Name: Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Keşfedin kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemini düşük-bereket tavuk embriyonik örneklerinde histon modifikasyonları bağlanma profillerini incelemek için. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında epigenomik profiller oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Jan Appel bu protokolü kurulması sırasında onun mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Rada-Iglesias laboratuvar çalışmalarında intramural CMMC tarafından desteklenmektedir finansman, DFG araştırma hibe (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 ve TE 1007/3-1) UoC gelişmiş araştırmacı grup Grant ve CECAD Grant.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkarlarının açıklanması gerekir var mı.

Epigenomic çip seq kullanarak Histon modifikasyonu profil oluşturma farklı hücresel bağlamlarda4,5,18omurgalı genleri fonksiyonel ek açıklama geliştirmek için kullanılabilir. Bu epigenomic profilleri, diğer şeyler arasında artırıcı öğeleri, arttırıcılar (hazır veya hazırYani, aktif,) yasal durumunu tanımlamak ve farklı biyolojik büyük hücre kimlik düzenleyiciler tanımlamak için tanımlamak için kullanılabilir veya patolo...

Histon translasyonel modifikasyonlar doğrudan transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2,3de dahil olmak üzere çeşitli Kromatin bağlı işlemlerde söz konusu. Ayrıca, farklı Histon değişiklikleri olumlu gösterir (Örneğin, H3K4me3 ve H3K27ac) veya negatif (Örneğin, H3K9me3 ve H3K27me3) gen ekspresyonu ile korelasyon ve genel olarak tanımlanabilir etkinleştirebilir veya baskıcı Histon işaretler gibi sırasıyla2,3. Sonuç olarak, küresel Histon değişiklik haritalar, epigenomic haritalar, olarak da işlevsel olarak omurgalı genleri4,5ek açıklama eklemek için güçlü ve evrensel araçlar ortaya çıkmıştır. Arttırıcılar tespit edilmesi gibi örneğin, distal düzenleyici dizileri belirli Kromatin imzalar varlığı dayalı (Örneğin, etkin arttırıcılar: H3K4me1 ve H3K27ac), hangi proksimal organizatörü bölgelerden onları ayırmak (Örneğin, etkin rehberleri: H3K4me3)6,7,8. Öte yandan, genlerin büyük hücre kimlik düzenleyici fonksiyonları ile genellikle H3K4me3 H3K27me3, altta yatan genlerin transcriptionally etkin veya etkin olmayan durumuna bağlı olarak sırasıyla yine geniş Kromatin etki alanları ile9 bulunur ,10. Benzer şekilde, büyük hücre kimlik genlerin ifade sık sık çoklu tarafından ve dağınık şekilde kontrol edilebilir için geniş H3K27ac işaretlenmiş etki alanları11tanımlanabilir arttırıcılar (Yani, süper arttırıcılar), kümelenmiş gibi görünüyor.
Şu anda, Histon değişiklik haritalar sağlayan ChIP-yonga (ChIP microarrays için birleştiğinde) gibi önceki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlük, daha az eserler, daha az gürültü, daha fazla kapsama alanı ve alt ChIP-seq teknolojisi kullanılarak oluşturulan maliyeti12. Yine de, ChIP-seq teknolojisini kullanarak epigenomic haritalar nesil çoğunlukla çip faiz örneklerinde başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için kapasite ile ilişkili doğasında kendi sınırlamaları vardır. Geleneksel çip protokolleri genellikle milyonlarca hücre hangi sınırı içinde in vitro hücre için bu yöntemin uygulanabilirliği hatları veya bu hücreler kolayca izole vivo içinde (Örneğin, kan hücreleri) olabilir, gerekli. Son birkaç yıl içinde bir dizi modifiye ChIP Protokolü düşük hücre sayıları ile uyumlu açıklanan13,14,15,16olmuştur. Ancak, bu iletişim kuralları (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştiğinde olabilir için özel olarak tasarlanmış ve genellikle özel Kütüphane hazırlama yöntemleri13,14, kullanın 15 , 16.
Burada, Histon değişiklik profilleri için ara düşük hücre sayıları (5 x 104 - 5 x 105 hücreleri) kullanarak araştırmak için kullanılan bir çip protokol açıklanan ya da seçili loci (Yani, ChIP-qPCR) veya genel olarak (Yani, Çip seq) (şekil 1). ChIP-seq teknoloji birleştiğinde, bizim çip Protokolü standart kitaplığı hazırlama yöntemleri, böylece birçok laboratuar10genel olarak erişilebilir yapmak ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı birkaç Histon işaretleri araştırmak için kullanılan (örneğin, H3K4me3, H3K27me3 ve H3K27ac) farklı tavuk embriyonik dokularda (Örneğin, spinal Nöral tüp (SNT), iyi çikinti ve epiblast). Ancak, biz genel olarak hangi biyolojik ve/veya klinik olarak ilgili örnekleri yalnızca düşük miktarlarda elde edilebilir diğer organizmalar için uygulanabilir olmalıdır tahmin.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BSA tozu</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tuzlu su tamponu (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Deoksikolat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Aplikhem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protein G / manyetik boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>% 37 Formaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-bütirat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Proteinaz inhibitörü</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb merdiven</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Oktilfenol Etoksilat (Triton X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&akut; s Modifiye Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme uçları Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td>Plakaları Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyu</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &mikro; L Filtre uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 & mikro; L Filtre uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 & mikro; L Filtre uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0,5 - 10 & mikro; L Filtre uçları</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 antikor</td><td>Aktif Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac antikor</td><td>Aktif Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 antikor</td><td>Aktif Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 antikor</td><td>Aktif Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>Son Onarım Karışımı</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Paramanyetik boncuklar</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden süspansiyon tamponu</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Kuyruk Karışımı</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon Karışımı</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA Adaptör İndeksleri</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Durdurma Ligasyonu Tamponu</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primer Kokteyl</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş PCR Karışımı</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA merdiveni</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Numune Tamponu</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Kütüphane Miktar Belirleme Kiti</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Bereketli tavuk beyaz yumurtaları</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>İğne (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (Ecoject 10 mL)</td><td>dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</ güçlü></td><td><güçlü>Yorumlar</güçlü</td></tr><tr><td>><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Termoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Aktif Motive</td><td>EpiShear probu sonikatör</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Değişken hacim (5 &ndash; 1.000 &mu; L) pipetler</td><td>, Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td>,</tr><tr><td>Zamanlayıcı</td>, <td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>, Manyetik tutucu</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>, DynaMag-2, 12321D,</td><td></td></tr><tr><td>Masa döndürücü</td>, <td>Heathrow, Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mikser,</td><td>LMS</td><td>VTX, 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR Döngüleyici,</td><td>Roche</td><td>Işık Döngüleyici; Seri No.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Döngüleyici</td><td>Uygulamalı</td><td>Biyosistemler Gen Amp PCR Sistemi 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA ve RNA kalite kontrol sistemi</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Delikli kaşık</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

