Name: Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin farelerde kan-beyin bariyeri geçirgenliğini floresan izleyicilerle değerlendirme yöntemini. Bu basit ve nicel teknik, inme ve Alzheimer gibi nörolojik hastalıklarda tedavi etkinliğini araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu eser desteklemek için Leduq Vakfı tarafından finanse edilen Sphingonet Konsorsiyumu kabul etmek istiyorum. Bu eser de "vasküler farklılaşma ve modelleme" ortak araştırma merkezi tarafından desteklenmiştir (CRC / Transregio23, proje C1) ve 7. FP, COFUND, Goethe uluslararası doktora sonrası programı GO-inç, No 291776 finansman. Daha fazla Kathleen Sommer fareler ile onun teknik yardım için işleme ve Genotipleme anıyoruz.

Tüm hayvanların son derece dikkatli ağrı veya rahatsızlık işlem sırasında en aza indirerek ele. Bu yordam kuruluşumuzun hayvan bakımı kuralları izler ve yerel Komitesi (Regierungspraesidium Darmstadt, onay numarası FK/1044) tarafından onaylanmış.
Vivo geçirgenliği tahlil farelerde için iş adımları şematik Resim 1' de gösterilen. Her adımı ayrıntılarını aşağıda açıklanmıştır.
1. hayvan taşıma
<ol><li>
Hazırlık ve izleyiciler ve anestezi yönetimi
	<ol>
<li>En az bir gün önce geçirgenliği tahlil katıştırma doku etiketli tüpler ve kalıpları hazırlamak. Temiz duman başlık altında çalışan ve % 80 etanol ile temizlenmiş araçları kullanarak protokol steril koşullarını korumak. 3-6 ay için geçerli protokol Olgun Yetişkin yaş grubunda erkek veya kadın vahşi-türü (WT) veya angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) CD1 fare kullanın. 10daha önce açıklandığı gibi farelerin Genotipleme gerçekleştirin. Not: % 80 alkol steril aletlerin oluşturmayacaktır ancak kirlenme hazırlanan numunelerin en aza indirmek olacaktır.</li>
		<li>Steril PBS tüm izleyiciler 2 mM stokları sulandırmak ve ışık-20 ° C'de korunan aliquots depolayın</li>
		<li>Tarayıcıları (Tetramethyl rodamine) TMR gibi seçin ve (floresein isothiocyanate) FITC ayrı uyarma/emisyon spectra ve çoğu lizin her iki tarafından Floresans mikroskobu boyalar arasında en az girişime sonuçlanan tamir edilebilir (TMR kullanarak veya FITC sırasıyla filtre) ve fluorometry geçirgenliği tahlil için bir plaka okuyucu tarafından. Not: TMR dextran 3 kD ve FITC dextran 3 kD çalışmada kullanılan her iki lizin tamir edilebilir olduğunu ve dolayısıyla da immunohistokimyasal analiz sonrası fiksasyon ile aldehitler için bölgesel farklılıklar araştırmak amacıyla kullanılabilir.</li>
		<li>Tüm hayvanların son derece dikkatli Kurulusları yönergeleri izleyerek başa. İntraperitoneally her fare her izleyici 100 µL bir 1:1 karışımı10,13' te kullanarak ek bir izleyici birleştirildiğinde bu kadar 200 µL artırılabilir 100 µL izleme çözümü ile enjekte et. PBS autofluorescence arka plan çıkarma için sahte denetimi olarak hizmet etmek için izleyiciler yerine tek başına en az bir hayvan enjekte.</li>
		<li>5 dakika sonra izleyici enjeksiyon, ketamin ve Xylazine bir IP enjeksiyon hayvanla anestezi (5-10 mg ve 100 mg % 0,9 kg vücut başına Saline ağırlık sırasıyla, kokteyl 25 g fare başına 150 µL). Not: hayvan anestezi ve perfüzyon/kurban arasındaki dönemi kısa olduğu gibi veteriner merhem gözünü işlem sırasında uygulanmadı nerede herhangi bir gözünde kurutma değildi (10 dakika) görülmektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kan toplama ve kardiyak perfüzyon
	<ol>
<li>Hayvanlar kalp perfüzyon 10 dk sonra anestezik Yönetim için hazır olun. Pençe seğirme yanıt yokluğu hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı emin olmak için kontrol edin.</li>
		<li>Hayvanlar onların sırt üstü yatıyordu ve % 80 etanol karın bölgesinde cilt üzerinde uygulayın. Küçük makas kullanırken, karın duvarı göğüs kafesinin hemen altında küçük bir insizyon attım (2 cm) ile açın. Karaciğer diyaframdan ayırın ve sonra yavaş yavaş plevral boşluğu 15açığa diyafram ile kesti.</li>
		<li>Bilateral göğüs kafesi kesme ve kesme göğüs kemiğinin sol ventrikül göstermek düzeltmek. Peristaltik perfüzyon sistemi için sol ventrikül arka içinde bağlı 21'lik kelebek iğne yerleştirin.</li>
		<li>Sağ atrium ponksiyon ve hızlı bir şekilde (içinde 10 s) 1 mL pipet İpuçları (ile son kesme) kullanarak göğüs boşluğu içine serbest kan 200-300 µL serum koleksiyonu tüplerde toplamak ve buza saklayın. Not: Bu perfüzyon hayatta olmayan bir yöntemdir.</li>
		<li>En kısa zamanda kan toplanır, perfüzyon sistemi (10-12 d/d, 5 mL/dk) geçin ve hayvan 3 dk sıcak (RT) 1 x PBS ile sıvı (Ca'nın ücretsiz2 + /Mg2 + iyonları). Not: PBS içeren Ca2 +/Mg2 + iyonları perfüzyon sırasında daha iyi kalp etkinlik için yararlı olabilir. Toplam perfüzyon için kullanılan PBS 15-20 mL aralığında miktarıdır.</li>
