Name: Evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica Neonatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a evaluar funciones neuroconductuales en un modelo murino de lesión hipóxico-isquémica neonatal mediante oclusión de la arteria carótida unilateral. Este método permite estudiar alteraciones motoras y cognitivas en ratones CD-1.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones del National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), el Ministerio de ciencia y tecnología, República de Corea, Coreano salud tecnología R & D proyecto (HI16C1012), Ministerio de salud y Bienestar, República de Corea y el programa de asistencia de investigación de "Dongwha" Facultad de Facultad de medicina (6-2016-0126) de la Universidad de Yonsei.

Todos los animales fueron alojados en una jaula estándar (27 x 22,5 x 14 cm3) en un centro acreditado por la Asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care (AAALAC) y dado comida y agua ad libitum en alterna 12 h luz/oscuridad ciclos. Los autores siguieron las normas de protección de los animales y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Yonsei University College of Medicine (IACUC Nº 2010-0252; 2013-0220).
1. ratón modelo HI Neonatal de lesión de cerebro
<ol><li>Anestesiar los cachorros con isoflurano.<ol>
<li>Coloque los cachorros (menos de 5) en un cuadro de anestesia y cierre la tapa.</li>
		<li>Encienda el sistema de anestesia durante aproximadamente 15 minutos; ajustar el gas y el isoflurane utilizando una máquina de anestesia superior de la tabla. Ajustar el flujómetro del oxígeno a 1,5 L/min ajustar el vaporizador de isoflurano al 3-5% para la inducción de la anestesia.</li>
		<li>Después de 15 minutos, ajustar el vaporizador de isoflurano al 1-2% para el mantenimiento de la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque un cachorro completamente anestesiado bajo un microscopio de disección (abdomen hacia el investigador) y asegúrelo con cinta.</li>
	<li>Haga una incisión de ~0.7-mm en el cuello con unas tijeras esterilizadas.</li>
	<li>Cuidadosamente retire el tejido adiposo con unas pinzas esterilizadas y exponer la arteria carótida derecho unilateral.</li>
	<li>Ligar la arteria carótida derecho unilateral con una sutura absorbible 5-0.</li>
	<li>Sutura de la incisión en el cuello con sutura 5-0.</li>
	<li>Coloque cada cachorro en una cámara hipóxica caliente de 37 ° C durante 1 hora para la recuperación. No cierre la tapa de la cámara.</li>
	<li>1 h después de la cirugía, cuando los cachorros son totalmente despiertos, cerrar la tapa de la cámara de hipoxia y disminución de los niveles de gas para establecer condiciones hipóxicas (8% O2 y 92% N2).</li>
	<li>Después de 90 minutos de hipoxia, devuelva los cachorros a sus jaulas.</li>
	<li>Una semana después de la lesión cerebral de HI, repita el paso 1.<ol>
<li>Después de la anestesia, hacer una incisión en el cuero cabelludo con tijeras esterilizadas y pinzas para identificar la lesión de cerebro en la zona posterolateral del hemisferio derecho. Nota: Este tratamiento induce hipoxia en cachorros. La presencia y el grado de lesión cerebral en los ratones se evalúa visualmente con el ojo desnudo a través del cráneo semitransparente. Según lo determinado por el tamaño o volumen de la decoloración (es decir, la lesión de cerebro), los cachorros se clasifican en grupos. Si no hay ninguna lesión cortical visible, el ratón se clasifica en el grupo de "ninguna lesión cortical". Si hay una lesión cortical visible (es decir, una lesión en el hemisferio derecho), el ratón se clasifica en el grupo de "lesión cortical". Dado que la clasificación de los ratones en grupos se realiza una semana después de la operación, las agrupaciones pueden ser modificadas cuando la morfología de las muestras de cerebro está claramente definida en el momento de sacrificio1,2,3, 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55838/55838fig1v3.jpg"> Figura 1: Modelado de lesión de cerebro de HI neonatal en ratones. (A) una cría de ratón de siete días de edad había sometido a una cirugía, y la arteria carótida derecho unilateral fue ligada. (B) los cachorros se colocaron en una cámara hipóxica durante 90 minutos con el 8% O2 y 92% N2. (C, D y E) Los cerebros con lesiones HI neonatal demostraron varios gravedad del daño y fueron categorizados basado en el grado de daño. En la semana 14, se obtuvieron los cerebros y las lesiones fueron visualizadas. (C) imagen de un cerebro clasificado como "no cortical lesión". Ambos (D) y (E) se clasificaron en el grupo de "lesión cortical". (F, G y H) Representante de MRI (c), (D) y ratones (E), respectivamente. (F) los daños en el hipocampo se indicaron con una flecha amarilla, y las lesiones en el hemisferio derecho también se indican con flechas amarillas (G y H). Barras de escala = 1 mm <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55838/55838fig1v3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. neonatales pruebas conductuales
Nota: Aquí, el comportamiento se realizaron pruebas en 6 semanas de edad.
<ol><li>
Tarea de evitación pasiva. Nota: Para evaluar la función de memoria basada en el aprendizaje y la evitación de un estímulo aversivo, una compartimiento de dos paso por PAT debe ser llevado a cabo13,14,15,16.<ol>
<li>Coloque el ratón en el compartimiento brillante de la caja de transporte de plexiglás (41,5 × 21 × 35 cm3) de un aparato PAT.</li>
		<li>Después de 30 s, abra la puerta de guillotina y registrar el tiempo de latencia para el ratón para moverse en el compartimiento oscuro (hasta 300 s).</li>
		<li>Cierre la puerta de guillotina cuando las cuatro extremidades del ratón están completamente dentro del compartimiento oscuro.</li>
		<li>Administrar choque eléctrico pie (0,5 mA) durante 2 s y el ratón de vuelta a su jaula.</li>
		<li>Vuelva a colocar el ratón en el compartimiento brillante 24 h después del choque eléctrico de pie.</li>
