Name: 성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 성인 쥐에서 AAV9를 이용한 척수 피하 유전자 전달 기법으로 척수 퇴행성 질환 연구에 활용하세요. 이 방법은 효과적인 유전자 발현을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 연구는 SANPORC 및 ALSA 재단 보조금 (Martin Marsala)에 의해 지원되었습니다. 국가 지속 가능성 프로그램, 프로젝트 번호 LO1609 (체코 교육 청소년 스포츠부); 및 RVO : 67985904 (Stefan Juhas 및 Jana Juhasova).

이 연구는 샌디에고 캘리포니아 대학의 동물 동물 보호 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물 실험을위한 실험실 동물 관리 지침 평가 협회를 준수했습니다. 모든 연구는 집단 크기와 동물의 고통을 최소화하는 방식으로 수행되었다. 1. 일반 동물 및 외과 준비 <ol><li> 수술 절차를 시작하기 전에 바이러스 (AAV9 - UBI - GFP, 5 μL aliquots) 8 해동. 덱스 트란 분말을 증류수에 혼합하여 5 % 덱스 트란 (10,000 MW) 용액을 준비한다. 바이러스 용액을 5 % 덱스 트란 용액 1 : 1과 혼합하여 최종 덱스 트란 농도 2.5 %로 만든다. <ol><li> 바이러스 용액을 얼음에 보관하십시오 (4 ° C). </li></ol></li><li> 성인 C57BL / 6J 마우스 (남녀, 20-30 g)를 사용하십시오. 5 % isoflurane (O 2 , 1 L / 분)을 사용하여 마우스를 마취하고 2 에서 그들을 유지호흡 률과 발의 협착 정도에 따라 3 % 흡입 한 isoflurane (O 2 , 1 L / min). </li><li> 면도 면도기로 동물의 등을 면도하고 2 % chlorhexidine으로 피부를 닦으십시오. </li><li> 만성 회복 연구에서 엄격한 무균 기술을 따릅니다. </li><li> 요추 subpial 주사가 수행되어야하는 경우, 메스로 Th8 - L1 척추를 덮고 Tha - 12 척추에서 paravertebral 근육을 분리 피부를 잘라 가위를 사용합니다. <ol><li> 마우스 척추 클램프를 사용하여 표준 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재하십시오. </li><li> 균열이 나타날 때까지 치과 용 드릴 (드릴 비트 : 0.9mm, 속도 : 20,000rpm)을 사용하여 Th10-12 척추의 얇은 판의 양 측면을 면도하십시오. </li><li> 포셉로 금이 간 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 척수 표면을 노출. </li><li> 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 1cm의 경질 뚜껑을 자르십시오. </li></ol></li><li><strong&gt; 자궁 경부 피하 주사를 시행하려면 가위를 사용하여 등쪽 목 피부 1.5-2 cm을 절개하고 C1-C2 절편을 노출 시키십시오. <ol><li> 23G 스테인레스 스틸 바늘과 집게를 사용하여 cisterna magna의 atlanto-occipital 막을 제거합니다. </li><li> 면봉으로 조직 및 뼈 파편의 절개 부위를 닦으십시오. </li><li> 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 2 ~ 3mm의 경질 뚜껑을 자르십시오. </li></ol></li></ol> 2. Pial Membrane을 열고 AAV9 Delivery를위한 Subpial Needle 삽입 <ol><li> 유리 모세관 홀더 ( 그림 1A 및 B )를 사용하여 XYZ 조작기의 Z-arm에 34G 피아 관통 바늘을 장착합니다. 참고 : 피어 침투 바늘을 제조하려면 34G 바늘의 원래 경 사진 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 크기 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기) 및 연삭 각도)로 날카롭게합니다.15 - 20 °. 바늘 끝 (길이 1mm, 끝에서부터 측정)은 약 90 °로 부드럽게 구부립니다 ( 그림 1B , 왼쪽 삽입). </li><li> 8-10 X 배율로 설정된 외과 해부 범위를 사용하여 피아 관통 바늘로 X 암을 사용하여 약 1 mm ( 그림 1C )로 피어를 관통시킵니다. <ol><li> 5 ~ 10 °의 조직 표면에 침투하는 바늘의 각도를 유지하십시오. </li></ol></li><li> pia가 열린 후, X-arm을 사용하여 관 공 공간 ( 그림 1 D)에서 피아 관통 바늘을 수평으로 제거합니다. 참고 : 관통 된 부위는 혈관과 같은 랜드 마크로 기억하십시오. </li><li> PE - 10 또는 PE - 20 튜빙과 주사 바늘에 연결된 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP 바이러스와 무딘 36G 주사 바늘을로드합니다. </li><li> 두 번째 XYZ 조작기의 Z- 아암에 바늘을 장착하십시오 ( 그림 1A </strong&gt; 및 B )를 유리 모세관 홀더 ( 그림 1B , 오른쪽 삽입물)를 사용하여 제거합니다. 참고 : subpial AAV9 주사 바늘을 제조하려면 36G 바늘의 둔각 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기))로 닦아서 날카로운 모서리를 제거합니다. 