kromatin immunoprecipitation (chip) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) post-translationally tarihinde Histon, Histon çeşitleri, transkripsiyon faktörleri ya da Kromatin değiştirici enzimler belirli bir odağı veya bir genom geniş ölçekte lokalizasyonu eşleştirmek için bir yaygın kullanılan tekniktir. ChIP deneyleri ile yeni nesil sıralama (Yani, ChIP-Seq) kombinasyonu genel olarak gen düzenleyici ağları ortaya çıkarmak için fonksiyonel ek açıklama genleri, özellikle sıralarının kodlamayan düzenleyici geliştirmek için güçlü bir yaklaşımdır. Çip iletişim kuralları normalde böylece nadir hücre tipleri veya küçük doku biyopsisi soruşturma için bu yöntem uygulanabilirliği iyileştirmelerden hücresel malzeme büyük miktarda gerektirir. Biz burada hangi adımları tamamlamak için gereken basitleştirilmiş bir çip Protokolü çip tahlil genellikle vivo içinde sırasında erken omurgalı embriyo elde edilebilir biyolojik malzeme miktarı ile uyumlu hale getirmek için tarif tahlil örnek kaybı en aza indirmek için azaltılmış. Bu çip protokolü farklı Histon değişiklikler çeşitli embriyonik tavuk ve yetişkin fare dokular Orta hücre sayıları (5 x 104 - 5 x 105 hücreleri) düşük kullanarak araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Önemlisi, bu iletişim kuralı standart kitaplığı hazırlama yöntemleri kullanarak ChIP-seq teknoloji ile uyumludur, böylece küresel epigenomic sağlayan son derece alakalı embriyonik dokularda haritalar.

Bizim çip protokol performansını göstermek için biz ChIP-seq HH19 tavuk bebekleri havuza alınan SNT bölümleri kullanarak deneyler, HH22 üst çıkıntıların tavuk embriyo ve sahne-HH3 tavuk bebekleri bağlama profilleri araştırmak için gerçekleştirilen çeşitli Histon değişiklikler (Yani, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 ve H3K27me3). Bir kez çip DNA'lar elde edilmiştir, sonication verimliliği karşılık gelen giriş DNA'lar (şekil 3) özel Jel Elektroforez tarafında...