		<li>Perfüzyon kalite karaciğer, rengini işaret ederek değerlendirmek böbreğin perfüzyon sonra beyaz/soluk görünür. Not: Böbrek veya karaciğer perfüzyon değil mutlaka bir belirtisi olarak arterler (karotis/vertebra) aort beyinden adım 3 hazırlık Atriyal ponksiyon sırasında özellikle sırasında yırtıldı ulaşan beyin perfüzyon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku işleme
<ol><li>Organ toplama ve depolama
	<ol>
<li>Perfüzyon sonunda, servikal çıkması ve hasat beyin ve böbrekler hayvanın ölümü onaylayın. Beyin perfüzyon perfüzyon kalitesi iyi değil zaman hayvanlar geçirgenliği çözümleme dışı bırakmak böylece beyin (görünür kan damarlarının meninkslerde), renk tarafından doğrulayın. Beyin 2 hemibrains bir neşter (şekil 1) kullanarak ayırın.</li>
		<li>Bir neşter bir hemibrain ile olfaktör loblar ve beyincik ücretsiz teşrih ve hemicerebrum 2 mL tüp aktarın. Hemi-beyincik serebellar geçirgenliği değerlendirmesi için gerekli ek bir tüp içinde saklayabilirsiniz.</li>
		<li>Bir tek böbrek için başka bir 2-mL tüp aktarın. Örnekleri hemen kuru buza saklayın.</li>
		<li>Yerel olarak kalan böbrek ve hemi-beyin (beyincik ve olfaktör loblar oluşan) doku-tek en iyi kesim ısı (O.C.T) kuru buza bileşik katıştırın.</li>
		<li>Sonunda, 10, 000 g, 4 ° C'de 10 dakika buz serum koleksiyonu tüpler içinde depolanan kan örnekleri santrifüj kapasitesi Serum supernatants 1,5 mL tüpler için aktarmak ve onları kuru buz kapsayıcısına getirin.</li>
		<li>Kuru buzun-80 ° C dondurucu için daha fazla alay kadar toplanan tüm örneklerini aktarın. Not: Çözülme donma gibi örnekleri homojenizasyon verimliliği artar sonra olarak homojenizasyon adımlara geçmeden önce dondurmak önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Homojenizasyon ve Santrifüjü
	<ol>
<li>Aşağı-80 ° C'de dondurulmuş hemi-cerebrum ve böbrek örnekleri buz çözme ve organları içeren tüpler tartın. Bu ağırlıklar doku kilo almak için birkaç boş tüpler (20) ortalama değerini çıkarın. 300 µL ve soğuk 1 200 µL eklemek X PBS böbrek ve hemi-cerebrum, sırasıyla içeren tüpler için. Not: doku (100 mg altında hemi-beyincik gibi) daha düşük miktarlarda için bireysel tüpler ağırlığında tavsiye edilir.</li>
		<li>Yaklaşık 15 vuruş gerçekleştirerek bir elektrik havai karıştırıcı (1, 000 rpm) için bağlı bir politetrafloroetilin (PTFE) havaneli ile orijinal eppendorf tüp her örnekte homojenize (1 vuruş = 1 ve 1 aşağı). PBS ile havaneli örnekleri arasında durulama ve sonraki örnek geçmeden önce kuru silin. Not: Deterjanlar homojenizasyon sırasında kullanımı ile fluorometry olası girişim nedeniyle kaçınılması. Ancak, doku iyice bir yuvarlak donma sonra çözdürme daha verimli olduğu homojenize gibi hücre içi izleyici de bu protokol için algılandı.</li>
		<li>Homojenize örnekleri ışık ve santrifüj 15.000 g, 20 dk, Masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de sonunda hep birlikte korunuyorsunuz buz mağaza. Supernatants yeni bir 1,5 mL tüpler için hemen fluorometry ya da daha sonra çözümlenecek-80 ° C'de buzda aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresans ölçüm ve miktar
	<ol>
<li>Önceki adım sonunda donmuş, buzda-80 ˚C ışık folyo ile onları korumak, saklanan doku süpernatant ve serum örnekleri çözülme.</li>
		<li>Seyreltik serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) ya da (as) doku supernatants 50 µL 384-şey siyah bir tabak pipet. Bu doku homogenate arka plan normalde PBS eritici kullanılan daha yüksek olduğu gibi sahte hayvan uygun arka plan çıkarma, emin olmak serum ve doku supernatants için en az bir örnek içerir. Not: sahte autofluorescence değerleri (veri gösterilmez) çok az bir değişkenlik gözlendi rağmen ortalama 3 sham hayvanların autofluorescence için kullanılabilir. PBS, ayrıca gürültü oranı sinyal örnekleri için beyin örnekleri gibi düşük floresan ile artırabilir ile sulandrarak kullanılan serum miktarı azaltılabilir. Upto 10 µL serum ile 40 µL PBS sulandrarak test edildi. Hava kabarcığı yok wells bulunduğundan emin olun.</li>
		<li>384-şey siyah plaka plaka okuyucuya yerleştirin ve floresan ölçüm seçerek yeni bir komut dosyası açın.</li>
		<li>Kazanç için en iyi ayarlayın ve 550/580 veya 490/520 uyarma/emisyon (nm) değerleri sırasıyla TMR veya FITC dyee için kullanın ve ham Floresans birimleri (RFUs) elde etmek için ölçüm başlatın.</li>
		<li>Ham Floresans birimleri (RFUs) plaka okuyucu geçirgenliği dizin (PI) karşılık gelen sahte değerlerini çıkarılarak sonra hesaplamak için kullanın.<ol>
<li>
* Geçirgenliği dizin (mL/g) = (Doku RFUs/g doku ağırlık) / (Serum RFUs/mL serum)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnek hesaplama beyin geçirgenliği dizin (PI) için hayvan GOF1 (Tablo 1):<ol>