		<li>Abrir la guillotina puerta 10 s después de que el ratón se coloca completamente en el compartimiento brillante y registrar el tiempo de latencia para el ratón para moverse en el compartimiento oscuro (hasta 300 s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prueba de marcha de la escalera. Nota: La tarea de caminar de peldaño de escalera permite la discriminación entre sutiles alteraciones de la función motora combinando cualitativo y cuantitativo análisis del experto a pie17,18.<ol>
<li>Encienda una cámara de vídeo.</li>
		<li>Coloque el ratón en el panel de inicio de la escalera y comenzar inmediatamente la grabación.</li>
		<li>Grabar el vídeo, centrado en las extremidades de ratón.</li>
		<li>Detener la grabación cuando el ratón toca el último panel de la escalera. Repetir el viaje de ida y cuatro veces.</li>
		<li>Analizar la grabación de vídeo y contar manualmente el número de combinaciones de cada forelimb, como sigue:<ol>
<li>Juego de grabación de vídeo en un ordenador a una velocidad lenta (0.1 x) y contar los pasos manualmente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prueba de fuerza de agarre. Nota: La prueba de fuerza de agarre se realiza con un medidor de fuerza de agarre, que incluye un calibrador de tensión de vaivén.<ol>
<li>Fijar el aparato de la fuerza de agarre sobre un panel de acrílico.</li>
		<li>Poner un ratón en el panel de acrílico y mantenga su cola.<ol>
<li>Mueva la mano que sujeta la cola para que puedan alcanzar el ratón y agarre del alambre de metal del aparato.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Permite múltiples ensayos hasta que el ratón agarra un pedazo triangular de alambre de metal (2 mm de diámetro); la fuerza máxima es automáticamente registrada en gramos por el aparato. Nota: Usar la fuerza media de tres ensayos para el análisis19,20,21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Yager, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+newborn%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn.</a> Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).</li>
<li>Vannucci, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+perinatal+hypoxic-ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage.</a> J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+striatal+neurogenesis+enhances+functional+recovery+in+an+adult+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury.</a> Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).</li>
<li>Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+Best+Animal+Models+for+Testing+Early+Intervention+in+Cerebral+Palsy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy?</a> Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).</li>
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<li>Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hypoxia-ischemia+results+in+hydrogen+peroxide+accumulation+in+neonatal+but+not+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain.</a> Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).</li>
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<li>Lu, Y., Christian, K., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF%3A+a+key+regulator+for+protein+synthesis-dependent+LTP+and+long-term+memory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory?</a> Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).</li>
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<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF-triggered+events+in+the+rat+hippocampus+are+required+for+both+short-+and+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation.</a> Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).</li>
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<li>Kim, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+enhances+synaptic+plasticity+by+internalization+of+striatal+dopamine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).</li>
<li>Lee, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+activity-regulating+genes+underlying+functional+improvement+by+long-term+exposure+to+an+enriched+environment+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain.</a> Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).</li>
<li>Rha, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+constraint-induced+movement+therapy+on+neurogenesis+and+functional+recovery+after+early+hypoxic-ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).</li>
<li>Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finger+exercise+with+keyboard+playing+in+adults+with+cerebral+palsy%3A+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exerc+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study.</a> J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).</li>
<li>Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+rehabilitation+using+MIDI+keyboard+playing+in+adolescents+with+brain+damage%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study.</a> NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+induced+by+enriched+environment+enhances+angiogenesis+and+motor+function+in+chronic+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury.</a> PLoS One. 8 (9), e74405(2013).</li>
<li>Washington, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+injury+severity+on+behavior%3A+a+phenotypic+study+of+cognitive+and+emotional+deficits+after+mild%2C+moderate%2C+and+severe+controlled+cortical+impact+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Cho, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+Activation+by+an+Enriched+Environment+after+Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Angiogenesis+after+Hypoxic-Ischemic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).</li>
<li>Tsuji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reproducible+model+of+neonatal+stroke+in+mice%3A+comparison+with+a+hypoxia-ischemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model.</a> Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses que compiten.

