Name: Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Biolumineszenz-Imaging-Methode ALLIGATOR zur Langzeitbeobachtung von Genexpression in Zellkulturen. Dieses System ermöglicht reproduzierbare zirkadiane Rhythmusstudien unter variablen Bedingungen.

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Wir möchte Cairn-Forschung danken für die Arbeit mit uns dieses System vor allem Mark Henson, Jeremy Graham und Joao Correia zu entwickeln. Wir danken auch David Welsh und Akhilesh Reddy für wertvolle Diskussion während der Entwurfsphase, sowie Peter Laskey (früher von Hamamatsu) für die Vermittlung des Darlehens eines Demo-Kamera und David Wong für seine kritische Eingabe des Manuskriptes.

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
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<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
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<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte bestehen.

Das hier beschriebene Protokoll ist für Säugetier-Zellkultur, beide perfundierten und statischen Bedingungen. Der ALLIGATOR kann jedoch leicht auf andere Modellsysteme angepasst. In der Tat hat sich bereits gezeigt, eine hervorragende Plattform bieten für die gleichzeitige Überwachung der Fortbewegung, Schlaf und peripheren gen Ausdruck Rhythmen in Drosophila Melanogaster unter ständige Dunkelheit15. aufrechterhalten Es wird darauf hingewiesen, dass je nach Anwendung, Kamera-Typen als die hier erwähnten geeignet sein können. Wir uns vorstellen, dass mit den entsprechenden Filtern, eine modifizierte Version des aktuellen Setups im Prinzip für die Fluoreszenz-Quantifizierung verwendet werden könnte.
Die einzigen Anwendungen, für die der ALLIGATOR möglicherweise nicht geeignet, sind diejenigen, für die besonders hoher räumlicher Auflösung erforderlich, z. B. Bildgebung der räumlich-zeitliche Organisation der PER2::LUC Ausdruck in den Säugetieren organotypischen Scheiben suprachiasmatischen Kern, oder andere kleine Gewebe-Scheiben.
Der ALLIGATOR ermöglicht viele Experimente durchgeführt werden, die bisher nicht durch konventionelle Aufnahmetechniken leicht erreichbar gewesen. Im Vergleich mit aktuellen Methoden zur Messung der Biolumineszenz, bietet der ALLIGATOR mehr Flexibilität bei der sowohl die Art der Zelle Kulturschale oder Folie, die verwendet werden kann, die externen Medien Bedingungen, Empfindlichkeit und Processivity.
Dies gilt insbesondere in einer Zeit wenn es eine Abkehr von der standard 2D Kultur Zellmodelle in Richtung 3D organoide und Flow-Kultur-Systeme ist. Als solche wird davon ausgegangen, dass der ALLIGATOR eine anpassungsfähige Methode zur Verfügung stellt, mit der Biolumineszenz über viele Tage und Wochen unter den unterschiedlichsten Bedingungen gemessen werden kann.

Die Verwendung von Luciferases als Reporter der Genexpression und Proteinaktivität ist eine populäre Technik in der molekularen und zellulären Biologie Forschung geworden. Dies gilt im circadianen Bereich, wo die Kinetik der Firefly Luciferase Synthese und katalytische Inaktivierung sind besonders gut geeignet zur Berichterstattung der longitudinalen Veränderungen der Genexpression, die über die ca. 24 h circadiane Zyklus auftreten. Als solche wird Luciferase als circadiane Reporter in verschiedensten Organismen, einschließlich Pilze, Pflanzen, fliegen und Säugetiere1,2,3,4eingesetzt.
Wenn zirkadiane Gene Expression in Vitrozu quantifizieren, ist ein Photomultiplier Schlauch (PMT) verbreitet die biolumineszente Signal aufzeichnen. PMT-basierten Messungen haben jedoch eingeschränkt in der Regel auf einer vorher festgelegten Platte oder Schüssel Größe beschränkt. Es ist auch nicht möglich, alle räumlichen Informationen zu sammeln, aus Proben mit einem PMT, die führen kann zu einem Verlust von Informationen beim Proben abbilden, die räumliche Variation in Luciferase Ausdruck zeigen überwacht. Darüber hinaus wie die PMT und zugehörigen Elektronik anfällig für Fehlfunktionen bei der feuchte Umgebung eine Standardzelle Kultur Inkubator ausgesetzt sind, erfolgt längs Luciferase-Aufnahme mit PMTs stets in Inkubatoren nicht befeuchtet. In der Folge Zelle Kultur Gerichte müssen dicht sein Luft-um Feuchtigkeitsverlust durch Verdunstung zu verhindern und die Nährmedien müssen daher mit 3 - gepuffert werden (N- Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) oder 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), anstatt die CO2/bicarbonate Pufferung System, das funktioniert in Vivo und wird routinemäßig in Säugetieren Gewebekultur verwendet.