<li>GOF1 beyin RFUs - SHAM beyin RFUs 154-22,5 = 131.5 =</li>
			<li>GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs 38305-27 = 38278 =</li>
			<li>Beyin ağırlığı (g) 0.195 =</li>
			<li>Serum hacmi (ml) 0,02 =</li>
			<li>Beyin geçirgenliği dizin (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) 0.352 = Not: Mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir değerler geçirgenliği dizin hesaplamalar verim. Bunlar ancak 2 grup 12arasında karşılaştırma kolaylığı için oranları olarak sunulabilir. Bu her iki grupta her hayvan PI 1 henüz kontrol grubunda Inter hayvan varyasyon tutmak ile kontrol grubu ortalama sürüş kontrol grubunun ortalama PI ile bölerek elde edilebilir. Bu dönüşüm kontrol grubu 1'e ayarlayın göre deney grubu (veya grup) için değerler sağlar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ayirt görsel izleyici olarak
	<ol>
<li>Yerli bir cryostat ilgili bölümlerde-20 ° C ayarla ve oda sıcaklığında yerleştirilen slaytlara bölümleri transfer 10 µm içine doku-tek bileşik (O.C.T) (Adım 2.1) gömülü böbrek/hemi-beyin blok kesme. Bir kez bölümleri (yaklaşık 30 dk) kurutulur, slaytlar kadar kullanmak-80 ° C buzluğa aktarın.</li>
		<li>Gününde, boyama slaytlar için 10 dk. 37 ° C'de erimek ve bölümleri için PBS hızlı yıkama ardından oda sıcaklığında 10 dk %4 paraformaladehyde (PFA) ile düzeltin.</li>
		<li>Permeabilization/engelleme arabellek % 1 BSA ve oda sıcaklığında 1 h için % 0,5 Triton X-100 pH 7.5 içeren steril PBS yapılmış bölümlerde kuluçkaya.</li>
		<li>Slaytlar, oda sıcaklığında CD31 birincil antikor ile 1,5 saat için kuluçkaya (0,5 mg/ml, MEC 13,3 klonu), 1: 100 steril PBS, % 0.5 BSA, %0.25 içeren arabellekte PBS üç 5 dk yıkar ardından Triton X-100 (pH 7.2) seyreltilmiş.</li>
		<li>İkincil antikor kuluçka species-specific ile oda sıcaklığında 1 h için yukarıdaki arabellek fluorescently antikorlar seyreltilmiş 1:500 (2 mg/mL) etiketli gerçekleştirin. CD31 için keçi Anti-sıçan Alexa 568 veya Alexa 488 1:500 bir seyreltme kullanılabilir. DAPI içerir (300 µM) ikincil antikor (1:1, 000 seyreltme stoktan) çekirdeği için leke karıştırın.</li>
		<li>Aqua polymount lekeli bölümlerle dağ ve gece karanlıkta oda sıcaklığında polimerizasyon için bırakın.</li>
		<li>Spektral görüntüleme confocal lazer mikroskop sistem tarama kullanarak görüntüleri elde etmek. Görüntüleri NIS elements yazılımı (version 4.3) tarafından analiz. Yazılım Photoshop gibi montaj şekiller oluşturmak için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16371949">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26590417">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier%3A+differential+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li>
<li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface%3A+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efflux+of+amyloid-%CE%B2+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li>
<li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li>
<li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li>
<li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li>
<li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li>
<li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+%28FITC%29-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption%3A+Technical+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+stroke+research%22%5BJournal%5D)">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+roles+of+cyclooxygenase%2C+oxidative+stress%2C+neuroinflammation%2C+and+elements+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).</li>
<li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li>
<li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-67899-1_5">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li>
<li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/22/1_Supplement/734.1.short">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li>
<li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li>
<li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li>
<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Kan - beyin bariyerini disfonksiyon birincil ve ikincil Beyin Tümörleri veya felç gibi nörolojik bozukluklar, bir dizi ile ilişkilidir. BBB arıza kez hayati CNS ödem ile ilişkilidir. Bu nedenle açılış tetik moleküler mekanizmaları aydınlatma veya BBB kapatılması tedavi önemini nörolojik bozukluklar ve yaygın araştırmacılar tarafından araştırıldı. Ancak, yöntemleri araştırmak için BBB geçirgenliği vivo literatürde bildirilen Floresans görüntüleri17,18 sık...