바늘 끝 (2-3 mm 길이, 끝에서부터 측정)을 약 90 °로 부드럽게 구부립니다. pia-penetrating 및 subpial 주입 바늘은 1-2cm 길이의 20G 슬레이브 스테인레스 스틸 튜브 (바늘 끝에서 10mm)에 삽입하고 에폭시로 붙입니다. 유리 모세관 홀더에 안전하게 부착하려면 20G (직경 0.91mm) 튜빙을 사용해야합니다. </li><li> 두 번째 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 조작하여 AAV9 주사 바늘의 팁을 피아 삽입 부위에 위치시킨 다음 이전의 pial 멤브레인 구멍을 통해 약 2 ~ 3mm 정도를 엑스 팔( 도 1E 및 F ). 참고 : 1) AAV9-UBI-GFP는 이전에보고 된 프로토콜 9 , 10 에 따라 준비되고 최종 역가는 1.2 x 10 13 게놈 복사 / mL (gc / mL)로 조정됩니다. 2) 쉽게 확인할 수 있기 때문에 병 입구의 위치를 ​​표시 할 필요가 없습니다 ( 그림 1D ). </li><li> 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP (1.5, 3 또는 5 μL)를 subpial 공간에 주입하십시오 (실험 그룹에 대해서는 표 1 참조). </li><li> AAV9 - UBI - GFP 주입이 완료되면 subpial 공간에서 주사 바늘을 제거합니다. </li><li> 4.0 모노 필라멘트 봉합사와 외과 용 클립을 사용하여 근육과 피부를 닫습니다. 참고 : 열린 척추를 봉할 필요가 없습니다. </li><li> 동물이 가열 패드에서 회복되도록하십시오. </li><li> 통증 조절을 위해 Buprenorphine 0.05 mg / kg / sc을 12 시간마다 주사하십시오.수술 후 2 ~ 3 일. </li></ol> 3. 관류 고정, 조직 Cryoprotection 및 Immunofluorescence 얼룩 <ol><li> subpial AAV9 주사 후 미리 정해진 시점에서, 안락사 솔루션 ( 재료 의 표 참조, 0.3 ML)과 transecially 20 ML heparinized 생리 식염수와 PBS에서 4 % paraformaldehyde 20 ML 다음으로 그들을 쥐를 깊이 마취. </li><li> 뼈 rongeur를 사용하여 척수와 두뇌를 해부하고 4 ° C에서 밤새 PBS에 4 % 포름 알데히드에서 사후 수정. </li><li> 최소 5-7 일 동안 PBS에 30 % 자당으로 척수와 뇌를 동결 보관하십시오. </li><li> 저온 유지 장치 (cryostat)에서 코로 날, 횡단 또는 세로 / 가로 동결 절편 (30 μm 두께)을 잘라내어 PBS 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol> 4. 척수 및 뇌 절편의 면역 형광 염색 (표 참조) <ol><li> 자유롭게 떠 다니는 섹션을 primar로 배양하십시오.y 항체를 하룻밤. </li><li> 일차 항체와 부화 후, PBS에서 세 번 섹션을 씻어 형광 결합 당나귀 안티 토끼, 당나귀 안티 치킨, 그리고 당나귀 안티 염소 보조 항체와 함께 품어. </li><li> 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트, 상온에서 건조하고, 안티 페이드 매체로 그들을 커버. </li><li> epifluorescence 형광 현미경 (목표 : 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 및 63X, NA-1.4)를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+SMA%3A+a+dose-response+study+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+fidelity+of+intrathecal+delivery+of+self-complementary+AAV9-survival+motor+neuron+1+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy.</a> Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).</li>
<li>Bell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+transduction+after+intracisternal+delivery+of+AAV9+in+a+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).</li>
<li>Miyanohara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+spinal+parenchymal+AAV9-mediated+gene+delivery+by+subpial+injection+in+adult+rats+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+knockdown+in+rat+dorsal+root+ganglia+mediated+by+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+5+following+intrathecal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 32581(2012).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
</ol>