Aufgrund dieser Beschränkungen schränkt Messung der Biolumineszenz von PMTs in der Regel engen auf die Bedingungen, unter denen Zellen während der Experimente gewahrt sind. Um diese Probleme zu überwinden, und auch zur Erhöhung der Reichweite der experimentellen Bedingungen, verwenden wir einen standard CO2/n2 170 L Gewebekultur-Inkubator, der durch die Zugabe von einem Wasser-gekühlten Elektron-Multiplikation angepasst wurde – Coupled Ladegerät (EMCCD) Kamera mit Antibeschlag-Optik und die digitale Steuerung von Temperatur und Gas. Dies ist eine automatisierte längs Luciferase Imaging Gas- und Temperature-Optimized Recorder oder ALLIGATOR bezeichnet worden. Der ALLIGATOR ermöglicht eine wesentlich höhere Flexibilität der Biolumineszenz imaging, sowohl für Hochdurchsatz-Bildgebung der standard Gewebekultur Platten (bis zu 6 X 96 oder 384-Well-Platten gleichzeitig) und auch für nicht standardmäßige Gewebekultur-Systeme, so als perfundierten Zellen in mikrofluidischen Geräte angebaut. Dieses Instrument ermöglicht auch imaging zu feuchte Bedingungen und Variable Steuerung der CO2 und O2 Partialdruck sowie Temperatur auftreten.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode für die Biolumineszenz Aufzeichnung von Säugetierzellen und Gewebekultur Systeme mit einem ALLIGATOR (im folgenden als "Biolumineszenz Inkubator" bezeichnet). Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass das System gut geeignet zur Biolumineszenz Bildgebung und auch mit einigen Änderungen, Leuchtstofflampen, imaging, in einer Reihe von anderen biologischen Systemen und Kontexte wäre.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>Basalmedium</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superoxiddismutase</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holo-Transferrin</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (Trijod-L-Thyronin</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitin</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Galaktose</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticosteron</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Linolensäure</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolensäure</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Liponsäure</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Retinolacetat</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, alle trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Tocopherolacetat</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat Lösung</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R Inkubator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Pulver</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td></td><td>Sigma PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Innendurchmesser Silikonschlauch&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Winkel-Luer-Anschluss</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Männliche Luer-Fittings</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Weibliche Luer-Fittings</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide Luer I 0,6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak 20ml Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm I.D. ETFE-Schlauch</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Isothermes Deltaphasen-Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Beheizter Neutraldichtefilter&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Custom Artikel</td><td></td></tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Auslaufartikel</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg Kalibrierstandard</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Messgefäß</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Fokussierzylinder</td><td>Cairn Research</td><td>Custom item</td><td></td></tr><tr><td>NE-1600 programmierbare Spritzenpumpe</td><td>Pump Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Software</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

flexible messung der biolumineszenz reporter mit einer automatisierten längs luciferase imaging-gas - und temperatur-optimierte recorder (alligator)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-basierte Reporter der zellulären Genexpression sind weit verbreitet für beide längs- und Endpunkt assays biologischer Aktivität. In der zirkadianen Rhythmen Forschung entstehen z. B. Uhr gen Fusionen mit Firefly Luciferase robuste Rhythmen in zellulären Biolumineszenz, die über viele Tage hinweg beibehalten. Technische Einschränkungen verbunden mit Photomultiplier Tubes (PMT) oder konventionellen Mikroskopie-basierte Methoden zur Quantifizierung der Biolumineszenz haben in der Regel gefordert, dass Zellen und Gewebe ganz physiologischen Bedingungen während beibehalten werden Aufnahme mit einem Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Durchsatz. Hier berichten wir über eine Verfeinerung der vorherigen Methoden, die ermöglicht langfristige Biolumineszenz Bildgebung mit hoher Empfindlichkeit und Durchsatz die unterstützt eine breite Palette von Kulturbedingungen, einschließlich variabler Gas und Feuchtigkeitskontrolle, und akzeptiert, dass viele verschiedene Gewebekultur und Geschirr. Diese automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) auch ermöglicht die Beobachtung von räumlichen Variationen in Luciferase Ausdruck über eine Zelle Monolage oder Gewebe, das leicht durch herkömmliche beobachtet werden können Methoden. Wir heben hervor, wie der ALLIGATOR erheblich erhöhte Flexibilität für die Erkennung der Luciferase-Aktivität im Vergleich mit bisherigen Verfahren bietet.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Biolumineszenz Bildgebung von Säugerzellen mit einem ALLIGATOR (Biolumineszenz Brutkasten). Diese Technik ermöglicht eine Flexibilität der physische Aufbau und extrazelluläre Bedingungen beim biolumineszente Systeme abbilden. Methoden für einfache statische Gewebekultur (Abbildung 1, ergänzende Video 1) und perfundierten Zellkultur (Abbildung 2, ergänzende Video 2) beschrieben, aber viele andere Setups konnte mit diesem System abgebildet werden. Alle Daten wurden mit Hilfe der in Abschnitt 7 beschriebenen Methoden quantifiziert.
