Name: Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer hoe je bloed en serum bewaart als gedroogde vlekken voor biomarkeronderzoek naar kanker en infectieziekten. Deze methode maakt opslag mogelijk zonder vriezer voor minstens twee weken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.

Perifeer bloed en serum werden verzameld en opgeslagen van gezonde donoren en patiënten die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie. Het studie-protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie volgens de ethische normen vastgelegd in de verklaring van Helsinki van 1964.
1. bloed-opslag in DBS
<ol><li>
Bloed monster collectie
	<ol>
<li>Verzamelen van perifeer bloedmonster in een tube 3 mL met 5.4 mg ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 3 mL. Opmerking: Bewaar perifeer bloed als DBS zo spoedig mogelijk en binnen 8 uur.</li>
		<li>De patiënt codenummer op de rechter benedenhoek van de Spaarder kaart schrijven.</li>
		<li>Zorgvuldig resuspendeer de bloed met een 5 mL-pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloed spotten op DBS
	<ol>
<li>Pipetteer af en breng een plek van bloed (50 µL) op de kaart van saver (Tabel of Materials) met een 50-200 µL tip.</li>
		<li>Herhaal stap 1.2.1. hebben een totaal van 3 – 5 bloed vlekken. De oude tip negeren en een nieuwe een voor elke bloed aliquoot nemen.</li>
		<li>Laat de DBS aan droge overnachting bij kamertemperatuur in een horizontale positie over een open niet-absorberend oppervlak, vermijden van direct zonlicht. Laat de cover van de Spaarder kaart open om bloed drogen. Opmerking: Alle deeltjes in de lucht of stof tijdens deze drogen stap heeft geen invloed op van downstream toepassingen.</li>
		<li>De kaart bij kamertemperatuur bewaren in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA-extractie vanaf DBS volgens het DNA extractie Kit gegevensblad (sectie voor gedroogde bloed vlekken)
<ol><li>
Bereiding van de monsters
	<ol>
<li>Gebruik 3 gedroogd bloed vlekken van de kaart. Snijd elk van de gedroogde bloed vlekken van de kaart en scheiden van de kaart met een pincet. Snijd de gescheiden gedroogd bloed vlekken in kleine stukjes (diameter van ongeveer 1 mm).</li>
		<li>Leg de kleine stukjes in een centrifugebuis 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monster spijsvertering
	<ol>
<li>Voeg 180 µL van lysis buffer 1 geleverd in de kit (Tabel van materialen) aan de buis. Voeg 20 µL van proteïnase K. Meng geen lysis-buffermengsel 1 met proteïnase k voordat pipetteren in de 1,5 mL-buis met bloed bevlekte kaart. Meng door vortexing.</li>
		<li>Plaats de buis in een thermoincubator en Incubeer bij 56 ° C gedurende 60 min. Als de thermoincubator niet is uitgerust met een shaker, vortex het monster elke 10-15 min voor ten minste 10 s, verzorgen niet te laat de temperatuur van het monster verlagen. Kort centrifugeren de buizen druppels om uit te verwijderen het deksel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wassen van stap
	<ol>
<li>Voeg 200 µL van lysis buffer 2 (Tabel van materialen) en vortex voor 10 s.</li>
		<li>Plaats de buizen in een thermomixer of verwarmde orbitale incubator en Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Als de thermoincubator niet met een shaker uitgerust is, vortex de monsters eenmaal voor ten minste 10 s, verzorgen niet te laat de temperatuur van de monsters afnemen.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.1. Breng de 400 µL van lysate uit de buis 1,5 mL elutie kolom (Tabel van materialen). Centrifugeer de kolom bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Plaats van de kolom-elutie in een nieuwe 2 mL collectie buis en negeren oude.</li>
		<li>Voeg 500 µL van was buffer 1 (Tabel van materialen) en centrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Plaats van de kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en gooi oude.</li>
		<li>Voeg 500 µL van was buffer 2 (Tabel van materialen) en centrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Plaats van de kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en gooi oude.</li>
		<li>Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten te drogen van het membraan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elutie stap
	<ol>
<li>Plaats van de kolom in een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis en gooi de collectie buis.</li>
		<li>Plaats 50 ÂµL van gedistilleerd water in het midden van het membraan. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 20.000 x g gedurende 1 min. verzamelen het eluaat en plaats deze weer in het midden van het membraan.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 20.000 x g gedurende 1 min. Gooi het membraan.</li>
		<li>Het meten van de concentratie van de DNA met een spectrofotometer.</li>
		<li>Winkel DNA bij-20 ° C tot gebruik. Opmerking: DNA geëxtraheerd uit DBS kan worden gebruikt voor het uitvoeren van diverse analyses uitgevoerd, zoals de SNP evaluatie door Real Time PCR of DNA Sanger sequentiebepaling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. serum opslag voor DSS
<ol><li>
Bloed monster collectie
	<ol>
<li>Verzamelen 7 mL van perifeer bloedmonster in een tube van 7 mL zonder EDTA. Laat het bloedmonster te coaguleren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>De patiënt codenummer op de rechter benedenhoek van de Spaarder kaart schrijven.</li>
		<li>Centrifugeer het bloedmonster bij 980 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Bewaar serum als DSS zo spoedig mogelijk en binnen 8 uur.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de buis voorzichtig en overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL. Zorgvuldig resuspendeer de bloed met een 5 mL-pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serum spotten in DSS
	<ol>
<li>Pipetteer af en breng een plek van serum (50 µL) op de kaart van de spaarder. Herhaal deze stap als u wilt dat een totaal van 3 – 5 bloed vlekken. Opmerking: Wees zeer voorzichtig te precies 50 µL van de serum Pipetteer in elke vlek. Serum moet het niet verder dan uit de onderbroken lijn van de kaart.</li>
		<li>Laat de DSS aan droge overnachting bij kamertemperatuur. Laat de cover van de Spaarder kaart open om bloed drogen.</li>
		<li>De kaart bij kamertemperatuur bewaren in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik. Als de opslag langer dan 14 dagen is, slaat u de kaart bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ELISA Assay vanaf DSS
<ol><li>
Elueer eiwit van DSS.
	<ol>
<li>Ontdooi een DSS voor elk monster indien nodig. DSS snijd in kleine stukjes (ongeveer 1 mm in diameter). Zet de stukken in een tube 1,5 mL met 400 µL van PBS.</li>
		<li>Schud de monsters 's nachts bij 4 ° C. Opmerking: Schud ze bij een lage intensiteit. PBS moet de cover van de buis niet nat. tijdens het schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik het eluaat eiwit als een serummonster voor secreted eiwit/groei factoranalyse volgens de instructies van de kit van ELISA, na passende verdunningen. Opmerking: Deze procedure werkt goed voor DBP detectie9. Voor andere ELISA-testen, kan een stap van optimalisatie nodig zijn.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dit protocol onderzoekt de mogelijkheden voor het opslaan van bloed en serum op filterpapier wanneer de labs niet hebben het personeel of de infrastructuur die nodig is voor de juiste afhandeling van bloedmonsters. In het bijzonder, volledig bloed of serum verzameld in standaard buizen of door vinger-lul kan worden opgeslagen met behulp van deze methode en er is geen behoefte om te bevriezen van monsters bij-20 ° C of -80 ° C onmiddellijk na de bloedinzameling. DBS/DSS kan blijven tot 14 dagen zonder enige verandering in...

