶内形成冰。</li>
</ol>
3. 测定测试质量在 T = 298 K 和 T = 77 K 时的体积与密度
<ol>
	<li>将一个约 1 g、约 0.4 mL 的聚四氟乙烯（PTFE）测试质量块（材料表）置于已校准的分析微量天平的秤盘上，测定其在空气中的表观质量，温度为 T= 298 K。</li>
	<li>使用气体比重计，或使用游标卡尺进行尺寸测量，测定测试质量块在 T = 298 K 时的体积 V(298 K)。若采用尺寸测量法，测试质量块必须具有简单且精确的几何形状（无锥度或圆角），并应测定用于悬挂的通孔体积。</li>
	<li>根据下式对测得的表观质量进行空气浮力校正，计算测试质量块的真实质量 m： 
	<img alt="质量计算公式，m = 空气中表观质量 + ρ_空气×V(298K)，热力学概念。" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式"> 
	其中 ρair = 1.23 g/L（约为 0.1% 的校正值）。</li>
	<li>将微量天平放置在杜瓦瓶上方约 10 cm 处的稳定平台上，并验证其校准状态。使用一根直径为 2 mil（50 μm）的单丝线，一端连接微量天平底部的挂钩（专用于悬挂质量测量），另一端穿过测试质量块上的孔将其悬挂。测定其在空气中的表观质量，并与步骤 3.3 的测量结果进行比较，必要时对丝线质量进行校正。</li>
	<li>通过测量测试质量块在纯液氮中的表观质量 mapp in LN2，测定其在 T = 77 K 时的体积 V(77 K)。将测试质量块缓慢浸入铜室内的液氮中，直至完全浸没。待沸腾停止后，测量其表观质量。 
	注：若铜室内的液氮处于静止状态，且微量天平与液面之间的空气扰动极小，则该质量测量的准确度可优于 ±0.0002 g。</li>
	<li>估算丝线浸没部分所受的浮力，并验证其相对于测量误差可忽略不计。</li>
	<li>根据已知的质量 m 及在 77 K 下测得的液氮中表观质量 mapp in LN2，按以下公式计算测试质量块在 77 K 时的体积和密度： 
	<img alt="根据液氮中表观质量计算 77K 时体积的公式；科学公式。" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式"> 
	其中 ρLN2(77 K) = 0.807 g/mL。</li>
</ol>
4. 初始液体氮的制备2-氩气混合物
<ol>
	<li>以约 2 L/min 的流速将 Ar 气体通过盘管输送至出口。将盘管放置在用于固定铜腔位置的上部支撑杆上方，位置略高于液氮液面，但低于杜瓦瓶的顶面。冷 N2 氩气将在低温液体上方聚集，而热传导、对流和辐射会使管道及其内部的氩气冷却。</li>
	<li>让盘绕的管子冷却5分钟后，将管子的出口置于铜制腔室中，且至少低于液氮液面10 cm。然后用环形盖和透明板盖住杜瓦瓶。</li>
	<li>调节氩气流速，直至有氩气泡从导管出口上升至液氮液面。随后降低流速，使气泡在出口处形成，但在即将到达液氮表面之前即溶解或液化。 
	注意：随着铜腔内 Ar 浓度的增加，需定期根据需要调整 Ar 流速，以维持气泡的形成。如果 Ar 流速过低，Ar 可能在管内冻结并堵塞气流。</li>
	<li>根据需要添加液氮，以维持其在周围杜瓦瓶中的液位。当冷表面结霜时，及时清除。</li>
	<li>定期插入细（例如，35 微米）的圆形铜箔片，将其固定在一根细的绝缘棒上，插入铜室中，并像活塞一样缓慢地上下来回移动。这将减少浓度梯度，并降低氩气从溶液中析出结晶的趋势。</li>
</ol>
5. 测定并调节初始 N2-Ar 混合气体的密度
<ol>
	<li>计算 N 的目标密度2-Ar 混合物通过估算 T =77 K 时待测样品的密度， 例如，对样品中非水组分在较高浓度下的测量。</li>
	<li>使用单丝线将测试质量块悬挂在微量天平称量盘下方的挂钩上，测量其在空气中的表观质量，并确认该数值与步骤3.1中的测量结果一致。</li>
	<li>混合 N2- 加入 Ar 溶液以消除浓度和密度梯度，步骤同 4.5。</li>
	<li>将测试质量块预冷至 T = 77 K，方法是将样品放入铜室外部的液氮中。将测试样品提升至液氮上方的冷氮气层中，等待残余的液氮从样品表面完全蒸发，然后将已冷却且干燥的样品放入N2-氩气混合物，直至其完全浸没且距离液面2 cm以内。</li>
	<li>待沸腾和表面波纹完全消失后，测量测试物的表观质量。利用其真实质量计算溶液密度 m 和 T = 77 K 体积 V（77K）来自步骤 3.7，具体如下： 
