Name: 监测果蝇中朊病毒样蛋白聚集物的细胞间传输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 了解利用转基因黑腹果蝇监测朊病毒样蛋白聚集物在活体中枢神经系统中的细胞间传播方法。该技术为研究神经退行性疾病中蛋白质聚集体的扩散机制提供了重要的可视化手段。

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我们感谢Kopito、Luo和Pearce实验室的成员在开发这些方法期间提供的许多有益讨论。我们还感谢Brian Temsamrit对本文手稿的审阅。本研究得到了费城科学大学和W.W. Smith慈善信托基金的资助。

1. 在Drosophila中耦联Gal4与QF介导的Htt转基因表达
<ol>
	<li>收集和/或构建含有组织特异性 Gal4 或 QF “驱动子”的转基因 Drosophila melanogaster 品系，以及构建在 Gal4-UAS38 或 QF-QUAS39 下游含有野生型或突变型 Htt 转基因的品系。确保这些转基因表达的蛋白质与荧光蛋白融合或带有表位标签，以便在同一果蝇中区分突变型和野生型 Htt 转基因产物。参见 图1。 
	​注意：我们通常使用人源 Htt 基因的外显子1片段27。然而，如有需要，也可构建表达更长 Htt 片段或其他基因的转基因果蝇。</li>
	<li>设计遗传策略，使突变型和野生型 Htt 转基因在彼此分离、无重叠的细胞群体中表达。
	<ol>
		<li>若存在任何表达重叠，则在同一细胞中合成的突变型和野生型 Htt 蛋白将共同聚集，从而阻碍朊病毒样事件的检测。为避免此情况，可分别使用 Gal4 和 QF 的特异性抑制因子 Gal80 和 QS40（参见 图1）。选择发育调控的 Gal4 和/或 QF 驱动子有助于将突变型 Htt 的表达限制在终末分化细胞中，从而排除细胞分裂可能对聚集体细胞间传播造成的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在标准培养条件下，交配果蝇以获得子代，使突变型 Htt 通过 QF（或 Gal4）在“供体”细胞群体中表达，而野生型 Htt 通过 Gal4（或 QF）在“受体”细胞群体中表达。参见 图1 中所示可能的遗传组合示意图。 
	注意：用于生成 图1 - 4 数据及我们先前发表研究27 中所用的 QF 和 Gal4 驱动子包括 DA1 嗅觉受体神经元（ORN）驱动子 Or67d-QF 和泛胶质细胞驱动子 repo-Gal4。</li>
	<li>平行构建对照果蝇，使其在 QF 标记和 Gal4 标记的细胞群体中均表达野生型 Htt。</li>
	<li>收集目标基因型的子代，并根据实验需求进行适当龄期培养。</li>
</ol>
<img alt="QF-QUAS 与 Gal4-UAS 系统；示意图；基因表达调控；供体-受体；细胞过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1利用QF-QUAS和Gal4-UAS双元表达系统实现突变型与野生型Htt转基因耦联表达的遗传学方法 在“细胞A”中，利用位于组织特异性启动子A（“P”）下游的QF驱动元件表达一种带有mCherry标签的突变型Htt蛋白，该蛋白包含致病长度的多聚谷氨酰胺序列（Q91）A）。在“细胞B”中，通过由组织特异性启动子B（“PB”）。在 图2-4，Or67d-QF用于在DA1 ORNs中驱动QUAS-HttQ91-mCherry的表达，repo-Gal4用于在所有胶质细胞中表达UAS-HttQ25-YFP27重要的是，HttQ91-mCherry 仅在表达 QF 的细胞中表达，这是由于在转基因上游插入了 QUAS 序列。类似地，HttQ25-YFP 仅通过 Gal4 驱动表达，Gal4 可特异性识别 UAS 序列。如果检测到 QF 与 Gal4 驱动子在组织分布上存在重叠，可在 Gal4 表达细胞中引入编码 QS 的转基因，或在 QF 表达细胞中引入编码 Gal80 的转基因。将荧光蛋白标签分别连接至野生型和突变型 Htt，可在成像过程中区分这两种蛋白，并实现适当供体/受体组合之间的 FRET 检测例如，CFP/YFP 或 YFP/mCherry。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56906/56906fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