Martin Marsala는 Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA)의 공동 설립자입니다.

이번 연구는 성체 마우스에서 subpial vector (AAV9) 전달 기술에 대해 설명합니다. 첨부 된 비디오에서 설명한 바와 같이,이 접근법과 기술은 필요한 장비와 피어 - 침투 바늘 및 서브 피알 주사 바늘이 적절하게 제조되고 제조되고 테스트 된 사양에 따라 제공되는 경우 효과적으로 사용할 수 있습니다. 생쥐에서 일관되고 안전하게 자궁 내 주사를 시행 할 때의 중요한 기술적 변수 : 실증 된 바와 같이, 자궁 경부 또는 요추 laminoplomy 후 성인 마취 마우스에서 subpial 주사는 쉽게 수행 할 수 있습니다. 서브 파이어 인젝션 기술의 성공을 정의하는 몇 가지 중요한 기술 변수가 있습니다. 첫째, 34 G 피아 관통 바늘의 끝은 피아의 부드러운 천공을 보장하기 위해 베벨 러를 사용하여 지속적으로 날카롭게해야합니다. 바늘을 날카롭게하는 방법에 대한 기술의 불일치로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.피아 침투 동안 및 /...

다양한 척수 및 CNS 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 AAV 벡터의 사용은 관심 유전자의 발현을 효과적으로 상향 조절하거나 침묵시키는 잘 받아 들여지는 플랫폼이되고있다. CNS / 척수 장애를 치료하기위한이 기술의보다 효과적인 활용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 성인 포유류의 심부 뇌 또는 척수 실질에 AAV 벡터를 전달하는 능력이 제한적이라는 것입니다. 그것은 성인 쥐, 고양이, 또는 인간이 아닌 영장류에서 AAV9의 전신 배달 뇌와 척수 1, 2, 3의 신경 세포에서 유전자의 발현을 유도에서만 적당히 효과가 있음을 예를 들어 설명되었다. 해부학 적으로 정의 된 뉴런 풀에서 제한된 도입 유전자 발현만을 유도하는 것으로 AAV9 벡터의보다 효과적인 척수강 내 전달이 또한 나타났다. 더 구체적으로, 그것은 악마들이었습니다.비인간 영장류, 돼지 또는 설치류에서 cisternal 또는 lumbo-sacral intrathecal AAV9 전달이 척수 α 운동 신경 세포 및 분절 지느러미 뿌리 신경절 뉴런에서 높은 수준의 전이 유전자 발현을 유도한다. 그러나 척추 신경 계통 또는 백질의 오름차순 또는 내림차순 축삭에서는 최소한 또는 전혀 발현이 4 , 5 , 6 , 7로 나타난다. 종합적으로, 이러한 데이터는 매우 효과적인 생물학적 - 해부학 적 장벽이 존재한다는 것을 보여 주며, 척수 내에서 전달 된 AAV가 더 깊은 척추 실질로 확산되는 것을 방지합니다. 성인 쥐와 돼지를 사용하여 이전 연구에서 새로운 subpial 벡터 전달 기술은 8 개발되었다. 이 접근법을 사용하여 single-bolus subpial AAV9 전달 후 매우 강력하고 다 분절 형질 전환 유전자 발현이 입증되었습니다. 강렬한 GFP 발현이 지속적으로 나타남교감 신경절 세포, 신경 교세포, 하강 / 상행 축삭에서 주입 된 척추 분절을 통해 관찰되었다. 이 연구는 피 아게트가 척수 실질 내로의 효과적인 AAV9 확산을 막을 수있는 주요 장벽임을 나타냈다. 이 이전에 개발 된 기술과 subpial 주입 장치는 대형 설치류 (쥐와 같은) 또는 성인 돼지에서 비교적 사용하기 쉽지만,이 시스템은 성인 마우스와 같은 작은 동물에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 다양한 신경 퇴행성 장애의 이용 가능한 트랜스 제닉 마우스 모델이 매우 많기 때문에, 마우스에서 효과적인 척추 - 실질 세포 전달 기술의 개발이 분명한 필요성이있다. 이러한 기술의 이용 가능성은 세포 비 특이성 ( 예, 사이토 메갈로 바이러스 -MVV 또는 유비퀴틴) 또는 세포 특이 적 ( 예, 시냅스 또는 글라 이알)을 사용하는 특정 유전자 사일런 싱 ( 예 : shRNA 사용) 또는 상향 조절의 효과를 연구 할 수있다 섬유 성 산성단백질 (GFAP)) 프로모터를 포함한다. 따라서, 현재 연구에서, 우리는 성인 생쥐에서 효과적으로 사용할 수있는 소형 subpial 벡터 전달 시스템을 개발하고 검증했다. 유사하게, 이전의 쥐 및 돼지 연구에서와 마찬가지로,이 연구는 쥐에서 단일 - 볼 러스 서브 피알 AAV9 전달 후 척수 실질 전반에 걸쳐 강력한 전이 유전자 발현을 입증한다. 이 접근법의 단순성, subpial AAV9 전달에 주입 된 마우스의 아주 좋은 내성 및 척수 실질에서의 형질 전환 유전자 발현의 높은 효능은이 기술이 실험실 환경에서 효과적으로 수행되고 척추 유전자 발현을 목표로하는 실험에 사용됨을 시사한다.