Name: 高通量 SiRNA 筛选氯化苦和氟化氢引起的角膜上皮细胞损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 了解高通量siRNA筛选技术在角膜上皮细胞毒性损伤模型中的应用方法。本研究利用自动化液体处理系统建立氯化苦和氟化氢暴露模型，为阐明角膜细胞对毒物的反应机制及开发治疗策略提供重要基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了美国国立卫生研究院CounterACT项目机构间协议（编号：AOD13015-001）的支持。我们感谢Stephanie Froberg和Peter Hurst在视频制作方面的努力与专业支持。

1. 细胞培养的维持
<ol>
	<li>在 DMEM F-12 培养基中培养 SV40-HCEC 细胞系，培养条件为 37 °C、5% CO2 和 90% 湿度，培养基中添加 15% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、10 µg/L 表皮生长因子（EGF）和 5 mg/L 胰岛素。</li>
	<li>每 3 至 4 天传代一次细胞系（根据接种密度而定），以确保在培养过程中细胞融合度从不超过 80%。</li>
	<li>使用消化液（每 150 cm2 培养瓶使用 14 mL 消化液）在 37 °C 下孵育不超过 8 分钟，使细胞从培养瓶壁脱离。</li>
	<li>用等体积的细胞培养基中和消化液，并将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中，在 160 × g 条件下离心 7 分钟以收集细胞沉淀。</li>
	<li>用培养基重悬细胞沉淀（每 150 cm2&#160;培养瓶使用 20 mL 培养基）。</li>
	<li>使用自动手持式细胞计数仪计数细胞，并以适当的密度接种至新培养瓶中，确保细胞可在 3 至 4 天内生长而不超过 80% 融合度。</li>
</ol>
2. 为实验接种细胞
<ol>
	<li>使用相差显微镜检查SV40-HCEC培养瓶，确保细胞融合度低于80%，并评估细胞整体健康状况。</li>
	<li>按照细胞培养维护步骤1.3至1.6所述方法，消化、离心、重悬并计数来自培养瓶的SV40-HCEC。使用含有0.5 µg/mL氢化可的松（HCORT培养基）的SV40-HCEC培养基重悬细胞。</li>
	<li>在一次性培养基瓶中，将SV40-HCEC以17,857个细胞/mL的浓度悬浮于预热的HCORT培养基中。
	<ol>
		<li>根据待接种培养板的数量，准备足量的细胞悬液。</li>
		<li>每研究一块siRNA文库板，至少接种14块96孔板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻摇动瓶子使细胞均匀悬浮，将适量细胞悬液倒入自动液体处理仪的轨道摇床孵育槽中的储液槽内，并在接种过程中将装有细胞悬液的瓶子置于37 °C加热板上保存。</li>
	<li>使用自动液体处理仪向96孔板每孔加入70 µL培养基，使细胞密度为每孔1000个细胞（5000个细胞/cm2）。所有操作步骤中均使用50 µL/s的移液速度。
	<ol>
		<li>在接种过程中，持续以100 rpm转速运行轨道摇床。</li>
		<li>使用自动液体处理仪对细胞悬液进行三次混合（混合体积为140 µL）。</li>
		<li>吸取140 µL细胞悬液，向两个细胞培养板的每孔中各分配70 µL。</li>
		<li>重复步骤2.5.3和2.5.4，直至所有培养板均完成细胞接种。</li>
		<li>在接种过程中根据需要及时补充细胞悬液储液槽中的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种完成后，将培养板从自动液体处理仪中取出，在室温下静置30分钟后转移至细胞培养箱中孵育。</li>
	<li>次日早晨，使用置于细胞培养箱内的自动成像系统评估每块板每个孔的细胞密度，并排除任何内部孔细胞融合度不在15%至22%范围内的培养板。</li>
</ol>
3. 使用 siRNA 转染细胞
<ol>
	<li>从供应商处获取已预配置的siRNA文库板，每板包含80个siRNA靶点（参见 图4），第1列和第12列留空。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用siRNA缓冲液重悬siRNA文库板，使每孔siRNA的终浓度为2 pmol/µL19.</li>
	<li>转染细胞：接种后24 h，每孔加入4 pmol siRNA和0.3 µL转染试剂进行转染。所有操作步骤均按照转染试剂生产商的说明书进行（参见 图4 用于平板布局）20.