2. 成年个体的显微解剖与固定 果蝇 大脑
注意：本解剖步骤经由先前发表的研究44修改而来，可用于制备脑组织样本，以直接成像Htt-荧光蛋白融合蛋白的荧光信号。有关对该步骤进行修改以用于脑组织免疫染色的内容将在下一节中讨论。
<ol>
	<li>收集以下材料并置于冰上：含 0.03% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液（PBS/T）；含以下成分的微量离心管： 970 µL 4%多聚甲醛（PFA）固定液，通过添加制备 200 µL 20% PFA 至 770 µL PBS/T；一个带有孔的透明玻璃培养皿；一支一次性移液管；两把解剖镊子（一把为3号，一把为5号）。</li>
	<li>使用 CO₂ 麻醉成年果蝇2 并将它们转移到冰上的玻璃培养皿的一个孔中。</li>
	<li>使用移液管，加入少量（约 500 µL向含有果蝇的孔以及空白孔中加入冷的 PBS/T，注意避免产生过多气泡，以免干扰解剖操作。</li>
	<li>将玻璃培养皿置于解剖显微镜下方的平坦表面上，调节放大倍数，直至果蝇身体充满视野并清晰对焦。</li>
	<li>将一对鹅颈式光源放置在玻璃培养皿两侧，使光线照射到培养皿的两个侧面。在玻璃培养皿下方垫一张折叠的实验用纸巾，用于在解剖过程中丢弃组织碎片或角质层。</li>
	<li>使用非优势手中的3号镊子，将一只果蝇转移至含有PBS/T的孔中。用镊子夹住果蝇腹部，使其腹面朝上，以固定果蝇。</li>
	<li>用惯用手持5号镊子，在保持果蝇完全浸没于PBS/T中的情况下，移除果蝇头部。将镊子的一侧尖端插入果蝇头部一侧喙旁的小空隙处的表皮下方。通过轻轻夹紧镊子，从两侧夹住复眼以牢固固定头部。</li>
	<li>用镊子将果蝇头部从身体上分离，将两个镊尖分开即可取下头部。将果蝇身体丢弃在附近放置的实验纸巾上。保持主手所持镊子的压力，防止丢失果 inflammable蝇头部。</li>
	<li>用非优势手持3号镊子，将其中一端尖端置于喙另一侧角质层下方的同一微小空间内。定位后，夹紧镊子，使两侧头部相同位置的眼部被夹住。</li>
	<li>一旦钳住角质层稳固后，轻轻将镊子分开 180°此操作可分离头壳而不损伤脑组织。将头壳残余物丢弃在实验用纸巾上。
	<ol>
		<li>尽管理想情况下应一次性完整去除头部角质层，但有时可能无法做到。此时，应逐块去除角质层，直至脑组织完全暴露。操作时需注意避免镊子直接接触脑组织，以防损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过夹住附着的气管或利用毛细作用将脑组织吸入镊子尖端之间的空隙，从 PBS/T 中取出解剖得到的脑组织。 
	注意：气管的移除是可选步骤，因为气管通常不会遮挡我们常规成像所观察的脑前表面的触角叶。然而，如果气管干扰成像，需小心将其移除，避免操作过程中损伤脑组织。</li>
	<li>将果蝇脑转移至预冷的含有固定液的微量离心管中，置于冰上。确保脑组织从镊子上脱落并完全浸没于固定液中。</li>
	<li>所有脑组织解剖完成后，将封闭的管子置于黑暗处室温下，在摇床上进行约5分钟的“短时间固定”。 
	注意：此短暂的固定步骤可确保脑组织在后续操作中更易于处理，且不会黏附在微量离心管管壁上。</li>
	<li>用 P1000 移液器吸除大部分固定液并弃去。
	<ol>