En este estudio, inducida por la lesión cerebral HI en un ratón P7-10 CD-1 neonatal e identifica la lesión de cerebro con déficit cognitivos y motor correspondientes. Durante este procedimiento, oclusión de la arteria carótida derecho unilateral era crítica. En este paso, la arteria podría ser dañada y rasgada. Cachorros más que experimentado un desgarro de la arteria murieron. Por el contrario, si investigadores habían ligada otra vena de la sangre en lugar de la arteria carótida derecho unilateral, el cerebro de la crí...

Lesión de cerebro de HI neonatal ocurre durante la primera infancia (aproximadamente dos pacientes por cada 1.000 niños)1,2,3,4,5. Estudios sobre lesiones de cerebro de HI neonatal son importantes, y usando un neonatal HI cerebro lesiones ratón modelo establecido puede facilitar en vivo investigación preclínica en lesión de cerebro de HI.
Los modelos HI tradicionales se utilizan en ratas adultas6. Para el modelo del recién nacido, comúnmente se utiliza el método de arroz Vannucci P7 ratas7,8. Sin embargo, puesto que ratas y ratones son ligeramente diferentes de9,10, aunque sean ambos roedores, realizamos un método modificado de arroz Vannucci en CD-1 cachorros en P7-10, basado en estudios anteriores que mostraron que P7-10 es el período con oligodendrocitos inmaduros, correspondiente a humanos término P011,12. El modelo de ratón de HI neonatal se establece a través de tanto la ligadura de la arteria carotídea unilateral y la exposición de los ratones a la hipoxia con oxígeno de 8% en P7-10 cachorros.
Los ratones sometidos al procedimiento mostraron diversos grados de lesiones cerebrales en la zona posterolateral del hemisferio derecho. Para identificar el déficit cognoscitivos y motor, evaluaciones neuroconductuales basadas en el PAT, se realizaron a prueba y prueba de fuerza de agarre de la escalera. Se analizaron las diferencias entre los no operados (es decir, normal) y ratones de HI. Este trabajo presenta información básica sobre el modelo de ratón de HI. Las imágenes de MRI demuestran los fenotipos diferentes, separados según la severidad de daños de cerebro usando las pruebas de motores y cognitivas.

<table><tbody><tr><td>Cámara hipóxica</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>PAT aparato</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>La escalera peldaño caminando</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Constructor Experimental</td><td></td></tr><tr><td>SDI Sistema de Fuerza de Agarre San</td><td>Diego Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de fuerza de agarre</td><td>Ugo Basile</td><td>47200</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Sistema de anestesia Fluovac&nbsp;</td><td>Aparato de Harvard Caja</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de anestesia</td><td>caja acrílica</td></tr><tr><td>I-Fran Líquido (isofluorano)</td><td>Hana Pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td>Anestésicos generales ( isoflurano 100ml)</td></tr><tr><td>CD-1 ratones</td><td>Orient Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura mono no absorbible de nailon azul 5-0 50cm</td><td>Ailee Co., Ltd.</td><td>NB 521</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Estadísticas</td><td>IBM</td><td>Ver. 23</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica neonatal