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J 마우스</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Lab 표준 입체 마우스</td><td>하버드 장치</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>마우스 척추 어댑터</td><td>하버드 장치</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 매니퓰레이터</td><td>스톨 팅</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>수동 주입 펌프</td><td>스톨 팅</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>34G 경 사진 나노 필 바늘</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G 무딘 나노필 바늘</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso, Isoflurane</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 솔루션</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>20G 스테인레스 스틸 바늘</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>23G 스테인레스 스틸 바늘</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>30G 스테인레스 스틸 바늘</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 Beveller&nbsp;</td><td>Narishige International</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 현미경 Superfrost</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; L 마이크로주사기&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-20 튜빙</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-10 튜빙</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0 모노필라멘트 봉합사</td><td>VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 Beveller&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>Pipet 마이크로 그라인더 EG-40&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5분 에폭시(에폭시 클리어)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>안락사 용액</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>헤파린주 1,000 U/mL</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>수당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>안티 NeuN 항체</td><td>EMD-Millipore</td><td>ABN78</td><td>일차 토끼 다클론 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>항콜린 아세틸전이효소 (CHAT) 항체</td><td>EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>일차 염소 다클론 항체, 1:100</td></tr><tr><td>항 GFP 항체</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>일차 닭 다클론 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>2차 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>&nbsp; 당나귀 항토끼 IgG 2차 항체, Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td><td>2차 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 항닭 IgY 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td><td>2차 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 항염소 IgG H& L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150131</td><td>2차 항체, 1:1000</td></tr><tr><td>슬라이드 현미경 Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>형광 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD 바이러스 벡터 코어 연구소</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성인 쥐의 subpial adeno-associated virus 9 (aav9) 벡터 전달