Mikrovasküler endotel hücreleri (ECs) Bazal lamina ensheathed olan yakından ilişkili perisitlerden (PCs) ve sonunda ayakları1 ile membran örtmek astrocytes (ACs) tarafından desteklenen, kan - beyin bariyerini (BBB) oluşur ,2. ECs destekleyen ve bariyer fonksiyonu, öncelikle ACs ve PC'ler, düzenleyen birkaç hücre tipleri ile etkileşim ve aynı zamanda sinir hücreleri ve microglia, Bütün bunlar birlikte form nörovasküler birimi (NVU). NVU kan yoluyla toksinlerin ve patojenler beyin girmesini sınırlayan BBB, işlev için önemlidir. Bu işlev mevcut ve taşıyıcılar gibi p-glikoprotein (P-gp) bu sızma endotel girin molekülleri içine geri eylem nedeniyle ECs arasında sıkı kavşak molekülleri claudin-5, occludin, zonula occludens-1, gibi bir sonucudur gemi Lümen1,2,3. BBB ancak besin (glikoz, demir, amino asitler) gibi temel moleküllerin taşıması için özel taşıyıcılar üzerinde EC plazma membran1,2,3ifade tarafından sağlar. EC katman son derece çeşitli taşıyıcılar luminal (kan bakan) ve özel ve vektörel taşıma fonksiyonu4için,5 izin vermek için abluminal (beyin bakan membranlar) arasındaki dağılımı açısından polarize . BBB sıkıca CNS çevre düzenlenmesi ile ilgili koruyucu olmakla birlikte, CNS ilaç dağıtım fonksiyonel BBB ile Parkinson gibi hastalıklarda için büyük bir sorun olduğunu. BBB disfonksiyonu olan nörolojik hastalıklar bile, özellikle bariyer disfonksiyonu örneğin Alzheimer hastalığı (Ah) gibi belirli ışınlama hedefleri zarar dahil olabilir gibi beyin ilaç dağıtım arttığını kabul edemiyor. Yılında, birkaç amiloid beta taşıyıcılar LRP1, öfke, P-gp gibi dysregulated olduğu bilinmektedir ve bu nedenle bu taşıyıcılar hedefleme beyhude6,7,8olabilir. BBB inme, reklam, menenjit, multipl skleroz ve Beyin Tümörleri9,10,11' gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda bozulmuş. Bariyer fonksiyonu geri tedavi stratejisinin önemli bir parçasıdır ve böylece onun değerlendirmesi önemlidir.
Bu çalışmada, objektif ve biz başarılı bir şekilde her iki transgenik ve deneysel hastalık modelleri10,12,13 birkaç fare satırlarına uygulanır Rodents geçirgenliği tahlil için nicel protokolü bir tarif var ,14. Yöntem izleyiciler damar yuvası kaldırmak için floresan izleyiciler tarafından farelerin perfüzyon takip basit bir mayi iğne temel alır. Beyin ve diğer organlara toplanan yazı perfüzyon ve nesne tarafından değerlendirildi geçirgenliği ve doku homogenates bir plaka okuyucu Floresans ölçümleri dayalı mutlak geçirgenliği dizin vardır. Tüm ham Floresans değerleri doku homogenates veya herhangi bir izleyici almazsınız sham hayvanlardan serum kullanarak arka plan için düzeltilir. Geniş normalizations serum cilt, serum Floresans ve böylece mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir geçirgenliği dizin oluşturan dokular, ağırlığı dahil edilir. Biz daha önce12gerçekleştirilen vardı gibi gruplar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için mutlak geçirgenliği dizin değerlerini kolayca oranları dönüştürülebilir. Aynı anda, saklı hemi-beyin ve böbrek Floresans mikroskobu10tarafından izleyici görselleştirme için yararlanılabilir. Klasik Floresans mikroskobu geçirgenliği bölgesel farklılığı hantal olsa doku bölümü ve yarı kantitatif analiz için görüntü öznel seçim nedeniyle elde etmek önemli olabilir. Ayrıntılı adımlar iletişim kuralında sunulmaktadır ve notlar uygun olan yerlerde eklenir. Bu başarıyla diğer küçük hayvanlar için ölçeklendirilebilir farelerde vivo içinde geçirgenliği tahlil gerçekleştirmek için gerekli bilgileri sağlar. Tahlil tarayıcıları birçok türde uygulanabilir şarj ve boyutu için izin alarak geçirgenliği değerlendirme tarayıcıları farklı floresan spectra ile kombinasyonu tarafından.