	<img alt="低温液体密度方程；公式；用于77K下的密度计算；科学分析。" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
	<li>通过持续通入 Ar 增加溶液密度，直至达到所需的初始密度。若样品液滴下沉，则容易丢失，因此初始密度应比预期样品密度至少高出几个百分点。样品将因此上浮，便于追踪观察，而 N2- Ar 混合物的密度随后只需通过添加液态 N₂ 进行下调即可2.</li>
	<li>取下氩气预冷却盘管，待其升温并干燥后，再用于下一次实验。</li>
</ol>
6. 冷却样品溶液液滴
<ol>
	<li>在滴加样品并冷却之前，重复步骤 1.5 以混合氮气/氩气低温液体。注意不要引入任何气泡。</li>
	<li>取下样品管的密封盖。使用一支洁净的 1 mL 注射器吸取最多 1 mL 溶液，并重新盖上盖子。在注射器上安装一根 27 至 33 G 的针头，然后推动少量样品通过针头，以排出空气及之前残留的物质。</li>
	<li>有两种方法可用于将样品液滴喷射到 N2-Ar 混合液中。
	<ol>
		<li>对于含有较高非水组分浓度（>45% w/w）且可在适度冷却速率下实现玻璃化的样品，可轻压注射器，使少量液滴（直径 250 μm 至 1 mm，体积约 10 nL 至 1 μL）依靠表面张力悬挂在针尖处。轻轻敲击针头，使液滴脱离并朝向液态 N2-Ar 混合物飞出。</li>
		<li>对于需要更快冷却速率才能实现玻璃化的样品，将连接至真空发生器（由实验室压缩空气提供）的气体管出口置于液态 N2-Ar 混合物上方的气相空间内，并轻轻抽吸除去形成的冷气体层。这可提高小样品的冷却速率11。
		<ol>
			<li>小心地将针尖接触一条厚度为 25–75 μm 的透明聚合物条，以释放出少量样品（<10 nL，对应液滴直径 <200 μm）。 
			注：为了获得最小、最接近球形且最容易去除的液滴，应在样品点样前将该聚合物条浸泡在疏水涂层溶液中 10 分钟，随后晾干。</li>
			<li>使用连接的塑料或木棒夹持聚合物条，并手动将棒连同聚合物条一起浸入液态 N2-Ar 混合物中。</li>
			<li>待液滴完全固化且沸腾停止后，用镊子夹住与棒相对的聚合物条边缘。保持聚合物条浸没在液态 N2-Ar 中，弯曲条带直至样品液滴弹落并浮至表面。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 样本状态的评估
<ol>
	<li>使用长工作距离（5-10 cm）的双目显微镜，并采用LED或光纤照明器提供的明亮、冷光源，在保持液滴浸没于液氮-氩（N2-Ar）中的同时仔细检查液滴。玻璃化液滴应呈现透明状态12,13。若液滴浑浊或呈云雾状（可能含有多个相），和/或出现光学缺陷（如裂纹，可能与改变平均密度的空隙相关），则应弃用。 
	注意：将铜室内部表面涂成黑色，有助于识别样品缺陷。</li>
</ol>
8. 样品密度的测定
<ol>
	<li>分配出的液滴最初会在 N2-Ar 混合物中上浮、下沉，或（较少见）呈中性浮力。上浮的液滴有时可能因表面张力、微小气泡或附着的冰粒而被托住。使用显微镜检查整个液滴表面。用一根预先冷却的小型塑料或木制细棒（直径 2–3 mm，长 10 cm）将液滴从液体表面轻轻向下推离，并观察其行为。</li>
	<li>如果液滴下沉，则按照第 4 步所述方法增加液态 N2-Ar 混合物的密度，直至液滴变为中性浮力或开始上浮。</li>
	<li>如果液滴上浮，则通过使用 1.8 mL 冻存管添加液氮来降低液态 N2-Ar 的密度。在初始混合物密度较高时（1.2–1.3 g/mL），每次添加 1 mL 的 N2 可引起明显的密度变化；但在较低密度时（0.8–0.9 g/mL），应将添加量增至约 5 mL。使用薄的带孔铜箔在铜腔内上下轻轻搅动，以均匀混合 N2-Ar 混合物（注意避免使样品液滴丢失）。</li>
	<li>每次添加 N2 后，使用预先冷却的小细棒轻轻将上浮的液滴向下推入液体中，观察其返回液面的速度。</li>
	<li>当溶液密度调节至液滴表现为中性浮力或上升非常缓慢（<50 μm/s 可确保对体积低至 50 pL 的液滴实现约 0.1% 或更高的密度测量精度）时，按照第 5 步所述方法测量 N2-Ar 混合物的密度。随后继续添加液态 N2，直至液滴刚开始缓慢下沉，再次测量 N2-Ar 混合物的密度。这两次测量值将为液滴密度提供上下限范围。</li>
</ol>