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

성인 래트 및 돼지에서 아포 - 관련 바이러스 9 (AAV9) 벡터 전달 기술의 성공적 개발이 이전에보고되었다. AAV9 전달을 위해 subpially-placed 폴리에틸렌 카테터 (PE-10 또는 PE-5)를 사용하여, subpially-injection 척추 분절에서 척수 실질 (흰색 및 회색 물질)를 통한 강력한 형질 도입 유전자 발현이 입증되었습니다. 신경 퇴행성 질환의 광범위한 형질 전환 마우스 모델 때문에 성인 마우스에서 강력한 중추 신경계 (CNS) 표적화 된 벡터 전달 기술의 개발에 대한 강한 열망이 있습니다. 따라서, 본 연구는 성인 C57BL / 6J 마우스에서 안전하고 효과적인 척추 AAV9 전달을 허용하는 척추의 서브 벡터 전달 장치 및 기술의 개발을 기술한다. 척추 고정 및 마취 마우스에서, 피임 장치 (자궁 경부 1 및 척추 1-2 척수 분절 수준)를 XYZ 조작기를 사용하여 날카로운 34G 바늘로 절개 하였다. 두 번째 XYZ manipulator는 그 다음에 둔감한 36G 바늘을 요추 및 / 또는 자궁 경부 지방 공간으로 전진시키는 데 사용되었습니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 AAV9 벡터 (3-5 μL, 1.2 X 10 13 게놈 복사 (gc)) subpially 다음 주입되었다. 주사 후, 신경 학적 기능 (운동 및 감각)을 주기적으로 평가하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 AAV9 전달 후 동물을 관류 고정시켰다. 수평 또는 횡단 척수 절편의 분석은 회색 및 흰 물질 모두에서 전체 척수를 통한 전이 유전자 발현을 보였다. 또한, 심한 역행위 매개 GFP 발현은 운동 피질, 핵 ruber, 및 formio reticularis에 내림차순 모터 축삭과 뉴런에서 보였다. 어떤 동물에서도 신경 학적 장애는 관찰되지 않았다. 이 데이터는 대식 성 벡터 전달 기술이 프로 시저 관련 척수 손상을 일으키지 않으면 서 성숙한 생쥐에서 성공적으로 사용될 수 있고 매우 강력한 전이 유전자 발현과 관련이 있음을 보여줍니다척추 신경근을 통한 시온.

<html> 하위 AAV9 주사 분획에서의 강력한 전이 유전자 발현 : AAV9 전달 후 14 일째 척수 절편에서 transgene (GFP) 발현을 분석 한 결과, 척수 실질 전반에 AAV9- 의존성 GFP 발현이 나타났다. 첫째, 요추 하부 공간에 주입 된 AAV9-UBI-GFP의 2 회 양측 3 μL 주사는 전체 흉추 부위의 백색 및 회색 물질의 거의 완전한 감염과 연관되어 상부 흉부 분절까지 확장되었다 ( 그림 2A 및 2B , 왼쪽 및 중간 열). 요추 하부 공간에 AAV9-UBI-GFP를 양측에 1.5 μL 주사 한 결과 요추 전체의 백색 및 회색 물질이 거의 유사하게 감염되었다 (3 μL 주입 후 나타남). 그러나, 흉부 중간 뼈는 때때로 감염된 뉴런만을 나타 냈습니다 (ass = &quot;xfig&quot;&gt; 그림 2B, 오...