Het belangrijkste doel van het onderzoek naar kanker biomarkers is de identificatie van nieuwe biologische parameters die kunnen worden gebruikt voor diagnose, voorspellen patiënt prognose en voor het bepalen of een patiënt op een specifieke behandeling reageren zal. Deze onderzoekruimte is van fundamenteel belang voor de ontdekking van innovatieve kankerbehandelingen en speelt een sleutelrol in op maat gemaakte behandeling.
De procedures die zijn uitgevoerd tijdens elke stap van biomerker identificatie en validatie moet betrouwbaar en reproduceerbaar. Een hoeksteen voor het welslagen van translationeel onderzoek is de juiste opslag van biologische monsters zoals bloed en serum. Dit is de eerste stap op weg naar het verkrijgen van hoge kwaliteit biologisch materiaal dat kan worden gebruikt voor het moleculaire biologie-experimenten of eiwit tests uitvoeren.
Multicenter studies zijn vaak nodig om te werven genoeg patiënten om robuuste gegevens te verkrijgen. Niet alle instituten zijn in staat om op te slaan van de monsters bij-80 ° C of monsters verzenden naar andere internationale centra in droog ijs. Het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling is een eenvoudige methode voor het opslaan van bloed en serum en vereist niet de onmiddellijke bevriezing van monsters1,2. Een druppel bloed of serum gespot kan worden op het papier, overgelaten aan droge overnachting en vervolgens opgeslagen voor maximaal 14 dagen bij kamertemperatuur1,2. Dit geeft onderzoekers tijd voor het verzenden van de monsters met andere laboratoria. Het gebruik van gedroogde bloed vlekken (DBS) en gedroogde serum vlekken (DSS) kon dus vereenvoudiging van de samenwerking tussen instituten in ontwikkelde en ontwikkelingslanden.
Gezien haar gebruiksgemak, wordt DBS bemonstering veel gebruikt in verschillende soorten testen voor serologische of genetische downstream analyses. Bijvoorbeeld, in het verleden, werden DBS vaak gebruikt voor HIV screening in ontwikkelingslanden1,2,3,4,5. Een ander voordeel van deze opslagmethode is dat bloedmonsters van vinger-prikt, waardoor het gebruik ervan voor pasgeboren screening tests 6,7,8kunnen worden verzameld. Eenvoudig voorbeeld verladen en het vervoer zijn verdere voordelen van DBS, vooral voor monsters die op externe sites waar er geen laboratoriumapparatuur is. In een eerdere publicatie gebruikten we DBS en DSS vitamine D en vitamine D-bindend-proteïne (DBP) testen in een reeks van Kaukasische en Afrikaanse patiënten9. Onze Afrikaanse collega's waren niet in staat om droog ijs. Om te vergelijken de biologische markers om te begrijpen van de verschillen in de vitamine D-traject tussen de twee etnische bevolkingsgroepen, verbeterd we verder de procedure met behulp van gecompenseerde monsters opgeslagen onder normale omstandigheden en op filterpapier. Na het optimaliseren van de procedure DBS/DSS, konden we om DBP en vitamine D in het serum van de patiënt in beide cohorten te analyseren. Wij ook een aantal interne nucleotidepolymorfisme (SNPs) na DNA-extractie uit volbloed voor blanken en DBS voor Afrikanen9geëvalueerd. Dit protocol maakt hoge kwaliteit bloedmonsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder dat verschillende soorten downstream analyses, variërend van de moleculaire biologie tot ELISA testen. Het wordt aanbevolen voor gebruik voor het beheer van biologische materialen in multicenter studies of centra die nog geen voorzieningen voor standaard bewaarcondities. Het volgende protocol vertegenwoordigt het hoogtepunt van deze geoptimaliseerde procedures.