<table><tbody><tr><td>Tetrametil Rhodamine (TMR) dekstran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat (FITC) dekstran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.9 Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Doku-tek OCT bileşiği</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>%37 Formaldhehit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>% 4'lük bir çözelti hazırlayın</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini, fraksiyon V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>sıçan anti CD31 antikoru, klon MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti sıçan alexa 568</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti sıçan alexa 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Problar</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21 gauge kelebek iğne</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>serum toplama tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2 mL eppendorf tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech hassas mendil mendil silecekleri</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyulu siyah plaka</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slaytlar superfrost plus</td><td>Termobilimsel</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE havaneli</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>elektrikli üstten karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>plaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spektral Görüntüleme konfokal lazer tarama mikroskobu sistemi</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltik perfüzyon sistemi</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Kan - beyin bariyerini (BBB) toksinler ve patojenler dolaşımda beyin microenvironment karşı korur ve beyin homeostazı tutar özel bir engeldir. Asıl bariyer sıkı hücreler arası kavşaklar ve plazma membran üzerinde ifade sızma taşıyıcılar bariyer fonksiyonu sonuçları beyin kapiller endotel hücreleri sitelerdir. Bu işlev perisitlerden ve birlikte nörovasküler birimi (NVU) formu astrocytes tarafından düzenlenmiştir. Felç, Alzheimer hastalığı (Ah), gibi çeşitli nörolojik hastalıklar Beyin Tümörleri bir Engelli BBB işlevi ile ilişkilidir. BBB geçirgenliği değerlendirilmesi bu nedenle nörolojik hastalığın şiddeti ve istihdam tedavi stratejileri başarı değerlendirilmesinde çok önemlidir.
Henüz birkaç fare başarıyla uygulanmış olan sağlam geçirgenliği tahlil hem genetik hem deneysel modeller Burada basit bir mevcut. Son derece nicel ve izleyici Floresans analiz tarafından yaygın olarak uygulanan mikroskobu ile karşılaştırıldığında objektif yöntemidir. Bu yöntemde, fareler intraperitoneally sulu etkisiz floresan izleyiciler fareler anesthetizing tarafından takip bir karışımı ile enjekte edilir. Kardiyak perfüzyon hayvanların beyin, böbrek veya diğer organlara hasat öncesinde gerçekleştirilir. Organları homojenize ve centrifuged floresan ölçüm tarafından süpernatant takip. Hemen önce perfüzyon kardiyak ponksiyon çizilmiş kan damar yuvası normalleştirme amaçla hizmet vermektedir. Doku floresan bir nicel elde etmek için ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş izleyici geçirgenliği dizin. Ek onay için kontralateral hemi-beyin immünhistokimya için korunmuş izleyici Floresans görselleştirme amaçlar için yararlı olabilir.