		<li>在此步骤及后续任何洗涤步骤中，均应避免从离心管中吸取脑组织。将P1000移液器调至较低体积（例如, 650 µL）并分两步移除上清液。此外，在吸取过程中，将微量离心管对准光源（例如头顶灯光），以便更清楚地观察脑组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 1 mL 新鲜的 PBS/T 到脑组织中，快速洗涤（&lt; 避光孵育1分钟，吸弃脑组织中的上清液。</li>
	<li>按照以下时间表，在室温避光条件下用 PBS/T 重复洗涤：2 次快速（&lt; 1 分钟洗涤，1 次 5 分钟，3 次每次 20 分钟，以及 1 次 1 小时洗涤。在洗涤间隔期间，将微量离心管盖紧，并将管子置于振荡器上。
	<ol>
		<li>若需进行 DAPI 染色，将最后一次 1 小时洗涤替换为在 PBS/T 中稀释的 250 ng/mL DAPI 孵育 30 分钟（1 次），随后进行 2 次快速洗涤和 1 次 20 分钟洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次洗涤后，移除大部分洗涤缓冲液上清，注意不要扰动脑组织，然后加入 30 µL 加入甘油基抗荧光淬灭剂至脑组织，于 4 °C 在无光且无扰动的条件下静置至少1小时，最长可达24小时。</li>
</ol>
3. 成年大脑免疫染色实验对第2部分的修改
注意：本方案适用于成像非荧光蛋白，或荧光较弱的荧光蛋白融合体。
<ol>
	<li>将 PBS/T 中 Triton X-100 的浓度提高 10 倍（PBS + 0.3% Triton X-100），每一步均使用该溶液。这可确保有足够的去垢剂存在，以通透细胞膜并允许抗体进入细胞内空间。</li>
	<li>在含 4% PFA 的 PBS/T 中室温固定脑组织 20 分钟。</li>
	<li>完成所有洗涤步骤后，将脑组织置于新鲜配制的封闭缓冲液（PBS/T + 5% 正常山羊血清（NGS））中，室温避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>移除并弃去封闭缓冲液。每管加入 0.5 mL 一抗溶液，该溶液通过将一抗适当稀释于新鲜封闭缓冲液中配制而成（常用抗体及其稀释比例见材料表）。将脑组织置于一抗溶液中，在 4 °C 避光条件下于旋转摇床（nutator）上孵育至少 24 小时。</li>
	<li>使用 P1000 移液器移除脑组织中的一抗溶液，并转移至新的离心管中保存。每管加入 1 mL PBS/T 洗涤脑组织。 
	注意：保存的一抗溶液可在 4 °C 下储存长达四周。我们在后续实验中已成功将一抗重复使用达两次。</li>
	<li>用 PBS/T 快速洗涤脑组织（< 1 分钟），吸去上清液并弃去。重复此快速洗涤步骤一次。</li>
	<li>继续在室温下用 1 mL PBS/T 按以下程序进行洗涤：1 次 5 分钟、3 次每次 20 分钟、1 次 1 小时。洗涤过程中确保微型离心管盖紧，并将管子置于旋转摇床上。</li>
	<li>最后一次洗涤后，移除大部分 PBS/T 上清液，每管加入 0.5 mL 二抗溶液，该溶液通过将二抗适当稀释于新鲜封闭缓冲液中配制而成（常用抗体及其稀释比例见材料表）。将脑组织在 4 °C 避光条件下孵育 24 小时。</li>
	<li>二抗孵育结束后，重复步骤 3.5、3.6 和 3.7 的洗涤步骤。</li>
	<li>最终洗涤后，移除大部分洗涤缓冲液，并确保所有脑组织均位于管底。向每管中加入 30 µL 抗荧光淬灭试剂。在 4 °C 避光、无扰动条件下孵育 16–24 小时。</li>
</ol>
4. 全脑样本制备
<ol>
	<li>将一块玻璃载玻片置于解剖显微镜下，并标记识别信息。 
	注意： alternatively，可将脑组织直接固定在盖玻片上，以便在成像过程中获取脑组织的两侧图像。描述该固定方法的实验方案此前已有发表。45.</li>
	<li>使用钝化枪头（用剃刀片切去1 mL枪头底部约1 cm制备而成）从各微量离心管中取出脑组织200 µL 尖端）并将它们转移到载玻片中央。转移脑组织时尽量减少抗荧光淬灭剂的带入量。</li>