<table><tbody><tr><td>Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Handig voor het bewaren van monsters bij kamertemperatuur voor downstream analyses</td></tr><tr><td>Falcon Serological Pipettes, 5 mL</td><td>Stamcel</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro;L tips</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifugebuisje</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Dit is een DNA-extractiekit ontworpen om kleine hoeveelheden DNA&nbsp;&nbsp; te isoleren</td></tr><tr><td>Buffer ATL (inbegrepen in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dit wordt vermeld als Lysis Buffer 1 in de tekst</td></tr><tr><td>Buffer AL (inbegrepen in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dit wordt vermeld als Lysis Buffer 2 in de tekst</td></tr><tr><td>QIAamp mini elute kolom</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dit wordt vermeld als kolom in de tekst</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (inbegrepen in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dit wordt vermeld als Wash Buffer 1 IN DE TEKST</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (inbegrepen in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dit wordt vermeld als Wash Buffer 2 in de tekst</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;D systemen</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

gedroogd bloed en serum vlekken als een nuttig instrument voor sample opslag om te evalueren van kanker, biomarkers

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Bloed monster kwaliteit is van cruciaal belang om ervoor te zorgen nauwkeurige downstream analyses uitgevoerd, zoals real-time PCR of ELISA. Juiste opslag van biologische materialen is het uitgangspunt om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te bereiken. Alle monsters moeten worden behandeld op dezelfde wijze uit bloed collectie naar opslag. Afhankelijk van de analyses worden uitgevoerd, moeten volbloed en serummonsters worden opgeslagen bij-20 ° C of -80 ° C tot gebruik. Bloed/serum monsters moeten ook worden aliquoted om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien. Een ander belangrijk punt is de steekproef voorwaarden tijdens de verzending van een laboratorium naar de andere. Als droog ijs niet beschikbaar is of de verzending langer dan een paar dagen duurt, zijn alternatieve benaderingen nodig. Ã‰ã © n optie is het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling. Hier stellen wij een methode voor bloed en serum sample collectie die van profiteert gedroogd bloed vlekken (DBS) en gedroogd serum vlekken (DSS). We ontwikkelden de procedure om uit te pakken van DNA van DBS voor de downstream evaluatie van sommige één nucleotidepolymorfisme (SNPs) door real-time PCR. Wij ook een analyse van de ELISA vanaf eiwitten geëlueerd van DSS geoptimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt met andere ELISA testen of de procedures evaluatie van eiwitten.