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<li>Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?do5023">Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions.</a> J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).</li>
<li>Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Radiation+Damage+Limit+with+Cryo-SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS.</a> Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本装置和方法主要由本科生开发，所用仪器制造工具和设备有限，但仍可对小至50 pL的单个液滴实现高精度密度测量。在质量分数接近或高于50%的浓度范围内，仅需较小的冷却速率即可获得玻璃化样品，测得的密度与先前对体相样品测量的结果一致。将当前测得的密度外推至0%浓度（纯水）时，其结果与77 K下低密度非晶冰的公认密度值也高度吻合9。
生成所需的N2-Ar混合气体所需时间介于30分钟至5小时之间，具体取决于最终N2-Ar密度，该密度需使特定液滴组成达到中性浮力。若使用扩散器或多根气体导管以增加氩气在低温液体中的混合表面积，可缩短该时间。调节N2-Ar密度直至确认液滴处于中性浮力状态也可能耗时较长，尤其对于半径较小（r）的液滴，因其终端速度较小（<img alt="静力平衡 ΣFx=0 示意图；包含作用力与平衡；教育用物理概念图示。" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq5.jpg" data-altupdatedat="17...

水及其各种相态下水溶液混合物的物理性质具有基础性研究意义，对于生物系统的体内（in vivo）和体外（in vitro）研究也至关重要。在现代低温生物学和生物样本低温保存领域，含水冷冻保护剂混合物的玻璃态或非晶态尤其受到关注1,2。冰晶的成核与生长会破坏细胞和组织，并促进蛋白质变性与聚集，因此使溶剂实现玻璃化的低温保存方案正变得日益普遍。在生物大分子晶体学中，溶剂在生物大分子之间通道中的结晶会破坏晶体晶格并降低衍射性能。通过快速冷却、脱水以及添加甘油、乙二醇、聚乙二醇（PEGs）、醇类和盐类等冷冻保护性溶质，可实现玻璃化。
玻璃化可限制冰晶的形成与生长，但并不能完全消除与冷却相关的样品损伤。例如，当蛋白质晶体被冷却至玻璃化状态时，其晶格镶嵌度（反映晶面取向分布的指标）通常会增加10至100倍3，且玻璃化后的精子细胞和卵母细胞在复温后的存活率差异较大。
一种损伤机制是在冷却过程中溶剂与周围材料的差异性收缩3,4,5。晶体、细胞或组织内的溶剂和溶质的平衡浓度具有温度依赖性，且溶剂、溶质以及周围材料的收缩程度可能不同。快速冷却可能在玻璃化之前阻止溶剂和溶质的重新分布，差异性收缩可能导致大范围、非均匀且非平衡的应力，从而引起样品损伤。
因此，了解液态和玻璃化水溶液混合物的温度依赖性密度，有助于合理地减少冷却过程中造成的损伤。当溶质浓度高于50%（溶质重量与溶液重量之比，w/w）时，大多数水溶液冷冻保护剂混合物可在10 K/s或更低的适度冷却速率下实现玻璃化，从而可制备较大的玻璃态样品并进行密度测量6。随后可通过阿基米德原理测定密度，即测量样品悬浮于液氮等液体冷媒中时的表观重量。然而，随着溶质浓度降低，实现玻璃化所需的冷却速率迅速增加：例如，甘油水溶液混合物的冷却速率从50%（溶质重量与溶液体积之比，w/v）时的&#60;10 K/s 增加至25% w/v时的&#62;1,000 K/s7。此时传热受限于边界层，因此要实现更高的冷却速率，必须使用越来越小的样品8。
通过在低温冷却的表面上，于真空环境中沉积微米级直径（飞升级体积）的液滴，使其累积形成宏观尺度（克级质量）的样品，已实现对纯玻璃态水和玻璃态冰密度的测量。该样品的密度通过在液氮-氩混合液中的低温浮力法测定，调节低温液体的密度直至样品达到中性浮力状态9。然而，将大量微小液滴聚合成大样品的同时最大限度减少孔隙体积——这是以往玻璃态相密度测量中重要的误差来源——具有相当的技术难度。对于水溶液混合物而言，在真空条件下进行气溶胶化和沉积过程中，溶液组分的差异性蒸发可能导致沉积浓度存在显著不确定性。
我们开发了一种基于冷冻浮力法的方法，能够利用低至50 pL的单个液滴精确测定水溶液混合物的密度10。这些液滴可在保持原始浓度的同时快速冷却，并通过简单的视觉检测评估其低温状态（玻璃态或结晶态），该检测结果与X射线衍射测量结果相一致。该方法广泛适用于水性和非水性混合物，并可拓展应用于多种生物样品，包括细胞（例如，干细胞和卵细胞）、组织样品以及低温密度在0.8至1.4 g/mL之间的蛋白质晶体。