	<li>使用镊子将脑组织置于所需的方向（例如，背侧朝向载玻片顶部，腹侧朝上，以便对嗅觉叶进行成像。在定位脑组织时，需考虑后续用于成像的显微镜的光路方向。</li>
	<li>使用折叠的实验纸巾的尖角从载玻片上除去多余的抗荧光淬灭剂，注意不要扰动脑组织。将载玻片置于暗处静置约5-10分钟，使脑组织贴附于载玻片上。</li>
	<li>用四小片碎盖玻片围绕果蝇大脑，分别置于大脑四周，形成一个约 19 mm × 19 mm 的正方形。将一片 22 mm × 22 mm 的 1.5 号盖玻片的一边置于其中一小片盖玻片外侧，然后轻轻放下盖玻片，覆盖在大脑上，完成桥式安装。</li>
	<li>缓慢滴加新鲜的抗荧光淬灭剂，以充满盖玻片下方的表面，注意不要扰动盖玻片或脑组织。使用折叠滤纸的尖角轻轻擦去多余的抗荧光淬灭剂，避免直接接触盖玻片。</li>
	<li>在盖玻片的四个角各加一滴透明快干指甲油，静置约10分钟使其干燥。然后用指甲油密封盖玻片的四边，完全封闭脑组织。</li>
	<li>立即成像大脑，或储存于 4 °C 直到准备好为止。
	<ol>
		<li>若对Htt-荧光蛋白融合体进行内在荧光成像，应在24小时内对脑组织进行成像以获得最佳信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 成像与定量分析聚集物的朊病毒样传播
<ol>
	<li>使用配备40X或60/63X油镜物镜的共聚焦显微镜对封片的脑组织进行成像，采集目标脑区的z轴层扫图像，该区域为所选Gal4和QF驱动系表达的部位图2A，B).
	<ol>
		<li>使用适当的激光激发荧光蛋白融合物或免疫标记的蛋白质（例如，488 nm 用于 GFP/YFP/FITC 或 552 nm 用于 mCherry/Cy3）。使用光谱检测系统或针对每种荧光染料特异的带通/长通发射滤光片，设置检测窗口以捕获最大荧光信号，同时消除通道间的串扰。 
		注意：在对蛋白质聚集体进行成像时需格外谨慎。每个聚集体中心的像素容易发生饱和，尤其是在较大的聚集体中。应尽量减少图像中的饱和现象，但需注意避免因降低信号强度而导致较小聚集体信号丢失的风险。图2B, C, D）。饱和度过高会增加图像背景，使孤立的点状信号更难识别。在获取每组数据的最终图像前，应测试不同的成像参数以优化设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过逐层移动 z 层切片，手动量化各个荧光点来进行数据分析（例如, 图2C 和 图4A）或在将共聚焦切片进行三维重建后（图3A, B). 
	注意：此步骤可在 Image J 或其他图像处理软件中完成。
	<ol>
		<li>如果聚集体分离良好且背景荧光极低，可使用图像分析软件在共聚焦图像序列的三维重建中系统地将聚集体识别为独立的“对象”或“表面”，并对其进行定量与分析图3B). 
		注意：此处描述的软件操作仅针对本实验所用的仪器及软件（参见相关 材料清单).
		<ol>
			<li>在3D视图模式下可视化共聚焦z序列。使用“分析”向导在选定通道中识别单个信号点例如 mCherry标记的HttQ91聚集体的红色通道 图3调整阈值和滤镜，以准确地将图像中所有大小不均一的聚集体表示为独立的物体。</li>
			<li>在“二值化处理预滤波”中启用“分割对象”功能，以分离因软件算法异常合并的紧密关联聚集体。请注意，对象总数及其相关测量值将在“测量”中报告。 
			注意：该突变型Htt聚集体的定量方法不适用于免疫染色方案，因为淀粉样聚集体的核心区域无法被抗体穿透。因此，在显微镜下聚集体呈现为环状结构，图像分析软件难以准确识别和区分这些单独的“斑点”。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过手动浏览z轴层叠图像，对野生型Htt聚集体进行定量计数，并确保同一聚集体若在多个切片中出现时不被重复计数。图4A). 