Abbildung 1A zeigt ein Beispiel video von einer Aufnahme von 6 x 96-Well-Platten mit PER2::LUC Fibroblasten4Biolumineszenz. Die Regionen in äußerster Brunnen enthalten keine Zellen, da diese nicht erforderlich für dieses Experiment. Zellen haben Differenztemperatur Entrainment, wobei sie entweder Temperatur-Zyklus von 12 h, bei 32 ° C, gefolgt von 12 h 37 ° C für 72 h oder das Gegenteil (12 h bei 37 ° C, gefolgt von 12 h, bei 32 ° C für 72 h), unterziehen bevor statt bei konstant 37 ° C für die Aufnahme unterzogen. 60 min Aufnahmen wurden stündlich genommen. Zwei von diesen Bedingungen sind in Abbildung 1 bquantifiziert.
Abbildung 2A zeigt eine schematische Darstellung der Einrichtung eines Systems zur perfundierten Gewebekultur. Diese besteht aus zwei Kanal Folien mit Schläuchen verbunden. Medien wird über die Zellen über eine Spritzenpumpe angetrieben. Die erste dieser Folien fungiert als eine durchlässige Blase Gassammelraum (Puffer Folie) und enthält keine Zellen, mit dem zweiten die Zellen auf dem Biolumineszenz aufgenommen. Ein Vertreter Videoaufnahme von diesem System ist in Abb. 2 bdargestellt. 15 min Aufnahmen wurden alle 15 Minuten. Hier werden Zellen gepflegt, standard Perfusion Bedingungen oder im Beisein von Kasein-Kinase-Inhibitor PF670462, das zuvor gezeigt worden ist, zu verlängern zirkadianen Periode und reduzieren die Amplitude der Uhr gen Ausdruck Rhythmen in kultivierten Säugerzellen14. Abbildung 2 (obere Abdeckung) zeigt die Auswirkung auf PER2::LUC Ausdruck gegen Zellen mit der gleichen Konzentration des Arzneimittels unter statischen Standardzelle Kulturbedingungen, dargestellt in Abbildung 2 (Bodenplatte) mit Quantifizierung der Zeitraum behandelt in Abb. 2Ddargestellt. Es ist daraus klar, dass die Behandlung mit PF670462 PER2::LUC Ausdruck unter beide Bedingungen beeinflusst. Während Zellen mit PF670462 behandelt unter perfundierten Bedingungen zeigen Periode Verlängerung von ca. 3 h (3 ±0.9 h), Zellen unter statischen Bedingungen mit dem Medikament behandelt zeigen jedoch deutlich mehr Zeit Verlängerung auf einen Zeitraum von &gt; 48 h. Dies kann durch eine gedämpfte Kosinus, fit sein, wie in Abschnitt 7 beschrieben (zusätzliche Summe der Quadrate F testen im Vergleich zu einer geraden Linie, p &lt; 0,0001). Interessanterweise ist das Ausmaß der Periode Verlängerung unter Perfusion viel näher an, die in Vivo14beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: Daten Beispiel. (A) Beispiel, das video-Schnappschuss der Biolumineszenz von verewigt PER2::LUC 6 x 96 auch im Inkubator Biolumineszenz Platten. Brunnen zu quantifizierenden wurden in der ergänzenden Video 1gelb hervorgehoben. (B) Quantifizierung der Biolumineszenz von A. Zwei Sätze von 3 Platten Zellen wurden mitgerissen mit Temperaturzyklen (12 h, bei 32 ° C; 12 h bei 37° C), die Anti-phasisch einander gegenüber Phasen der Proteinexpression PER2 produzieren waren (n = 6, bedeuten ± SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Abbildung 2: Perfusion mit CK1δ Inhibitoren. (A) schematische Darstellung der Perfusion System. (B) Beispiel video-Schnappschuss von einer Biolumineszenz, die Aufnahme von PER2::LUC unter Perfusion Zellen. Ein Probe-Bereich der Quantifizierung ist gelb markiert. (C) Quantifizierung der Biolumineszenz von PER2::LUC Fibroblasten unter Perfusion und unter statischen Bedingungen mit und ohne 3 µM CK1 Inhibitor PF670462 (n = 3, bedeuten ± SEM). Biolumineszenz ist auf minimalen und maximalen Werte normalisiert. (D) Analyse der Periode (Two-Way ANOVA, Holm-Sidak multiple Vergleiche-Test).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Mittlere Endkonzentration (μM)</td>