	<ol>
		<li>使用自动化液体处理仪进行所有转染操作，所有步骤的移液速度均为 25 µL/s。使用预配置的吸头盒，仅对需要转染的孔进行操作。</li>
		<li>使用文库板的上半部分转染六块重复培养板，称为 &#34;顶板组件&#34; （每种siRNA六个重复，n=6）</li>
		<li>使用文库板的下半部分转染另一组六个重复板，称为 &#34;底部板组件&#34; （每种siRNA六个重复，n=6）</li>
		<li>使用该术语 &#34;整板套装&#34; 描述已转染文库siRNA的12个细胞培养板。</li>
		<li>在所有全板组的顶部和底部板组均用文库siRNA转染后，用阴性对照池siRNA转染全板组中所有B2-B6孔。</li>
		<li>另取两块培养板，将其中的B2-B6孔转染阴性对照siRNA池，这两块板不加入文库siRNA，作为未暴露对照组（一块用于上层板组，另一块用于下层板组）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加入所有转染混合物后，将所有细胞培养板置于细胞培养箱中孵育4小时，每隔1小时轻轻敲击混匀。</li>
	<li>使用自动化液体处理仪，用预热的HCORT培养基以1:5比例稀释于PBS中，对所有孔板进行两次洗涤。所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。
	<ol>
		<li>从每个孔中吸出 100 µL 液体，并弃入废液容器中。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 µL/孔预热的 HCORT 培养基，该培养基用 PBS 按 1:5 比例稀释，置于另一储液器中，体积需足以满足所需板数的用量。</li>
		<li>对每块板重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。
		<ol>
			<li>根据需要清空废液储槽。</li>
			<li>根据需要，用 PBS 按 1:5 比例稀释 HCORT 培养基后补充至储液槽中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从每个孔中吸出 100 µL 并弃入废液槽中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用预热的HCORT培养基以每孔100 µL重新加样至所有孔中，该培养基应盛装于另一储液器中，并确保培养基体积足以满足所需板数的用量。
	<ol>
		<li>根据需要向储液槽中补充培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有培养板的C2-C6孔用作未转染对照。</li>
	<li>将所有培养板的 B7-B11 和 C7-C11 孔保持未转染状态，用作毒性物质暴露实验中的药物和溶剂对照。</li>
</ol>
4. 次日重新为细胞提供培养基
<ol>
	<li>使用自动化液体处理仪为所有孔板的孔重新加液。所有步骤均采用 50 µL/s 的移液速度。
	<ol>
		<li>从每个孔中吸取 100 µL 液体，并弃入废液槽中。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 µL/孔预热的 HCORT 培养基，培养基应来自另一个储液槽，并确保储液槽中含有足够体积的培养基以完成所有板的换液。</li>
		<li>根据需要重复步骤 4.1.1 和 4.1.2，以完成所有细胞板的换液。
		<ol>
			<li>根据需要清空废液槽。</li>
			<li>根据需要向储液槽中补充培养基。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 阳性对照添加
<ol>
	<li>转染后两天，暴露前两小时，用HCORT培养基配制62.5 µM的阳性对照物豆蔻素（cardamonin）溶液，用于HFA暴露实验，并加入8排稀释储液槽的B排。
	<ol>
		<li>对于CP暴露实验，配制并使用25 µM的SKF 86002溶液。</li>
		<li>根据待测板的数量，配制足量的阳性对照溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用HCORT培养基配制0.625%的DMSO溶液（溶剂对照），并加入同一储液槽的C排。
	<ol>
		<li>对于CP暴露实验，配制并使用0.5%的DMSO溶液。</li>
		<li>根据待测板的数量，配制足量的溶剂对照溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动化液体处理仪，将阳性对照和溶剂对照分别加入每块细胞板的B7–B11和C7–C11孔中，所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。使用预配置的吸头盒，仅对将要加入阳性对照和溶剂对照的孔进行操作。
	<ol>
		<li>从每块细胞板的B7–B11和C7–C11孔中移除10 µL培养基，并弃入8排稀释储液槽的G排和H排。</li>
		<li>向这些孔中转移10 µL的阳性对照和溶剂对照，并混合3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将这些细胞板放回培养箱中。</li>
	<li>重复步骤5.3至5.4，直至所有细胞板均加入阳性对照和溶剂对照。</li>
</ol>
6. 培养细胞的高频暴露
警告：HFA 具有腐蚀性且急性毒性。
<ol>
	<li>所有化学暴露操作均须在化学通风橱内进行，并佩戴双层丁腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。
	<ol>
		<li>获取浓度为48%的氢氟酸（HFA）溶液。</li>