		注意：当每个共聚焦图像序列中的聚集体数量适中时，可采用此手动定量方法（例如，20-50）。当图像分析软件无法将同一通道中的单个信号点与周围背景信号区分开时，该方法尤为有用（例如，邻近细胞中弥散型野生型Htt的信号）（图2B, C 和 图4A）。对野生型 Htt 聚集物的定量也具有挑战性，因为大脑中的许多正常结构均呈现点状外观（例如，细胞过程和突触）。野生型与突变型 Htt 信号的共定位可作为筛选标准；然而，部分突变型 Htt “种子”可能低于共聚焦显微镜的检测限。在受体细胞中不发生聚集的非 Htt 蛋白（例如，GFP）可用于标记大脑中不相关的点状结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像分析软件对单个聚集体进行进一步表征。例如，确定聚集体的尺寸分布（图3C），突变型与野生型 Htt 蛋白之间的共定位百分比（图 4A），或使用FRET直接测量蛋白质-蛋白质相互作用（图4B).
	<ol>
		<li>使用能够准确识别特定通道中所有可见聚集体的斑点或表面检测算法，确定各个斑点的尺寸分布。利用图像分析软件对斑点或表面进行相关测量，例如从第5.2.1步所述软件“分析”向导中的“测量”功能获取“聚集体直径”（图3C）、“体积”或“强度”等信息。 
		注意：在 图3C我们报告了在单个DA1嗅小球中鉴定出的所有HttQ91-mCherry斑点的直径分布。</li>
		<li>通过逐层手动浏览共聚焦显微镜z轴堆栈图像（最准确的方法），确定HttQ25-YFP与HttQ91-mCherry聚集体之间的共定位百分比。但需注意避免重复计数任何聚集体。为防止重复计数，仅当聚焦平面穿过聚集体中心时，才在特定的z切片中计数该聚集体图4A).</li>
		<li>使用受体光漂白法计算共定位的 HttQ91-mCherry 信号对诱导形成的 HttQ25-YFP 聚集体的 FRET 效率。
		<ol>
			<li>首先，通过为仅表达mCherry和仅表达YFP的信号设置检测窗口，消除YFP与mCherry通道之间可能存在的串扰，确保在另一通道中不产生信号。使用这些设置，采集单个HttQ25-YFP斑点及其相应HttQ91-mCherry信号的“前处理图像” 图4B).</li>
			<li>然后，通过调节红色激光来漂白mCherry信号（例如，552 nm）调至100%强度并扫描直至信号消失。恢复至“前图像”所用设置，对同一荧光点采集“后图像”。图4B).</li>
			<li>使用图像分析软件计算每个点状结构在光漂白前后的荧光强度测量值。</li>
			<li>通过从“前图像”中测得的YFP供体荧光（YFP初始）来自“后图像”中YFP供体荧光的YFP最终）。将该值除以 YFP最终，再乘以100。 
			注意：FRET 效率可针对每个 HttQ25-YFP 聚集体进行逐像素或整体计算（图4B）。当每个 HttQ25-YFP 斑点相关的 mCherry 信号足够强，可在 mCherry 光漂白后产生可检测的 YFP 去淬灭时，受体光漂白是一种特别适用于计算 FRET 效率的技术。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着神经退行性疾病患者人数持续增加，迫切需要加深对这些疾病分子发病机制的理解，以开发更有效的治疗方法。本文描述了在模式生物中监测致病性蛋白质聚集体在不同细胞类型之间类朊病毒传播的方法， 黑腹果蝇我们最近利用该方法证明了突变型Htt聚集体的朊病毒样传播 体内 并鉴定介导这些聚集体从神经元向胶质细胞传播的吞噬受体27我们的方法利用了使用中的若干优势 黑腹果蝇 研究人类遗传性疾病：其生命周期短且拥有丰富的遗传工具集，可加速发现具有治疗相关性的基础生物学信息。
本文所述方法相较于其他现有的动物和细胞培养模型在研究朊病毒样传播方面具有两大优势：（1）聚集性致病因子（例如，突变型 Htt）由完整组织中的细胞产生；（2）在另一群独立的细胞中表达同一蛋白的正常折叠形式（例如，野生型 Htt），可作为易于检测的&#34;报告系统&#34;，用于监测朊病毒样事件。我们利用在Drosophila40中已...