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Bu prosedürün genel amacı, omurgalı genomlarının fonksiyonel açıklamasını iyileştirmek için düşük bollukta embriyonik örnekler kullanarak farklı histon modifikasyonlarının bağlanma profillerini araştırmaktır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, belirli bir embriyonik dokunun kimliğini tanımlayan temel güçlendiriciler ve genler gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları, sınırlı miktarda özel materyal gerektirmesi ve hem lokal spesifik hem de genom çapında analizler için kullanılabilmesidir.Bu yöntem, embriyonik dokularla transkripsiyon regülasyonu veya hücresel heterojenlik hakkında bilgi sağlayabilse de, patent örnekleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu deney için tavuk embriyoları olan evre HH19'u elde etmek için, verimli beyaz Leghorn tavuk yumurtalarını üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 80 nemde yatay yönde kuluçkaya yatırın. HH19 embriyolarını izole etmeye başlamak için, blastodermi düşürmek için 10 milimetrelik bir şırınga ile üç mililitre albümin çıkararak onları erişilebilir hale getirin.Ekstra embriyonik zarları çıkarmak için, gözde küçük bir açıklık açmak için ince makas kullanın. Bir mililitre kilit çözeltisi ekleyin. Bükülmüş bir iğne yardımıyla 0,5 mililitre Hint siyah mürekkebi ekleyin.Embriyoyu çevreleyen ekstra embriyonik zarı kesmek için ince cerrahi makas ve forseps kullanın. Daha sonra embriyoyu delikli bir kaşıkla 20 mililitre PBS çözeltisi içeren 4,5 santimetrelik bir petri kabına aktarın. Stereo mikroskop altında buz üzerinde çalışarak, amniyonunu ve ekstra embriyonik zarın kalan kısımlarını incelemek ve atmak için ince makas ve forseps kullanın.Daha sonra, transvers spinal nöro tüpü veya SNT segmentini embriyonun brakiyal seviyesinde kesin. SNT'yi izole etmek için diseksiyonu kaudal olarak torasik bölgeye uzatın. Bitirmek için, SNT'yi lateral ve ventral olarak çevreleyen dokuları çıkarmak için forseps kullanın.SNT'leri izole ettikten sonra, her bir segmenti 37 santigrat derece ılık tripsin içeren 3,5 santimetrelik bir petri kabına daldırın. SNT etrafındaki nöro olmayan dokuların gevşemesi stereo mikroskop altında görüldüğünde, numuneleri soğuk 1x PBS'ye aktarın. Tripsinizasyonu durdurmak için numuneleri %10 FBS içeren soğuk DMEM içeren yeni bir kaba aktarın.Kalan mezenkimal ve ektodermal dokuları SNT'den manuel olarak çıkarmak için forseps kullanın. Bu temiz SNT bölümünü 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Daha sonra, dokuyu metin protokolüne göre homojenize edin.13,5 mikrolitre% 37 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 15 dakika inkübe edin. Formaldehiti söndürmek için, tüpe 25 mikrolitre 2.5 molar glisin ekleyin ve oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 10 dakika inkübe edin. Tüpü santrifüjleyin ve ardından, peleti metin protokolüne göre yıkayın.Çapraz bağlamadan sonra, peleti 300 mikrolitre buz gibi soğukta yeniden süspanse edin, pipetleme ile tam lizis tamponu. Numuneleri sallanan bir platformda dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri dört santigrat derecede sonikleştirin.Sonikasyondan sonra, numuneleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 x G'de santrifüjleyin. Süpernatanı veya lizatı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hücresel kalıntı peletini atın. Lizatı metin protokolüne göre seyreltin.Ardından, giriş kontrolü olarak her numuneden küçük bir alikot tutun ve 20 santigrat derecede dondurun. Kromatin çökeltisine maruz kalacak kalan numuneleri inkübe edin veya metin protokolüne göre uygun antikorlarla çipleyin. Ardından, daha önce yıkanmış manyetik boncuklara 300 mikrolitre antikora bağlı kromatin ekleyin.Numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Antikorları boncuklara bağlamak için, tüpleri bir tüp döndürücüye yerleştirin ve en az dört saat boyunca dört santigrat derecede dikey olarak döndürün. Kromatine bağlı boncukları yıkamak için, buz üzerinde bekletilen tüpe bir mililitre buz gibi RIPA yıkama tamponu ekleyin ve tüpü ters çevirerek veya hafifçe vurarak karıştırın.Tüpü oda sıcaklığında manyetik tutucuya yerleştirdikten sonra boncukların yana oturmasını bekleyin. Berrak sıvıyı dökün ve bu yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Tüpe bir mililitre TE 50 milimolar sodyum klorür ekledikten sonra, bu çözeltideki kromatine bağlı boncukları taze bir 1.5 milimetre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve boncuklar