		<li>用超纯水将HFA稀释至1%，并分装为5 mL等份，储存于10 mL厚壁聚乙烯小瓶中以提高安全性。</li>
		<li>在将接触过HFA的移液枪头、储液槽以及剩余液态HFA丢弃至危险废物处理系统之前，须先用2.5%葡萄糖酸钙进行去污处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针对每一块待研究的siRNA文库板，取80 mL预热的HCORT培养基置于150 mL瓶中，加入288 µL的1% HFA，配制0.0036%的HFA培养液。
	<ol>
		<li>轻轻旋转瓶子混匀，并将稀释后的HFA溶液置于化学通风橱内的37 °C培养箱中孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次通过旋转瓶子充分混匀HFA培养液，然后将其加入置于板加热器上的试剂储液槽中。</li>
	<li>由两名技术人员协同完成暴露操作。
	<ol>
		<li>右侧技术人员使用12通道移液器从细胞板的内部孔中吸取100 µL液体，随后将板传递给左侧技术人员。</li>
		<li>左侧技术人员向每孔加入100 µL HFA培养液。</li>
		<li>对所有需暴露于毒物的细胞板重复步骤6.4.1和6.4.2。</li>
		<li>对未暴露的对照板也重复步骤6.4.1和6.4.2，但使用新鲜的HCORT培养基代替HFA培养液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将处理后的板置于化学通风橱内的培养箱中孵育20分钟，随后转移回细胞培养箱中。</li>
	<li>在所有板完成暴露并返回细胞培养箱后，重复阳性对照添加步骤（步骤5.1至5.5），操作方法如前所述。</li>
</ol>
7. 培养细胞的CP暴露
警告：CP 具有急性毒性且为刺激物。
<ol>
	<li>所有化学暴露操作均须在化学通风橱内进行，并佩戴双层丁腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。
	<ol>
		<li>获取 CP。</li>
		<li>将 CP 用 DMSO 稀释至 5%，并分装为 10 mL 等份，置于 10 mL 闪烁瓶中，以提高安全性。</li>
		<li>在将接触过 CP 的移液器吸头和储液槽以及剩余液体 CP 丢弃至危险废物处理系统之前，先用 2.5% 亚硫酸氢钠进行去污处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据待暴露培养板的数量，准备足量的预热 HCORT 培养基（含 1× 青霉素/链霉素）和预热 PBS。</li>
	<li>对于每一套上层培养板或下层培养板，向 50 mL 预热的 HCORT 培养基中加入 8.04 µL 的 5% CP（溶于 DMSO），充分混匀，使 CP 的终浓度为 0.0008%。盖紧管盖，并将溶液置于化学通风橱内的 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
	<ol>
		<li>控制 CP 加入 50 mL 培养基等份的时间，确保每一套待暴露的上层培养板和下层培养板在 CP 加入培养基后恰好 1 小时接受毒物暴露。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在孵育接近结束时，从细胞培养箱中取出一套上层培养板和 1 块未暴露的对照板，放置于化学通风橱内。</li>
	<li>在 1 小时孵育结束时，通过倒置混匀 CP 溶液，然后将其倾倒至试剂储液槽中。</li>
	<li>由两名技术人员协同完成暴露操作。
	<ol>
		<li>右侧技术人员使用 12 通道移液器从细胞培养板的内侧孔中吸出 100 µL 培养基，随后将培养板传递给左侧技术人员。</li>
		<li>左侧技术人员向每孔加入 100 µL CP 培养基溶液。</li>
		<li>对所有待暴露的上层培养板重复步骤 7.6.1 和 7.6.2。</li>
		<li>对未暴露的对照板也重复步骤 7.6.1 和 7.6.2，但使用新鲜的 HCORT 培养基代替 CP 培养基溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板置于化学通风橱内的 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 10 分钟孵育接近结束时，向试剂储液槽中加入足量的 PBS 和含 1× 青霉素/链霉素的预热 HCORT 培养基。</li>
	<li>在 10 分钟孵育结束时，使用 12 通道移液器从细胞培养板中移除 CP 溶液，并向每孔加入 100 µL PBS。</li>
	<li>立即从细胞培养板中移除 PBS，并向每孔加入 100 µL 含 1× 青霉素/链霉素的 HCORT 培养基。</li>
	<li>对未暴露的对照板同样重复步骤 7.9 和 7.10。</li>
	<li>将细胞培养板放回标准细胞培养箱中。</li>
	<li>对下层培养板重复步骤 7.3 至 7.12。</li>
	<li>在所有培养板完成暴露并放回细胞培养箱后，重复阳性对照添加步骤（步骤 5.1 至 5.5），方法同前。</li>
</ol>
8. 样品采集与细胞活力检测
<ol>
	<li>暴露后 24 小时，配制含有 10 g/L 葡萄糖的 PBS 溶液，其中 MTT 底物浓度为 0.5 mg/mL，并预热至 37 °C21。每块待检测的培养板准备 10 mL 底物溶液。</li>
	<li>根据待检测的培养板数量，向自动液体处理系统的储液槽中加入足量的 MTT 底物溶液。</li>
	<li>使用自动液体处理系统进行取样，并以 50 µL/s 的移液速度加入 MTT 底物，所有步骤均采用该速度。预先配置吸头盒，仅针对需要检测的孔位进行操作。
	<ol>