<table><tbody><tr><td>离心管</td><td>Falcon</td><td>6029236</td><td>15 mL 圆锥形离心管</td></tr><tr><td>甘油， &gt;99.5%</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G9012-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇 &gt;99.8%</td><td>Sigma</td><td>324558-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler</td><td>AE240</td><td>分析天平，0.01 mg 精度，底部带挂钩，用于天平下方称重&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>科学工业公司</td><td>SI-0236</td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>仪器外壳框架</td><td>Unistrut&amp;nbsp;</td><td>1-5/8&quot; 金属框架</td><td>48&quot; 宽 x 24&quot; 深 x 40&quot; 高&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>装置外壳空气屏障</td><td></td><td></td><td>任何透明塑料薄膜</td></tr><tr><td>氯丁橡胶圆盘</td><td></td><td></td><td>4&quot; 直径，1/8&quot; 厚</td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>Scilogix Dilvac</td><td>SS333</td><td>4.5升杜瓦瓶，带钢制外壳和卡箍盖</td></tr><tr><td>铜室</td><td></td><td></td><td>该制备部件由一个1.43&quot; 直径，0.017&quot; 壁厚铜管，一端焊接实心圆柱形铜底以密封。&amp;nbsp; 铜基为0.87&quot; 高，整个腔室高度为7&quot;.</td></tr><tr><td>氮气</td><td>Airgas</td><td>NI HP300</td><td>99.998% 纯度的 N2 气体</td></tr><tr><td>氩气</td><td>Airgas</td><td>AR HP300</td><td>99.998% 纯 Ar 气体</td></tr><tr><td>转子流量计</td><td>Omega</td><td>FL3692ST</td><td>最大流速 2.52 L/min</td></tr><tr><td>泡沫隔热盖</td><td></td><td></td><td>该部件由 4 lb/ft 的材料制成&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 交联聚乙烯泡沫（由 Technifab 公司提供，地址：俄亥俄州阿冯 Chester Industrial Parkway 1355 号），外径为 2.42&quot;，以及1.52的ID&quot;，厚度为0.79&quot;.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PTFE 测试质量块</td><td></td><td></td><td>该制备部件为0.246&quot; 直径，0.580&quot; 高圆柱体，直径为0.060&quot; 直径为0.10的孔，垂直于圆柱轴线并与之相交&quot; 从一端。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量天平平台</td><td>Unistrut</td><td>1-5/8&quot; 金属框架</td><td>11&quot; 宽 x 24&quot; 长 × 24&quot; 带有顶部铝板的高矩形框架，铝板上设有用于单丝和悬挂测试质量的孔</td></tr><tr><td>50微米单丝线</td><td>伯克利</td><td>NF1502-CM</td><td>纳米纤维鱼线</td></tr><tr><td>氩气预冷却盘管管路</td><td>VWR</td><td>60985-512</td><td>1/8&quot; ID x 1/4&quot; OD PVC 管</td></tr><tr><td>穿孔铜箔混合器</td><td></td><td></td><td>1.4&quot; 直径，&amp;nbsp; 35微米厚的铜片，由1盎司/平方英尺的铜箔切割而成&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 铜片用尖锥或其他尖锐工具打孔。&amp;nbsp; 将直径为1-2 mm的刚性隔热材料棒（塑料或木制）插入中心位置，并根据需要使用环氧树脂固定。</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL 鲁尔锁头注射器</td></tr><tr><td>真空发生器</td><td>胃</td><td>VG-015-00-00</td><td>压缩空气文丘里单级真空发生器</td></tr><tr><td>疏水涂层喷雾</td><td>RainX</td><td>620036</td><td>塑料防水</td></tr><tr><td>长焦距立体显微镜</td><td>博士伦 Stereozoom 6</td><td></td><td>0.67-4倍变焦镜筒，配20倍目镜，工作距离10 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED环形照明器</td><td>Amscope</td><td>LED144S</td><td></td></tr><tr><td>LED点光源照明器</td><td>纽豪斯照明</td><td>NHCLP-LED</td><td>3W LED 鹅颈夹灯</td></tr><tr><td>1.8 ml 冻存管</td><td>Nunc</td><td>V7634-500EA</td><td>任何1.8或2 mL冻存管均可使用</td></tr></tbody></table>