朊病毒假说认为，导致可传播性海绵状脑病（例如，人类的克雅氏病、羊的痒病、鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病，以及牛的&#34;疯牛病&#34;）的感染因子仅由蛋白质构成，不含核酸1。在朊病毒疾病中，细胞型朊病毒蛋白（PrPC）会转变为一种非天然的、稳定的构象（PrPSc），该构象富含β折叠，能够通过转化并招募单体形式的PrPC分子，形成稳定的淀粉样蛋白聚集体，从而实现自我复制。PrPSc聚集体利用这种自我复制机制在机体内的不同细胞间传播，甚至可在不同个体之间传播2。
蛋白质错误折叠和聚集也是大多数神经退行性疾病（阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））的核心特征3。这些疾病中细胞内或细胞外聚集蛋白复合物的形成与细胞毒性密切相关4，并随着时间推移在脑内沿高度可重复且疾病特异性的路径进展5,6。这些扩散模式提示，与这些疾病相关的致病性聚集物具有类朊病毒特性。目前已有充分证据支持与AD、PD、HD和ALS相关的聚集物存在类朊病毒样传播机制——它们可在细胞间传播，并在先前未受影响的细胞中诱导相同蛋白质单体形式发生构象改变7,8。
迄今为止，大多数研究蛋白质聚集体类朊病毒样扩散的研究均采用哺乳动物细胞培养模型，在这些模型中，聚集体从细胞外空间或其他细胞的细胞质转移至 naive 细胞的细胞质中9,10,11,12,13,14,15，或通过将含有聚集体的材料注射到小鼠脑内，并监测注射部位以外区域聚集体的出现情况16,17,18,19,20,21,22,23最近，转基因动物已被用于证明细胞内聚集体可在完整大脑内传播至其他细胞24,25,26,27,28,29,30. 此处，我们描述一种在完整脑组织中直接可视化单个细胞间聚集体转移的方法 黑腹果蝇. 黑腹果蝇 亨廷顿病/多聚谷氨酰胺（polyQ）疾病模型最早于近二十年前建立31,32 并为这些疾病的致病机制提供了许多宝贵的见解33亨廷顿病（HD）是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由编码亨廷顿蛋白（huntingtin, Htt）的基因发生突变所致。34该突变导致亨廷顿蛋白（Htt）N端附近的多聚谷氨酰胺（polyQ）序列扩张，超过约37个谷氨酰胺的致病阈值，从而引起蛋白错误折叠并聚集35,36. 含有野生型 Htt 蛋白的 &#60;这段中的37个谷氨酰胺可达到其天然折叠构象，但在与亨廷顿蛋白（Htt）聚集体直接物理接触时可被诱导发生聚集 &#34;种子&#34;12,27,37我们利用野生型Htt的同型成核聚集现象，作为检测突变型Htt聚集体从其他细胞发生类朊病毒转移并进入胞质的读出指标。
确定朊病毒样聚集体在细胞间传播的机制，有助于为目前无法治愈的神经退行性疾病发现新的治疗靶点。我们利用了生命周期短、操作简便且遗传背景清晰的模式生物 黑腹果蝇 以定义突变型Htt聚集体在细胞间传播的分子机制。我们的实验策略采用两种可在 果蝇成熟的Gal4特异性上游激活序列（Gal4-UAS）系统38 以及近期开发的 QF-QUAS 系统39将这两个独立系统结合使用，可实现在线虫体内同一组织中将突变型和野生型 Htt 转基因的表达限制于不同的细胞群体40采用该方法，我们通过监测细胞质中野生型Htt从其正常的弥散可溶状态重新分布为聚集状态，来研究突变型Htt的类朊病毒样传播，这种聚集是野生型Htt与预先形成的突变型Htt聚集体发生物理接触后的直接结果 &#34;种子&#34; 通过使用报告蛋白质-蛋白质相互作用的生物化学或生物物理技术（如荧光共振能量转移，FRET），可以证实突变型Htt对野生型Htt的转化9,27,41.
重要的是，我们还可以使用大量遗传学工具 果蝇 以鉴定介导蛋白质聚集体类朊病毒样扩散的基因和/或信号通路。我们近期利用该方法揭示了细胞表面清道夫受体 Draper 在其中的关键作用42,43，将突变型Htt聚集体从神经元轴突转移至邻近的吞噬性胶质细胞 果蝇 中枢神经系统（CNS）27因此，我们在此描述的基于遗传学和成像的技术方法能够揭示与疾病相关现象的重要基础生物学信息，所用模式生物虽操作简便但功能强大， 果蝇.