			<td>Lager (mg/mL)</td>
			<td>Für 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalase</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathion</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>0,6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxid-dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (Triiodo-L-Thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitin</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamin</td>
			<td>16</td>
			<td>Flüssigkeit (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) D-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumselenit</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosteron</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolsäure</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolensäure</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liponsäure</td>
			<td>0,2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol Acetat</td>
			<td>0,2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, alle trans</td>
			<td>0,3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-Alpha-Tocopherol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-Alpha-Tocopherol Acetat</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: NS21 Vorbereitung.
Ergänzende Video 1: Beispielvideo der Biolumineszenz von well-Platten. Beispiel video-Schnappschuss der Biolumineszenz von verewigt PER2::LUC in 6 x 96-well-Platten im Inkubator Biolumineszenz. Brunnen zu quantifizierenden sind gelb markiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Video 2: Beispiel-video-Schnappschuss von einer Biolumineszenz, die Aufnahme von PER2::LUC Zellen unter Perfusion. Ein Probe-Bereich der Quantifizierung ist gelb markiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Systems ist es, die einfache Beobachtung von biolumineszierenden Reportern unter einer Vielzahl von extrazellulären Bedingungen zu ermöglichen, einschließlich unter konstanter Medienperfusion. Mit dieser Methode kann die Biolumineszenz in Längsrichtung von kultivierten Zellen und Geweben beobachtet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Aufzeichnung von Zellen unter unterschiedlichen extrazellulären Medien- und Gasbedingungen ermöglicht, was in den meisten bestehenden Systemen nicht möglich ist.Obwohl wir diese Technik hier im Rahmen von Experimenten zum zirkadianen Rhythmus demonstrieren, könnte sie leicht auf andere Systeme angewendet werden, die eine Biolumineszenz- oder Fluoreszenzaufzeichnung über Zeitskalen von Tagen bis Wochen erfordern. Um den Eingriff zu beginnen, säen Sie kultivierte Zellen auf Gewebekulturschalen oder -platten aus. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis die Monoschichten eine Konfluenz von 100 % erreicht haben.Unmittelbar vor dem Experiment wechseln Sie mit einem computergesteuerten Zyklus-Inkubator alle 12 Stunden für mindestens 72 Stunden zwischen 32 und 37 Grad Celsius, um den Zellrhythmus zu synchronisieren. Eine robuste Synchronisation zellulärer zirkadianer Oszillationen sowohl innerhalb als auch zwischen Kulturen ist entscheidend für die experimentelle Reproduzierbarkeit. Wir erreichen dies, indem wir vor jeder Aufzeichnung tägliche Temperaturzyklen anwenden, die die Zellen synchronisieren, indem sie die Körpertemperaturrhythmen nachahmen.Alternativ kann auch eine pharmakologische Synchronisation sehr effektiv sein. Kombinieren Sie anschließend 8,3 Gramm DMEM-Pulver mit hohem Glukosegehalt mit 900 Millilitern Reinstwasser. Rühren Sie die Lösung 30 Minuten lang, um das Pulver vollständig aufzulösen.Fügen Sie dann der Lösung 50 Milliliter 100 Gramm pro Liter Glukoselösung, 20 Milliliter eines pH 