测量水合玻璃在低温下的密度

Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

我们展示了一种用于测定水溶液混合物及其他需要快速冷却样品的玻璃态低温密度的方法，以制备目标低温相态。通过将微升至皮升级别的液滴喷射至液氮-氩（N₂–Ar）低温混合物中实现快速冷却，随后在保持低温的条件下利用显微成像结合精确的体积与质量测量技术测定其密度。该方法适用于研究在快速冷却过程中形成非晶态固相的液体体系，可广泛应用于低温生物学、冷冻保存及材料科学领域。

关键词：玻璃态，低温密度，快速冷却，液滴，液氮-氩混合物，显微成像，非晶态相，冷冻制备2-Ar) 混合物。通过一种与X射线衍射测量结果相关的视觉检测方法，评估液滴的低温相态。液态N₂的密度2-通过添加 N₂ 调节 Ar 混合气2 或直至液滴达到中性浮力。利用测试质量块和阿基米德原理测定该混合物及液滴的密度。若在液滴制备过程中采取适当措施，妥善管理液态低温混合物上方的气体以尽量减少结冰，并定期搅拌低温混合物以防止密度分层和相分离，则可实现高精度的密度测量，准确度可达 &#60;可轻松测定小至50 pL的液滴，其检出率可达0.5%。对水性冷冻保护剂混合物的测量有助于理解冷冻保护剂的作用机制，并提供定量数据，以促进生物样本低温保存过程中的热收缩匹配。

密度测量在 T = 77 K 下玻璃化冷冻的甘油和乙二醇水溶液液滴随冷冻保护剂浓度变化的情况如图所示 图1A 和 图1B 分别为，以及比容相应的变化 T = 298 K 和 77 K，根据先前确定的数据计算得出 T = 298 K 密度，如图所示 图2在高浓度冷冻保护剂溶液中，冷却至玻璃化状态时溶液会收缩，而纯水则会膨胀。预测两种冷冻保护剂在浓度约为20–25% w/w时，体积变化接近零，无明显膨胀或收缩。体积变化的斜率 与 浓度在40% w/w以下时影响最为显著，此时额外添加的冷冻保护剂对水的四面体低温结构的作用最为明显。
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本文描述了一种用于测定微升至皮升级水溶液混合物在低温条件下玻璃化相密度的实验方案。