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10X，pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>稀释至1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS），过滤</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>收到后分装并冷冻保存</td></tr><tr><td>鸡抗-GFP 抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>兔抗-DsRed 抗体</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>使用稀释比例为1:2000；可识别基于DsRed的荧光蛋白（例如 mCherry、mStrawberry、tdTomato 等）</td></tr><tr><td>小鼠抗-Bruchpilot 抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>使用稀释比例为1:100；可标记果蝇大脑中所有活跃的突触前结构</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗鸡IgG抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>使用稀释比例为1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 标记的抗兔IgG抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>使用稀释比例为1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠IgG抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>使用稀释比例为1:250</td></tr><tr><td>Slowfade Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 22 mm）</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 生物级镊子，型号 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>用于非优势手</td></tr><tr><td>Dumont 生物级镊子，型号 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>用于优势手</td></tr><tr><td>LAS X 图像分析软件</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 图像分析软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

监测朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传播 黑腹果蝇

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

蛋白质聚集是大多数神经退行性疾病的核心特征，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在这些疾病中，蛋白质聚集体与神经病理学密切相关，尽管异常蛋白质聚集破坏正常细胞稳态的确切机制尚不清楚。新兴数据为以下假说提供了有力支持：AD、PD、HD 和 ALS 中的致病性聚集体在许多方面与朊病毒相似，朊病毒是一类仅由蛋白质构成的传染性因子，可引发可传播性海绵状脑病。朊病毒通过模板化诱导天然折叠状态的同种蛋白质发生构象转变而实现自我复制，从而导致聚集表型的扩散。目前，关于朊病毒以及 AD、PD、HD 和 ALS 中朊病毒样蛋白如何在细胞间传播的问题正处于深入研究之中。此处，一个 黑腹果蝇 描述了一种可用于监测与亨廷顿病（HD）相关的突变型亨廷顿蛋白（Htt）聚集体以类朊病毒方式在细胞间传播的模型。该模型利用了多种强大的工具，可对转基因表达进行有效调控 黑腹果蝇 组织，并利用荧光标记的细胞质蛋白直接报告突变型Htt聚集体的朊病毒样转移。重要的是，本文所述方法可用于鉴定介导不同细胞类型间蛋白聚集体扩散的新型基因与通路 体内这些研究获得的信息将拓展对神经退行性疾病潜在致病机制的有限认知，并揭示新的治疗干预机会。

此处描述的方法可产生可靠的数据，证明在完整的果蝇中枢神经系统中，Htt蛋白聚集体能够以类朊病毒方式从一个细胞群体转移到另一个细胞群体。当供体嗅觉受体神经元（ORNs）表达HttQ91-mCherry时，受体胶质细胞中野生型Htt蛋白会由弥散状态转变为点状聚集，这一转化可通过该YFP融合蛋白的直接荧光观察到。图2A-C 和 图4A，B）。准确报告这两种细胞群之间类朊病毒样的转移事件，需要仔细选择转基因果蝇品系及Gal4/QF驱动系统，以在发育期及成体阶段实现突变型和野生型Htt转基因的高水平表达，同时避免表达区域的重叠。此外，对荧光蛋白-Htt融合转基因的合理设计可支持强大的下游分析。例如，突变型和野生型Htt聚集体可作为点状结构通过人工方式定量分析（图2C 和 <strong class="xf...