Wij maakte gebruik van de DBS en DSS procedures voor het opslaan van bloed en serum bij kamertemperatuur zonder de kwaliteit van het biologisch materiaal te beïnvloeden. Figuur 1 toont een voorbeeld van de eiwit-kaart spaarder zonder bloed en na het verzamelen van bloed. Om te bevestigen dat de opslag op filterpapier en de procedure voor het bloed Elueer niet met monster kwaliteit interfereert, we een vergelijking uitgevoerd met standaard opslagmethoden. We h...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en handige methode voor het opslaan van perifeer bloed en serum/plasma voor downstream analyses uitgevoerd, zoals single nucleotide polymorphism (SNP) evaluatie en analyse ELISA.

Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in translationeel onderzoek, zoals de kans om biomarkers te bestuderen bij patiënten uit ontwikkelingslanden. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bloed- en serummonsters minimaal twee weken op te slaan zonder in te vriezen en hoogwaardig materiaal te leveren voor downstream-analyses zoals qPCR en ELISA. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van ziekten zoals kanker en infectieziekten.Deze methode kan ook worden toegepast op diagnostische of onderzoeksgebieden, zoals de studie van prenatale ziekten of de analyse van infectieuze pathologie zoals HIV. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we biomarkers vergeleken tussen een caucasische en een Afrikaanse casuseserie waarvoor bevroren monsters niet beschikbaar waren. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de bloedaanbrengstappen moeilijk te leren zijn.Bij deze procedure wordt drie milliliter bloedmonster in een buis van drie milliliter verzameld met 5,4 milligram EDTA. Schrijf het patiëntcodenummer op de rechteronderhoek van de saver card. Breng het bloed voorzichtig opnieuw in suspensie met een pipet van vijf milliliter.Pipet vervolgens een druppel bloed op de saver card. Gebruik voor elke bloedaliquot een nieuwe tip en herhaal het aanbrengen om in totaal drie tot vijf bloedvlekken te verkrijgen. Laat de gedroogde bloedvlekken, of DBS, een nacht lang drogen bij kamertemperatuur met het deksel van de saver card open in een horizontale positie over een open, niet-absorberend oppervlak en vermijd direct zonlicht.Bewaar de kaart de volgende dag bij kamertemperatuur in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik. DNA wordt geëxtraheerd uit drie gedroogde bloedvlekken van de saver card. Begin met het afsnijden van elk van de DBS van de kaart en scheid ze van de kaart.Snijd de gescheiden DBS in kleine stukjes van ongeveer een millimeter in diameter. Plaats de kleine stukjes van een DBS in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg voor het verteren van de monsters aan de buis 180 microliter lysisbuffer toe uit een commercieel verkrijgbare DNA-extractiekit, en voeg vervolgens 20 microliter proteïnase K toe. Mix door te vortexen.Plaats de buis in een thermo-incubator en incubeer met schudden gedurende 60 minuten bij 56 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de buis kort om druppels van het deksel te verwijderen. Begin met wassen door 200 microliter lysisbuffer twee toe te voegen en gedurende 10 seconden te vortexen.Plaats de buis in een thermomixer en incubeer gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius. Plaats de elutiekolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg. Voeg 500 microliter wasbuffer toe en centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer zwaartekracht.Plaats de kolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg. Voeg 500 microliter wasbuffer twee toe en centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer zwaartekracht. Plaats de kolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg.Centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000 keer zwaartekracht om de membraan te drogen. Om het DNA te elueren, plaats de kolom in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter en gooi de verzamelbuis weg. Plaats 50 microliter gedistilleerd water op het midden van de membraan en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 20.000 keer zwaartekracht. Verzamel het eluaat en plaats het opnieuw op het midden van de membraan. Centrifugeer de buis opnieuw gedurende één minuut bij 20.000 keer zwaartekracht.Gooi de membraan weg. Nadat de DNA-concentratie is gemeten met behulp van een spectrofotometer, bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Voor deze procedure wordt eerst zeven milliliter perifeer bloedmonster verzameld in een buis van zeven milliliter zonder EDTA.Laat het bloedmonster 30 minuten bij kamertemperatuur coaguleren. Schrijf het patiëntcodenummer op de rechteronderhoek van de saver card. Centrifugeer het bloedmonster gedurende 15 minuten bij 1100 keer zwaartekracht bij kamertemperatuur.Verwijder het supernatant uit de buis en breng het over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Breng het bloed voorzichtig opnieuw in suspensie met een pipet van vijf milliliter. Pipet en breng een druppel serum op de saver card over.Herhaal het aanbrengen om in totaal drie tot vijf bloedvlekken te verkrijgen. Laat de gedroogde sere vlekken een nacht lang drogen bij kamertemperatuur met het deksel van de saver card open. Bewaar de kaart de volgende dag bij kamertemperatuur in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik.Als de opslag langer is dan 14 dagen, bewaar bij min 20 graden Celsius. Bereid de ELISA-test voor door de DSS voor elk monster te ontdooien indien nodig. Om het eiwit uit de DSS te elueren, snijd een DSS in kleine stukjes van ongeveer een millimeter in diameter en plaats de stukjes in een buis van 1,5 milliliter.Voeg vervolgens vier microliter PBS toe. Schud de monsters met lage snelheid bij vier graden Celsius gedurende een nacht. Gebruik op de volgende dag een geschikte verdunning van het eiwit eluaat als serummonster voor secretie-eiwit- of groeifactoranalyse met behulp van een commercieel verkrijgbare kit.In dit protocol werden bloed- en serummonsters opgeslagen als gedroogde vlekken op filterpapier bij kamertemperatuur. Een representatieve proteïn saver card wordt getoond vóór en na de bloedafname. Om te bevestigen dat de opslag op filterpapier en de procedure om bloed te elueren geen invloed hebben op de monsterkwaliteit, werden ELISA-tests voor vitamine D-bindend eiwit, of DBP-niveaus, uitgevoerd op acht monsters van serum die in een buis van twee milliliter werden verzameld en onmiddellijk bij min 80 graden Celsius werden bewaard of als gedroogde serumvlekken werden verzameld.De variatiecoëfficiënt, of CV, tussen overeenkomstige monsters varieerde