我们展示了一种用于测定水溶液混合物及其他需要快速冷冻的样品的玻璃相低温密度的方法。

本实验的总体目标是测定水溶液在低温条件下的玻璃态或非晶态密度。该方法有助于回答低温生物学和低温晶体学领域中的关键问题，例如，当含水的低温保护混合物被冷却至低温并形成玻璃态时，其体积会收缩或膨胀多少。该技术的主要优势在于，仅需少量样品并快速冷却，即可同时测定样品在低温条件下的密度及其物相状态。尽管该方法最初是为冷冻保护溶液而开发的，但它也可用于测定组织、细胞聚集体及其他生物样品在低温下的密度。当我从 Thomas Lutin 那里了解到如何制备密度可调、范围在 0.9 至 1.3 克/毫升之间的低温液体时，我首次萌生了这一方法的想法。开始此操作前，先将一块氯丁橡胶垫置于 4.5 升玻璃杜瓦瓶底部，以保护杜瓦瓶免受损坏。小心地将一个高导热性铜室插入烧瓶中，使其落在橡胶圆盘上。调节从铜室向外伸出的支撑杆，使其与杜瓦瓶壁接触，确保铜室居中且无倾斜倾向。将一根通有干燥氮气（流速约为每分钟两升）的气体管出口插入铜室底部，以置换铜室内的潮湿空气。现在，缓慢将液氮倒入杜瓦瓶中，注意杜瓦瓶位于铜室外部，需留出时间让氮气挥发。将干燥氮气管从铜室上取下，并插入泡沫隔热盖上的匹配孔中，然后用该盖子盖住杜瓦瓶的外侧部分。使用弹性绑带将盖子固定到位。缓慢将液氮倒入铜室中，使沸腾停止后的最终液面距离铜室顶部约五厘米。随后，在盖子的中央开口处覆盖一层薄的光学透明塑料片。将氮气流速降低至约0.2升每分钟，使低温液体上方的气体空间内保持轻微的氮气过压。将一个1克、0.4毫升的聚四氟乙烯测试质量块置于已校准的分析微量天平的秤盘上，测定其在空气中、298开尔文条件下的表观质量。随后，使用一根直径50微米的单丝线，一端连接微量天平底部的挂钩，另一端穿过测试质量块上的小孔，将其悬挂在天平下方。然后，测定试样在空气中的表观质量，并与质量测量值进行比较，必要时对悬挂线的质量进行校正。为测定试样在77开尔文时的体积，将试样浸入装有液氮的铜腔内，直至完全浸没。待沸腾停止后，测量其表观质量。以约每分钟两升的流速将氩气通入盘绕管并流向其出口。将盘绕管放置在稳定铜室位置的上部撑杆上，位置位于液氮液面之上、杜瓦瓶顶部表面之下。待盘绕管冷却五分钟后，将出口及盘绕管置于铜室内液氮表面以下至少10厘米处。然后，用环形盖和透明片盖住杜瓦瓶。接着，调节氩气流速，直至气泡从液氮中的管口上升至液氮表面。随后，降低流速，使气泡在管口处形成，但在即将突破液氮表面之前即溶解或液化。定期通过将附着在细绝缘棒上的薄圆形铜箔插入铜腔内，并像活塞一样缓慢上下移动，以搅动液体。测量测试质量块在空气中的表观质量后，取下绝缘杜瓦盖，将质量块降至铜腔外的液氮中，使其冷却至77开尔文。随后将冷却后的测试质量块提升至液氮上方的低温氮气层中，静置直至质量块表面残留的液氮完全蒸发。然后，将冷却并干燥的测试物缓缓浸入液氮-氩混合液中，直至其完全浸没且距离液面约2

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一种用于在已知温度下对样品进行热平衡以实现精确低温发光测量的简易杜瓦/恒温器

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溶液法加工、表面工程化多晶CdSe-SnSe，表现出低热导率

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超低温角分辨光电子能谱学

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