越来越多的证据表明，与神经退行性疾病相关的致病性蛋白质聚集体具有类似朊病毒的特性，可在细胞间传播。本文介绍了一种可在模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中可视化此类朊病毒样聚集体在细胞间扩散的方法。

蛋白质聚集是大多数神经退行性疾病的核心特征，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、……

本实验的总体目标是体内监测蛋白质聚集体的朊病毒样扩散。利用转基因果蝇，在其特定分离的细胞群中表达一种易于聚集的蛋白质及其可溶性形式。该方法有助于回答细胞生物学和神经退行性疾病领域中的一些关键问题，例如蛋白质聚集体或其他物质在脑内细胞间如何传递。该技术的主要优势在于，能够在完整的中枢神经系统中对蛋白质聚集体从一个细胞部位向另一个细胞部位的扩散进行成像。该技术的应用前景涵盖亨廷顿病及其他类朊病毒性神经退行性疾病的治疗，因为聚集体的扩散似乎是这些致命性疾病进展的共同机制。在标准培养条件下，构建含有组织特异性Gal4或QF驱动元件的转基因黑腹果蝇（drosophila melanogaster）品系，以及构建在Gal4-UAS或QF-QUAS下游含有野生型或突变型亨廷顿蛋白（huntingtin）转基因的品系。收集目标基因型的子代，并饲养至适合解剖的龄期。为准备脑解剖，收集所需的溶液，并将其与玻璃多孔培养皿、移液器吸头以及一对镊子一同置于冰上预冷。接着，用二氧化碳麻醉成年果蝇，并将其转移至玻璃培养皿的一个孔中。然后，向盛有果蝇的孔以及相邻的一个孔中各加入约0.5 mL的PBST溶液。接下来，在解剖显微镜下，使用蛇形灯从两侧照亮单只果蝇。然后在培养皿下方放置一张折叠的纸巾，用于清洁解剖工具。现在，用非优势手持3号镊子，将一只果蝇转移至含有PBST的孔中。用5号镊子夹住果蝇腹部，使腹面朝上并完全浸入溶液中以固定果蝇。接着，将镊子的一侧尖端插入喙附近表皮下的微小空隙中。然后从两侧轻轻夹紧复眼以固定头部，再将镊子向两侧拉开，使头部脱离。将果蝇身体弃置于折叠的纸巾上，同时保持头部浸没在PBST中。接着，将3号镊子的一个齿插入喙另一侧的相同位置，轻轻撕开头部几丁质外壳以暴露脑组织。操作前，将残留的几丁质碎片丢弃在实验用纸巾上。去除角质层时，应避免镊子直接接触脑组织，以免造成损伤。现在，通过夹住附着的气管或利用毛细作用将脑组织吸入镊子尖端之间的空隙，从PBST中取出已解剖的脑组织。随后，将果蝇脑转移至含有固定液并置于冰上的微量离心管中。仔细观察，注意大脑是否从镊子上松脱。待所有大脑组织解剖完成后，将收集管转移至室温下的旋转混合仪（nutator）中，并旋转约五分钟。固定结束后，使用 P1000 移液器吸除大部分固定液并弃去，操作时需格外小心，确保大脑组织保留在管内。这需要轻柔地进行抽吸并仔细观察。接着，向脑组织中加入一毫升新鲜的PBST。盖上管盖，置于摇床上轻轻摇动约一分钟，以洗去残留的固定剂。然后吸除溶液，重复此短暂清洗步骤。在两次短暂清洗后，进行一次五分钟的清洗，接着进行三次二十分钟的清洗，最后进行一次一小时的清洗。最后一次清洗后，小心吸除大部分PBST，将脑组织浸入30微升基于甘油的抗荧光淬灭试剂中。然后将脑组织置于4°C避光条件下静置孵育1至24小时。随后使用钝头移液器吸

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监测果蝇中朊病毒样蛋白聚集物的细胞间传输

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微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

了解利用转基因黑腹果蝇监测朊病毒样蛋白聚集物在活体中枢神经系统中的细胞间传播方法。该技术为研究神经退行性疾病中蛋白质聚集体的扩散机制提供了重要的可视化手段。

监测朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传播黑腹果蝇

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