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

Se realizó oclusión unilateral de la arteria carótida en ratones CD-1 para crear un modelo de (HI) hipóxico-isquémica neonatal y se investigaron los efectos de lesión de cerebro de HI neonatal mediante el estudio de las funciones neuroconductuales en estos ratones frente a no funcionar (es decir, ratones normales). Durante el estudio, se utilizó método de arroz-Vannucci para inducir daño de cerebro de HI neonatal en ratones de 7-10 (P7-10) día postnatal. La operación de HI fue realizada en los cachorros por la ligadura unilateral de la arteria carótida y la exposición a la hipoxia (8% O2 y 92% N2 de 90 min). Una semana después de la operación, los cerebros dañados fueron evaluados con el ojo desnudo a través del cráneo semitransparente y se clasificaron en subgrupos basados en la ausencia (grupo "ninguna lesión cortical") o presencia (grupo de "lesión cortical") de la lesión cortical, como una lesión en el hemisferio derecho. En la semana 6, se realizaron las siguientes pruebas neuroconductuales para evaluar las funciones cognitivas y motoras: escalera (PAT), tarea de evitación pasiva a prueba y prueba de fuerza de agarre. Estas pruebas conductuales son útiles en la determinación de los efectos de lesión de cerebro de HI neonatal y se utilizan en otros modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas. En este estudio, neonatal HI cerebro lesiones los ratones mostraron déficit motor que corresponde a daño del hemisferio derecho. Resultados de la prueba de comportamiento son relevantes a los déficits observados en pacientes humanos de HI neonatales, tales como parálisis cerebral o pacientes con accidente cerebrovascular neonatal. En este estudio, un modelo de ratón de lesión de cerebro de HI neonatal fue había establecido y mostró diferentes grados de déficit motor y deterioro cognitivo en comparación con ratones no operados. Este trabajo proporciona información básica sobre el modelo de ratón de HI. Imágenes de MRI demuestran los fenotipos diferentes, separados según la severidad del daño cerebral por pruebas de motor y cognitivas.

Todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). La comparación de variables entre los dos grupos se realizó con un independiente o pareadas t-Pruebe el software de estadística SPSS. Un p-valor < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
El cerebro con lesión HI neonatal demostró diferente severidad del daño y se categorizaron en consecuencia (figura 1</str...

Se realizó oclusión unilateral de la arteria carótida en día postnatal 7-10 CD-1 ratón cachorros para crear un modelo de (HI) hipóxico-isquémica neonatal e investigó los efectos de la lesión cerebral HI. Estudiamos las funciones neuroconductuales en estos ratones, en comparación con ratones normales no funcionan.

Evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

El objetivo general de la cirugía de lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal, seguida de pruebas cognitivas y motoras, es contar con un modelo murino para estudiar dichas lesiones y el daño cerebral relacionado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal, como la forma en que estas lesiones afectan las funciones motoras y cognitivas. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente conocida y comúnmente utilizada.Es también un modelo preclínico para la parálisis cerebral y los accidentes cerebrovasculares neonatales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la arteria carótida derecha unilateral es difícil de identificar. Realizando el procedimiento, junto conmigo, estará Yoon-Kyum Shin, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.Después de anestesiar al menos cinco crías de ratón P-siete, coloque una cría bajo un microscopio de disección con el abdomen hacia arriba. A continuación, limpie el cuello con alcohol. Para comenzar la cirugía, use tijeras para hacer una incisión de 0,7 milímetros en el cuello.A continuación, retire cuidadosamente el tejido adiposo con pinzas hasta exponer la arteria carótida derecha unilateral. Luego, utilizando un hilo de sutura 5-0, ligue la arteria carótida derecha unilateral. Ahora, suture la incisión en el cuello con nylon 5-0 y esterilice la incisión.Luego, permita que la cría se recupere en una cámara hipóxica de 37 grados Celsius con la tapa abierta durante aproximadamente una hora. Coloque otro ratón sometido a manipulación quirúrgica en la cámara hipóxica para que se recupere. Una vez que todas las crías estén completamente despiertas, cierre la tapa de la cámara y reduzca los niveles de gas para establecer condiciones hipóxicas.Después de 90 minutos de hipoxia, devuelva las crías con lesión cerebral a sus jaulas. Una semana después, prepare las crías para la cirugía, como antes, para buscar evidencia de la lesión. Haga una incisión en el cuero cabelludo para identificar la lesión cerebral en la zona posterolateral del hemisferio derecho.Observe a través del cráneo semitransparente en busca de evidencia de una lesión cortical y una lesión hipocampal. De este modo, clasifique las crías como lesionadas o controles no lesionados. Después de verificar, cierre el cuero cabelludo con sutura y esterilice la incisión.Cuando los ratones tengan seis semanas de edad, evalúe su memoria en función del aprendizaje y la evitación de un estímulo adverso. Utilice un aparato comercial de evitación pasiva de dos compartimentos con paso escalonado para esta tarea. Para comenzar, coloque un ratón en el compartimento iluminado de la caja durante 30 segundos.Luego, abra la puerta entre los compartimentos y registre la latencia del animal para entrar en el compartimento oscuro. Permita hasta 300 segundos para realizar la tarea. Cuando las cuatro extremidades del ratón estén completamente dentro del compartimento oscuro, cierre la puerta.Luego, administre una descarga eléctrica de 1/2 miliamperio en las patas durante dos segundos y regrese al ratón a su jaula. Veinticuatro horas después, repita la prueba. Esta vez, permita que el ratón tarde un máximo de 300 segundos en trasladarse a la cámara oscura y no administre descarga eléctrica al ratón.Realice la prueba de caminata en escalera en ratones de seis semanas de edad para discriminar entre alteraciones sutiles de la función motora, utilizando análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Primero, prepare el aparato de escalera y luego coloque una cámara de video para grabar los movimientos de las extremidades de un ratón en el aparato. A continuación, coloque un ratón sobre el panel de inicio y comience a grabar con la cámara de video.Asegúrese de que el video muestre las patas con un enfoque adecuado. Cuando el ratón toque el último panel del aparato de escalera, detenga la grabación. Luego, regrese el ratón al panel de inicio y grabe nuevamente mientras cruza el aparato.Realice esto un total de cuatro veces por ratón en cada fecha de prueba. Posteriormente, al analizar el video, cuente manualmente el número de deslizamientos realizados por cada extremidad mientras reproduce el video a una velocidad de 1/10. Cuando una extremidad se desliza entre los barrotes, esto constituye un deslizamiento.Cuando los ratones tengan seis semanas de edad, evalúe su fuerza de agarre. Utilice un medidor de tensión de empuje/tracción, equipado con un alambre triangular de dos milímetros de diámetro, todo fijado a un panel. Coloque al ratón sobre el panel, sosteniéndolo por la cola.Luego, permita que el ratón alcance apenas el alambre metálico con sus extremidades anteriores. En cuanto los ratones agarren el alambre, tire suavemente de su cola hasta que suelten el agarre. El aparato registrará la fuerza máxima sobre el alambre en gramos.Repita esta prueba cinco veces antes de darle al ratón un descanso. Durante la prueba de fuerza de agarre, se observan movimientos notorios de desempeños precisos. Intente identificar esos movimientos a lo largo de cinco intentos antes de descansar al ratón, durante al menos un minuto para reducir su fatiga muscular.Después de que el ratón descanse al menos un minuto, repita la serie de cinco ensayos nuevamente. Luego, dé al ratón otro descanso y realice la serie por última vez en ese día de prueba. A partir de los datos, utilice el promedio de los tres puntajes más altos para cualquiera de las patas delanteras o para ambas patas delanteras para el análisis.Después de extraer los cerebros de animales de 14 semanas de edad con lesión por hipoxia-isquemia, los cerebros se evaluaron morfológicamente según presentaran sin lesión cortical, una lesión leve o una lesión grave. Los mismos animales fueron escaneados mediante resonancia magnética una semana antes, lo cual también resultó muy revelador. Incluso el cerebro morfológicamente normal mostró una lesión leve en el hipocampo.A las seis semanas de edad, cinco semanas después de la lesión, los ratones fueron evaluados mediante diversas tareas conductuales. Los ratones con lesión por hipoxia-isquemia presentaron deterioro cognitivo en la tarea de evitación pasiva a las 24 horas. Dado que solo el hemisferio derecho resultó dañado, los ratones mostraron funciones motoras hemiplégicas.Esto se reveló mediante la diferencia en el porcentaje de resbalones en los travesaños transversales de la escalera para cada miembro anterior. Además, dado que la fuerza de prensión involucra la corteza motora del cerebro, los grupos de control normal y con lesión cortical mostraron diferencias en la potencia de prensión. No se observó ninguna diferencia entre los controles normales y los ratones clasificados como no lesionados, pero los ratones lesionados presentaron una clara alteración.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ligar la arteria carótida derecha unilateral para generar ratones neonatos con isquemia-hipoxia y cómo realizar análisis conductuales de seguimiento. Es importante tener en cuenta que, incluso cuando no se observa daño visible en el cerebro cortical siete días después de la lesión, una resonancia magnética puede revelar una lesión en el hipocampo. Además, es fundamental recordar tratar a las crías con suavidad y completar la cirugía lo más rápidamente posible.Los cachorros tienen la piel muy débil y delgada, así que tenga mucho cuidado.

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