Roman bakteri özel optik tarama Ex Vivo insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları

Bu optik görüntüleme tekniğinin genel amacı, insan akciğerindeki enfeksiyonu görüntülemek için klinik izlenebilirliğe sahip olabilecek yeni bakteriye özgü optik probların hızlı bir şekilde taranması için bir araç sağlamaktır. Bu yöntem, yeni optik bileşiklerin hedeflerine özgü olup olmadığı ve tespit edilebilir olup olmadığı gibi moleküler görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çevrilebilir olmasıdır.

Klinikte bulunan ekipmanı kullanarak gelecek vaat eden görüntüleme problarını seçmek, probların o ortamda çalışacağına dair güven sağlar. Görüntülemeden hemen önce, insan akciğer dokusu örneğini dondurucudan kuru buz üzerinde çıkarın. Oda sıcaklığında, dokunun hafifçe çözülmesine izin verin, böylece bir neşter ile bir ila dört milimetrelik bölümlere dilimlenebilir.

Forseps kullanarak, dilimlenmiş insan akciğer dokusunu 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı doku kültürü plakasının kuyularına yerleştirin. Kullanılmayan insan akciğer dokusunu hemen saklama kabına geri koyun ve eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri taşımak için kuru buzun üzerine koyun. Daha sonra, numunedeki kanı yıkamak için bir pipetle her akciğer dokusu örneğine 100 mikrolitre PBS ekleyin.

Tüm dokunun PBS ile kaplandığından ve kuyu duvarlarına yapışmadığından emin olmak için pipet ucunu kullanın. PBS'yi çıkarın ve atın. Daha sonra, akciğer dokusu içeren her bir kuyucuğa 100 mikrolitre lekesiz Calcein etiketli veya test probu etiketli bakteri pipetleyin.

Ayrıca, 100 mikrolitre PBS'de akciğer dokusu ile kontroller ayarlayın. İlk olarak, fiberli konfokal floresan mikroskobu görüntüleme fiber konektör ünitesini bir fiber temizleyici ile temizleyin. Toz ve kiri temizlemek için konektörü temizleme şeridine ileri doğru hareket ettirin.

Lazer tarama ünitesinin önündeki koruyucu sarı kapağı çıkarın. Gümüş göbeği durana kadar saat yönünün tersine hafifçe çevirerek LSU göbeğini hazırlayın. FCFM görüntüleme fiber konektörünü yukarı bakacak şekilde takın.

Elyafı yerinde tutun ve gümüş göbeği iki kez tık sesi gelene kadar saat yönünde çevirin. Gümüş göbeği saat yönünde 45 derece daha çevirerek bağlantıyı tamamlayın. Ardından, FCFM görüntüleme fiber kalibrasyonunu tamamlamak için açılan talimatları izleyin.

İlk olarak, ekrandaki lazer başlat düğmesine basarak FCFM görüntüleme fiber testini gerçekleştirin. Lazer merkezlenecektir. Kalibrasyon kitinden yeni şişeler seçin ve ekrandaki talimatları izleyin.

FCFM görüntüleme fiberinin distal ucunu sarı şişeye yerleştirin ve monitörde floresan artışını izleyin. Ardından lif ucunu karıştırmadan kırmızı şişeye yerleştirin. Floresanın kaybolmasını bekleyin.

Son olarak, lif ucunu mavi şişede durulayın. Ardından, FCFM görüntüleme fiberini mavi şişeye yerleştirerek arka plan edinimi gerçekleştirin. Lazeri başlat'a basın ve ardından bir seçenek haline geldiğinde hesaplayın.

Son olarak, FCFM görüntüleme fiberini sarı şişeye yerleştirerek fiber tespiti yapın. Yine, lazeri başlat'a ve ardından hesapla'ya basın. Otomatik kalibrasyon sırasında, FCFM görüntüleme fiberinin distal ucunu, yazılım tarafından belirtildiği gibi kırmızı şişeye 10 saniyeden daha uzun süre ve ardından mavi şişeyi en az dört saniye boyunca yerleştirerek temizleyin.

Veri toplamaya başlamak için ekranda başlat'a tıklayın veya lazeri açmak için sol ayak pedalına basın. Ardından, bakteri süspansiyon örneklerinin her birini görüntüleyin. FCFM görüntüleme fiberinin distal ucunu yerleştirin ve numuneyi sorgulamak için fiberi süspansiyon boyunca yavaşça hareket ettirin.

Sağ ayak pedalına basarak veya fiber numune etrafında yavaşça hareket ederken ekrandaki kayıt kontrollerini seçerek herhangi bir uzunlukta video kaydedin. FCFM görüntüleme fiberinin distal ucunu numuneler arasında %8 hidrojen peroksit ve lens temizleme dokuları ile temizleyin. Akciğer dokusu örneklerinin her birini görüntülemek için, FCFM görüntüleme lifinin distal ucunu numuneye yerleştirin ve lifin ucu ile doku arasında doğrudan temas kurulduğundan emin olun.