Biz son zamanlarda angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) fareler daha yüksek beyin damar geçirgenliği kontrol fareler daha sağlıklı koşullar10' olduğunu ortaya koymuştur. Felç indüklenen farelerde Ayrıca GOF fareler daha büyük enfarktüsü boyutları ve daha büyük geçirgenliği kontrol littermates daha vardı gösterir oldu. Bu sonuçlar geçirgenliği BBB, Ang-2 kritik bir rol gösterir. Protokol bu nedenle GOF fareler kullanılmaktadır ve onları littermates viv...

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Bu prosedürün genel amacı, hayvan modellerinde kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu değerlendirmek için floresan etiketli izleyiciler kullanarak farelerde beyin damar sisteminin geçirgenliğini değerlendirmektir. Bu yöntem, hastalıklarda nöro-vasküler geçirgenlik ve tedavi üzerine iyileşmesi ile ilgili kan-beyin bariyeri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı basit ve nicel olmasıdır.Kantitatif olan florometri ve ayrıca bölgesel savunmalar için floresan mikroskobu ile geçirgenliğin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi imkanı verir. Bu tekniğin etkileri, beyin tümörleri, felç ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozuklukların tanı ve tedavisine kadar uzanır, çünkü bu hastalıklar yaşamı tehdit eden beyin ödemi ve önemli bir terapötik hedef olarak BBD fonksiyonunun iyileştirilmesi ile ilişkilidir. Prosedürün bir kısmını göstermek, enstitüde bilimsel teknoloji görevlisi olan Bayan Jadranka Macas olacak.İntraperitoneal olarak farelere 100 mikrolitre iki milimolar izleyici solüsyonu enjekte edin. Boyalar arasında minimum parazit için farklı uyarma emisyon spektrumlarına sahip FITC ve TMR ile etiketlenmiş dekstran gibi lizi