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

이 거미막하 AAV9 전달 기술의 전반적인 목표는 성체 마우스의 척수 전체 길이에 걸쳐 강력한 척수 실질 전이유전자 발현을 달성하는 것입니다. 이 방법은 척수 유전자 발현 조절을 목표로 하는 연구를 용이하게 하며, 근위축성 측삭 경화증, 척수 외상성 손상 또는 만성 통증을 포함한 여러 척수 신경퇴행성 질환의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 거미막하 AAV9가 주입된 분절과 인접한 여러 척수 분절의 척수 회백질 및 백질 전체에서 매우 강력한 전이유전자 발현이 이루어진다는 점입니다.경막 개방 단계와 피하 needle의 배치가 시각적 시연 없이는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 절차 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Takahiro Tadokoro가 담당하겠습니다. 먼저 수술을 위해 동물에게 적절히 마취를 실시하며, 여기서는 isoflurane이 사용됩니다.진행하기 전에 발집기 반응(paw pinch response)이 없는지 확인한 후, 안연고로 눈을 덮어줍니다. 다음으로, 클리퍼를 사용하여 동물의 등 부위를 삭모하고 2% chlorhexidine으로 피부를 세척합니다. 요수하막 주사(lumbar subpial injections)를 수행해야 하는 경우, 메스로 T8에서 L1 척추 위의 피부를 절개한 다음 가위를 사용하여 T10에서 T12 척추에서 척추 주변 근육을 분리합니다.마우스 척수 클램프를 사용하여 동물을 표준 정위 고정 프레임에 고정합니다. 다음으로, 치과용 드릴을 사용하여 T10에서 T12 척추의 추궁 양측을 균열이 생길 때까지 갈아낸 후, 핀셋으로 균열된 뼈 조각을 제거하여 요수 척수의 등쪽 표면을 노출시킵니다. 이제 경막이 보이면, 30 gauge 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 경막에 1~2 mm 크기의 절개창을 만듭니다.하부의 연질막(pia membrane)이 손상되지 않도록 경막(dura)을 주의 깊게 절개하는 것이 중요합니다. 이제 포셉으로 절개된 경막의 가장자리를 잡고 경막 절개 부위를 최대 5mm까지 확장합니다. 경추 연질막하 주입을 수행하려는 경우, 이어바(ear bars)를 사용하여 마우스의 머리를 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 고정시킨 후, 가위를 사용하여 등쪽 목 피부를 1.5~2cm 절개하여 C1 및 C2 분절과 후두골을 노출시킵니다.그런 다음, 치과용 드릴을 사용하여 노출된 후두골의

subpial-adeno-associated-virus-9-aav9-vector-delivery-in-adult-mice

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 새끼 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달을 보여줍니다. 이 방법은 표적 세포의 유전자 발현을 연구하는 데 도움이 됩니다.

재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달: 설치류 모델에서 이식유전자 전달 및 심장 특이적 발현을 위한 기술

출처: Tadokoro, T., et al. 성인 마우스에서 연하 아데노 관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 전달. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 마우스의 척수에 유전자 전달을 위한 연막하 주입 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 경막을 노출시키고, 연막을 천공하고, 형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 연막하 공간에 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 및 회복 후 바이러스는 척수 세포의 유전자 발현을 촉진하여 표적 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처:Pourshafie, N., et al. 설치류의 신경근 질환을 치료하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 9를 사용한 MicroRNA의 전신 전달. J. Vis. Exp. (2018).이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.

척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

배우세요 성인 쥐에서 AAV9를 이용한 척수 피하 유전자 전달 기법으로 척수 퇴행성 질환 연구에 활용하세요. 이 방법은 효과적인 유전자 발현을 가능하게 합니다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

더 많은 동영상 탐색