Ardından, numuneyi sorgulamak için görüntüleme fiberinin ucunu yavaşça hareket ettirin. Lifin ucunun dokudan uzağa kaldırılması, dokuyu odak düzleminden uzaklaştıracaktır. Bununla birlikte, bu, dokuya yapışmamış etiketli bakterileri görüntülemek için kullanılabilir.

Sağ ayak pedalına basarak veya fiber numune etrafında yavaşça hareket ederken ekrandaki kayıt kontrollerini seçerek herhangi bir uzunlukta video kaydedin. FCFM görüntüleme fiberinin distal ucunu lens temizleme dokuları ve numuneler arasında% 8 hidrojen peroksit ile temizleyin. Sistemi kapatmak için sol ayak pedalına basarak veya ekran düğmesine tıklayarak lazeri kapatın.

Ardından, gümüş LSU göbeğini durana kadar saat yönünün tersine çevirerek FCFM görüntüleme fiberini CLE cihazından ayırın. Ardından, fiber konektörü LSU'dan yavaşça çekerek FCFM görüntüleme fiberini LSU hub'ından çıkarın. Koruyucu kapakları, LSU ünitesinin önündeki FCFM görüntüleme fiberinin proksimal ucuna geri koyun.

FCFM görüntüleme fiberini %8 hidrojen peroksit ve lens temizleme dokuları ile temizleyin ve dezenfekte edin. Son olarak, elyafı nazikçe saklama kutusuna yerleştirin. Yazılımı açın ve yazılım panosundaki git simgesi aracılığıyla bilgisayardaki uygun dizini seçerek dosyaları analiz için içe aktarın.

Açmak için her video dosyasına çift tıklayın. Videolar, optimize edilmiş renk arama tablosu ve renk tablosu ayarıyla otomatik olarak oynatılır. Yoğunluk ölçeği çubuğunun üzerindeki değnek düğmesine tıklayarak otomatik yoğunluk ölçeklendirmesini devre dışı bırakın.

Düğmenin etrafında siyah gölgelenme olmadığında özellik devre dışı bırakılır. En iyi kontrastı vermek için minimum ve maksimum çubukları hareket ettirerek istediğiniz yoğunluk ölçeklendirmesini seçin. En geniş dinamik aralığın yakalandığından emin olmak için yoğunluk ölçeklemesini seçerken histogram aracını kullanın.

İstenen ölçeklendirme elde edildikten sonra, varsayılan yeşil olarak listelenen açılır menü düğmesine sağ tıklayın. Arama tablosunu kaydetme seçeneğini belirleyin. Arama tablosunu istediğiniz konuma kaydedin.

Veri kümesindeki diğer her video için, varsayılan yeşil açılır menünün üzerine sağ tıklayıp arama tablosunu yükle'yi seçerek aynı arama tablosunu uygulayın. Veri kümesindeki tüm videolara tutarlı yoğunluk ölçeklendirmesi uygulamak için uygun dosyayı seçin. Film makarası düğmesine tıklayarak işlenen videoları dışa aktarın.

Bir MPG dosyası oluşturacak olan istediğiniz video formatını seçin. Ardından dışa aktar'a basın ve video dosyasını kaydetmek için dosya konumunu seçin. Etiketli bakteriler videoda yeşil yanıp sönen noktalar olarak görselleştirilir.

Akciğer dokusu yapısı, alveolar boşluğun siyah göründüğü sıralı floresan iplikleri olarak görünecektir. Etiketlenmemiş Staph aureus bakterileri, FCFM tarafından görüntülendiğinde floresan parlamaz, bu da optik görüntüleme bileşiklerinin gerekliliğini gösterir. Taramaya tabi tutulan floresan bileşiklerle başarılı bir şekilde etiketlenen staph aureus, FCFM ile görüntülendiğinde görülebilir.

Şekil, başarıyla etiketlenmiş Staph aureus'u göstermektedir. İnsan akciğer dokusu 488 nanometrede otomatik floresan alır. Video, FCFM tarafından görüntülenen insan akciğer dokusunu göstermektedir.

Dokuya etiketlenmemiş Staph aureus eklendi. Görülemezler. Bununla birlikte, başarılı bir şekilde etiketlenmiş bakteriler, FCFM görüntüleme ile bir insan akciğer dokusu arka planına karşı küçük parıldayan noktasal noktalar olarak görülebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik numune numarasına bağlı olarak 10 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kurulum kalibrasyonlarını gerçekleştirirken ve numune görüntüleme arasında elyafı iyice temizlemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik örneklerin görüntülenmesi için FCFM cihazının nasıl kurulacağını ve yakalanan verilerin nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, bakteri hücre sayısının belirlenmesi ve etiketleme sonrası canlılık gibi ek soruları yanıtlamak için CFU kaplama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. İnsan dokusu ve patojen bakterilerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.