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, sodyum floresein molekülleri kullanılarak in vitro kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini değerlendirmek için bir geçirgenlik testi açıklanmaktadır.

Kan-Beyin Bariyeri Mimik Geçirgenlik Deneyi: BBB Mimikinin İzleyici Moleküllere Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin İn Vitro Test

Bu video, bir EAE fare modelinde kan-beyin bariyeri bozulmasını değerlendirmek için bir prosedürü göstermektedir. Farklı boyutlardaki floresan boyalar retro-orbital olarak enjekte edilir ve beynin kan damarlarında dolaşır. Daha küçük boya, boşluklardan beyin dokusuna sızarken, daha büyük boya, yalnızca bozulma şiddetli olduğunda girer ve bariyer hasarının derecesi ile ilişkilidir.

Bir EAE Fare Modelinde Floresan Boyalar Kullanılarak Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Belirlenmesi

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Sıçan beyni, mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositlerin bir ko-kültürüne dayalı olarak in vitro bir kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için bir yöntem tanımlanmış ve doğrulanmıştır. Bu sistem, nanoformülasyonun floresan moleküllerin trans-bariyer geçirgenliği üzerindeki etkisini incelemek için geçerli bir araç olduğunu kanıtladı.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Bu çalışmada, biz kan - beyin bariyerini nörodejeneratif koşullar altında çalışmasının değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut. Bizim hedefe ulaşmak için biz yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) etiketli infüzyon-albümin içine fare juguler ven ve onun kaçak beyin parankimi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirilir.

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Uyuşturucu merkezi sinir sistemi tümörleri için hedefleme büyük bir sorun olduğunu. Burada kan-beyin tümör-bariyer fare ve/veya insan hücreleri kullanarak bir tüp bebek taklit üretmek ve onların ilgi merkezi sinir sistemi tümörü içinde vivo hedefleme öngörülebilirliği için tartışmak için bir protokol açıklayın.

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Bu protokolde, submandibuler bezin (SMG) endotel bariyer fonksiyonu, iki fotonlu lazer taramalı mikroskop altında test hayvanı modellerinin açısal damarlarına in vivo olarak farklı moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler enjekte edilerek değerlendirilmiştir.

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Farelere farklı zaman noktalarında iki floresan boya uygulanarak kan-beyin bariyeri (BBB) bozulmasına bağlı boya ekstravazasyonunu görselleştirmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Gliserolün kriyoprotektan olarak kullanılması, aynı numune üzerinde immünohistokimyayı kolaylaştırdı.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Öğrenin farelerde kan-beyin bariyeri geçirgenliğini floresan izleyicilerle değerlendirme yöntemini. Bu basit ve nicel teknik, inme ve Alzheimer gibi nörolojik hastalıklarda tedavi etkinliğini araştırmak için kullanılır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Daha fazla video keşfet