7,6, eine molare MOPS-Lösung und 10 Milliliter 100-fache Penicillin-Streptomycin-Lösung hinzu. Rühren Sie die Mischung 10 Minuten lang. Fügen Sie dann 4,7 Milliliter einer 7,5%igen Natriumbicarbonatlösung hinzu und rühren Sie die Mischung weitere fünf Minuten lang.Verwenden Sie Salzsäure oder Natriumhydroxid, um den pH-Wert bei Raumtemperatur auf 7,6 einzustellen. Fügen Sie der Lösung Reinstwasser hinzu, um ein Endvolumen von einem Liter zu erreichen. Die Lösung wird durch einen 0,22-Mikrometer-Sterilfilter in einen Sterilkolben filtriert.Lagern Sie das gefilterte Garmedium bei vier Grad Celsius. Unmittelbar vor der Durchführung des Experiments ist die gewünschte Menge des Stammmediums mit 10 % Serum, zwei Millimolaren GlutaMAX, 2 % NS21 und einem Millimolar Luciferin zu ergänzen. Das resultierende Arbeitsmedium wird durch einen 0,22 Mikrometer großen Sterilfilter geleitet.Verwenden Sie eine fünfmolare Lösung von Natriumchlorid, um die Osmolalität des Arbeitsmediums auf 350 Milliosmole einzustellen. Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Um mit der Fokussierung der Biolumineszenz-Inkubator-Kamera zu beginnen, schrauben Sie den wasserundurchlässigen, beheizten Neutraldichtefilter ab.Stellen Sie in der Gerätesoftware die Belichtungszeit auf 0,2 Sekunden und die kinetische Zykluszeit auf 0,3 Sekunden ein. Vergewissern Sie sich, dass die Elektronenmultiplikationsverstärkung ausgeschaltet ist, schließen Sie dann das Setup-Fenster und starten Sie die Videoaufnahme. Drehen Sie das Kameraobjektiv mit dem Fokussierzylinder, bis die Prüflinge auf der entsprechenden Probenablage deutlich scharf sind.Stoppen Sie dann die Videoaufnahme. Setzen Sie den Neutralfilter wieder ein und entfernen Sie die Prüflinge. Verwenden Sie anschließend das Bedienfeld an der Vorderseite des Biolumineszenz-Inkubators, um die gewünschten Sauerstoff-, Kohlendioxid- und Temperaturwerte für das Experiment einzustellen.Für ein befeuchtetes Experiment füllen Sie die Wasserschale am Boden des Inkubators. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Gewebekultur-Inkubator und ersetzen Sie das Kulturmedium durch das vorgewärmte Arbeitsmedium. Bei befeuchteten Experimenten mit kleinen Volumina verschließen Sie die Platten mit gasdurchlässiger Folie oder Klebeband.Legen Sie die Platten in den Biolumineszenz-Inkubator. Schließen Sie den Inkubator und befestigen Sie die Türabdeckung, um Licht vom System abzuhalten. Stellen Sie dann in der Gerätesoftware den Erfassungsmodus auf kinetisch ein.Stellen Sie die gewünschte Belichtungszeit ein. Stellen Sie die Akkumulationen auf eins, die kinetische Serienlänge auf die gewünschte Anzahl von Aufnahmezyklen und die kinetische Zykluszeit auf das gewünschte Bildgebungsintervall ein. Stellen Sie eine Schaltgeschwindigkeit von 4,33 Mikrosekunden, eine Verstärkung von eins und eine EM-Verstärkung des gewünschten Pegels ein.Legen Sie dann den Dateityp für das automatische Speichern auf sif oder tiff fest. Benennen Sie die automatisch gespeicherte Datei und legen Sie den Dateipfad fest. Legen Sie den Dateityp für Spooling auf sif oder tiff fest.Benennen Sie den Dateistapel und legen Sie den Dateipfad fest. Schließen Sie das Setup-Fenster und beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, importieren Sie den erfassten Bildstapel in eine Bildverarbeitungssoftware.Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um die Biolumineszenz optimal zu betrachten. Wählen Sie dann die interessierenden Bereiche aus und exportieren Sie das mittlere Signal für die ausgewählten Bereiche. Kopieren Sie die Daten zur weiteren Verarbeitung in eine Analysesoftware.Zu Beginn des Experiments werden Zellen auf einkanaligen Objektträgern mit Luer-Konnektoren und einer Kanaltiefe von 0,6 oder 0,8 Millimetern gesät. Kultivieren und mitreißen Sie die Zellen. Bereiten Sie gepuffertes Hydrogencarbonat-DMEM-Perfusionsmedium mit niedrigem Glukosegehalt vor und erwärmen Sie es.Schneiden Sie als Nächstes fünf zwei Zentimeter lange Abschnitte aus Silikonschläuchen mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter ab. Schneiden Sie 1,2 Meter, 10 Zentimeter und 30 Zentimeter lange Ethylen-Tetrafluorethylen-Schläuche mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter. Sterilisieren Sie den Schlauch mit 70% Ethanol und spülen Sie den Schlauch mit sterilem PBS.Verwenden Sie den sterilisierten Silikonschlauch, um den 1,2 Meter langen ETFE-Schlauch mit einer sterilen Luer-Buchse und einem sterilen Winkel-Luer-Anschluss zu verbinden. Verwenden Sie diese Baugruppe, um die Perfusionsmediumspritze an einen leeren Luer-Kanal-Objektträger anzuschließen. Ersetzen Sie anschließend das Zellkulturmedium durch vorgewärmtes Perfusionsmedium.Füllen Sie eine sterile 20-Milliliter-Spritze mit vorgewärmtem Perfusionsmedium. Montieren Sie den 10-Zentimeter-ETFE-Schlauch mit Luer-Anschlüssen unter Verwendung des Silikonschlauchs und verbinden Sie den Schlauch mit der Rutsche. Spülen Sie drei bis fünf Milliliter Perfusionsmedium durch den Schlauch und den Kanalschieber.Setzen Sie dann den 30 Zentimeter langen ETFE-Schlauch auf den zellhaltigen Kanalschieber ein. Verbinden Sie das freie Ende des 10-Zentimeter-ETFE-Schlauchs mit dem anderen Ende des Zellkanalschiebers, um das vollständige Perfusionssystem zu bilden. Spülen Sie einen Milliliter Perfusionsmedium durch den Schlauch und die Schieber, um Luftblasen auszuschließen.Transportieren Sie das Perfusionssystem zum Biolumineszenz-Inkubator. Sichern Sie die mit Perfusionsmedium gefüllte Spritze in einer Spritzenpumpe und achten Sie darauf, den Schlauch nicht zu lösen. Spülen Sie mit der Spritzenpumpe einen Milliliter Perfusionsmedium durch das Perfusionssystem.Geben Sie den Spritzendurchmesser an der Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussmenge auf 50 Mikroliter pro Stunde ein. Entscheidend ist, dass es zu Beginn des Experiments keine Blasen im Perfusionssystem gibt, da diese das Biolumineszenzsignal stören können. Starten Sie die Pumpe und schließen Sie sofort die Tür des Biolumineszenz-Inkubators.Befestigen Sie die Türabdeckung, um Licht vom System auszuschließen. Erfassen und analysieren Sie die Daten, wie für statische Gewebekulturen beschrieben. Sechs Platten von PER2 LUC-Fibroblasten wurden unter Verwendung täglicher Temperaturzyklen mitgerissen und mit einem Biolumineszenz-Inkubator abgebildet.Bilder aus ausgewählten Wells wurden analysiert und die Biolumineszenzleistung quantifiziert. PER2 LUC-Zellen wurden auch unter Perfusionsbedingungen abgebildet, um die Auswirkungen eines Casein-Kinase-Inhibitors auf die PER2 LUC-Expression zu bewerten. Die Ergebnisse wurden mit Zellen verglichen, die unter statischen Bedingungen mit der gleichen Konzentration des Inhibitors behandelt wurden, was eine wesentlich größere Periodenverlängerung unter statischen Bedingungen zeigte.Es wurde festgestellt, dass das Ausmaß der Periodenverlängerung unter Perfusionsbedingungen nahe an dem in vivo beobachteten Ausmaß liegt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl statische als auch perfundierte Biolumineszenzexperimente mit einem ALLIGATOR durchführen können.

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Research

Forschung

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Biology

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