dried-blood-serum-spots-as-useful-tool-for-sample-storage-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Biomarkers zijn direct gemeten biologische indicatoren van ziekte of gezondheid. Van de bevolking en de sociale wetenschappen, moeten biomarkers te zijn gemakkelijk te verkrijgen, het vervoer, en te analyseren. Gedroogde Blood Spot (DBS) collectie voldoet aan deze behoefte, kunnen worden verzameld in het veld met hoge respons en voor een verscheidenheid van biomarkers geanalyseerd.

Gedroogde Blood Spot Collectie van Volksgezondheid Biomarkers voor deelname aan Population Studies maximaliseren

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

De voorbereiding en de verwerking van gedroogd bloed vlekken (DBS) voor hun per slot van rekening zijn nog steeds slecht gestandaardiseerd voor de meeste diagnostische toepassingen. Om te overwinnen deze tekortkoming, is een uitgebreide stapsgewijze protocol voorgesteld en vervolgens geëvalueerd ten aanzien van de doeltreffendheid ervan voor het detecteren van merkers van virale infecties.

Gedroogde bloed vlekken - voorbereiden en verwerken voor gebruik in immunoassay en moleculaire technieken

Kutane tumoren worden vaak weggegooid na Mohs micrografische chirurgie. Hier wordt een protocol beschreven dat klinisch ondersteunend personeel effectief kan verwerken en opslaan van huidkanker ( bv. Plaveiselcelcarcinoom, basale celcarcinoom en melanoom) monsters voor stroomafwaartse laboratoriumtoepassingen zonder in te grijpen bij klinische operaties.

Oprichting van een Biorepository op een kliniek

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.

Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde serummonsters, geïllustreerd met de biomarker progastrine-releasing peptide (ProGRP). Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden gebruikt voor de selectieve reiniging en verrijking van een proteotypisch ProGRP-peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geanalyseerd met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Dit protocol beschrijft een methode om het verzamelen van monsters van radicale prostatectomiemonsters te vergemakkelijken. Het doel is om weefselmonsters van de monsters in kaart te brengen, te karakteriseren en micro-macro te ontleden op basis van anatomopathologische criteria voordat ze in een biobank worden opgeslagen.

Verbetering van de betrouwbaarheid van biobanking van prostaattumoren met verbeterde bemonsteringstechniek en histologische karakterisering

Dit protocol standaardiseert SDS-PAGE-analyse voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering op nanodeeltjes, waardoor reproduceerbare, schaalbare en goedkope detectie van kankerspecifieke signaturen mogelijk is. Ontworpen voor vroege diagnose van pancreasductaal adenocarcinoom, biedt het een praktisch, GERUSTGESTELD alternatief voor complexe proteomische methoden in zowel onderzoek als klinische omgevingen.

Gestandaardiseerde SDS-PAGE workflow voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering bij vroege kankerdetectie

Leer hoe je bloed en serum bewaart als gedroogde vlekken voor biomarkeronderzoek naar kanker en infectieziekten. Deze methode maakt opslag mogelijk zonder vriezer voor minstens twee weken.

Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers

Meer video's verkennen