yerleştiğinde sıvıyı boşaltın. Daha sonra, boncukları önceden soğutulmuş bir santrifüjde üç dakika boyunca dört santigrat derecede 900 x G'de santrifüjleyin. Boncuklar manyetik tutucuya yerleştirildikten sonra, kalan tüm TE'yi bir jel yükleme ucu kullanarak çıkarın.Oda sıcaklığında çalışarak, boncuklara 210 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve hafifçe vurarak yeniden askıya alın. Tüpü önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri boncuklarla oda sıcaklığında 16.000 x G'de bir dakika santrifüjleyin.Boncuklar manyetik tutucuya yerleştikten sonra, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Önceden donmuş giriş kontrol örneğini 20 santigrat dereceden oda sıcaklığına kadar çözdürün. Numuneye 90 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve kısa bir süre girdaplayarak karıştırın.Çapraz bağları tersine çevirmek için, çipi ve kontrol numunelerini gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında çalışarak, tüp başına bir hacim TE tamponu ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. RNA'yı sindirmek için, kontrol ve çip örneklerine RNAse A'yı mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve karıştırmak için tüpleri ters çevirin.Tüpleri önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sonraki DNA saflaştırması için proteini sindirmek için, tüplere mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona proteaz K ekleyin ve karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Tüpleri önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 55 santigrat derecede iki saat inkübe edin.DNA'yı ek materyallere göre çıkarın ve saflaştırın. Bu DNA artık kantitatif PCR ve çip arama kütüphanesi hazırlığı için kullanılabilir. Başarılı bir çip için gerekli olan sonikasyon verimliliği, giriş kontrol numunelerinin agaroz jel elektroforezi ile doğrulanır.Bu örnekte, tavuk spinal nöral tüpü veya SNT bölümleri kullanılarak, 200 ila 500 baz çifti arasında değişen optimal bir parça boyutu elde etmek için 11 sonikasyon döngüsü kullanıldı. Yontulmuş DNA, tavuk SNT'sinde aktif ve inaktif olan genlerin promotör bölgeleri etrafındaki aktive edici ve baskılayıcı histon işaretlerinin zenginleştirme seviyelerini ölçmek için kantitatif PCR ile analiz edildi. Bu, daha fazla analiz için çok fazla DNA kaybetmeden sadece birkaç düşük tarafı ölçerek yontulmuş kaliteyi değerlendirmenin mümkün olduğunu göstermektedir.Çip arama kütüphaneleri sırayla hazırlandıktan sonra, tavuk SNT'sinde üretilen H3K27 tri metilasyon ve H3K4 tri metilasyon çip arama verileri için temsili bir çekirge gösterilmiştir. Benzer çip arama profilleri, maksiller çıkıntılar ve evre HH3 embriyoları gibi farklı tavuk embriyonik dokularında da başarıyla oluşturuldu. Bu, burada sunulan çip protokolünün sınırlı miktarlarda çeşitli embriyonik dokulardan epigenomik profiller oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.Embriyonik bir dokuda histon modifikasyon profillerini oluşturmak için bu protokolü kullanarak, sinyallerin bu dokuda bulunan tüm farklı hücre tiplerinden geleceğini hatırlamak önemlidir. Bu protokolü takiben ve daha fazla başlangıç biyolojik materyali kullanarak, transkripsiyon faktörleri, koaktivatörler veya RNA polimeraz 2 alt birimleri gibi transkripsiyonel düzenlemede yer alan diğer proteinlerin bağlanma profillerini araştırmak mümkün olmalıdır. Bir kez kurulduktan sonra, bu protokoller gelişim biyolojisi veya tıbbi genetik alanındaki araştırmacıların omurgalı genomlarının işlevsel değişimini iyileştirmelerini ve miyogenez, evrim ve insan hastalıklarının moleküler temeli hakkında önemli bilgiler edinmelerini sağlayacaktır.

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu makalede, ChIP sıvı işleyici platformu kullanılarak belirli bir histone modifikasyonu (H3K27ac) ile ilişkili DNA bölgelerinin yarı otomatik, mikro ölçekli ChIP-Seq protokolü ve ardından etiketleme kullanılarak kütüphane hazırlığı açıklanmaktadır. Prosedür, kalite ve nicelik amaçları için kontrol değerlendirmesini içerir ve diğer histone modifikasyonlarına veya transkripsiyon faktörlerine benimsenebilir.

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Keşfedin kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemini düşük-bereket tavuk embriyonik örneklerinde histon modifikasyonları bağlanma profillerini incelemek için. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında epigenomik profiller oluşturur.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Daha fazla video keşfet