		<li>从细胞培养板的内侧 60 个孔中各吸取 95 µL 培养基，并将 42.5 µL 分别转移至两个 384 孔储存板中。</li>
		<li>立即向细胞培养板的每个孔中加入 100 µL MTT 底物溶液，在细胞培养箱中 37 °C 孵育 1.5 小时。</li>
		<li>根据需要，向储液槽中补充 MTT 底物溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞培养板置于细胞培养箱中 37 °C 孵育 1 小时。</li>
	<li>密封 384 孔储存板，并于 -80 °C 保存，以备后续分析。</li>
	<li>对所有顶部和底部培养板组及其相应的未暴露对照组重复步骤 8.3 至 8.5。
	<ol>
		<li>如需在重复样本间重复使用吸头，应在添加 MTT 底物溶液时以及在不同板组之间切换时清洗吸头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育 1 小时后，向自动液体处理系统的储液槽中加入足量的 DMSO。</li>
	<li>使用自动液体处理系统加入 DMSO，所有步骤均采用 50 µL/s 的移液速度。
	<ol>
		<li>从细胞培养板的每个内孔中吸取 100 µL 液体，将 MTT 底物溶液弃入废液槽。
		<ol>
			<li>根据需要清空废液槽。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向每个孔中覆盖 100 µL DMSO。
		<ol>
			<li>根据需要补充 DMSO 储液槽中的液体。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板置于板式振荡器上振荡 3 分钟。</li>
	<li>使用板式分光光度计在 570 nm 和 690 nm 波长下测定吸光度。</li>
	<li>扣除背景值，通过将暴露组的吸光度值除以未暴露对照组的吸光度值来计算细胞活力百分比。所有靶标均使用平均未暴露阴性池 siRNA 对照计算细胞活力百分比。</li>
</ol>
9. 测定细胞培养上清液中IL-8的浓度
<ol>
	<li>根据制造商的说明22，使用无需洗涤的基于微珠的检测方法测定细胞培养上清液中IL-8的浓度。设计检测板布局以容纳样本和标准曲线。</li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出384孔储存板，在室温下解冻，并短暂离心以使孔底的样本完全沉降。</li>
	<li>根据待运行的检测板数量，在试剂盒提供的检测缓冲液中配制足量的抗IL-8受体微珠和生物素化抗IL-8抗体。按每9.9 mL检测缓冲液加入50 µL抗IL-8受体微珠和50 µL生物素化抗IL-8抗体的比例进行配制。
	<ol>
		<li>使用多通道移液器，将微珠/抗体混合液加入黑色384孔储存板中。
		<ol>
			<li>根据检测板布局，将受体微珠/抗体加入指定用于样本和标准曲线的孔中。</li>
			<li>每孔加入足量液体，以满足待运行检测板的数量需求。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用含354 µM NaCl的细胞培养基将IL-8标准品重悬至1000 pg/mL。根据待运行检测板的数量配制足量标准品溶液。</li>
	<li>对标准品进行八次两倍系列稀释。</li>
	<li>根据检测板布局，将标准曲线样品以每孔足量体积加入黑色384孔储存板的相应孔中，每组设三个复孔。
	<ol>
		<li>同样地，加入不含IL-8但含354 µM NaCl的细胞培养基作为背景对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动化液体处理系统进行检测。使用预配置的吸头盒，仅处理检测板布局中指定的孔。所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。
	<ol>
		<li>将8 µL受体微珠-抗体混合液转移至白色384孔浅孔检测板的各孔中。
		<ol>
			<li>仅加入检测板布局中指定用于样本和标准曲线的孔。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据检测板布局，将2 µL标准曲线溶液转移至浅孔检测板的相应孔中。</li>
		<li>配制3.54 M NaCl溶液，并根据待检测板数量，向自动化液体处理系统的浅层储液槽中加入足量该溶液。</li>
		<li>通过向黑色384孔储存板中的样本孔加入4.5 µL NaCl溶液，调整样本的盐浓度，使其与标准曲线一致。</li>
		<li>使用30 µL混匀体积将样本混匀三次，然后根据检测板布局，将2 µL样本转移至白色浅孔检测板中。
		<ol>
			<li>在不同样本板之间更换吸头。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温避光条件下孵育1小时。</li>
		<li>根据待运行的检测板数量，在检测缓冲液中配制足量的二级受体微珠。按每12.3 mL检测缓冲液加入200 µL二级受体微珠的比例进行配制。</li>
		<li>使用多通道移液器，将二级微珠加入黑色384孔储存板中。
		<ol>
			<li>根据检测板布局，将二级微珠加入指定用于样本和标准曲线的孔中。</li>
			<li>每孔加入足量液体，以满足待运行检测板的数量需求。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用自动化液体处理系统，将10 µL二级微珠转移至白色384孔浅孔检测板的各孔中。
		<ol>
			<li>仅加入根据检测板布局已接收样本和标准曲线的孔，并在每块板之间清洗吸头。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>继续在室温避光条件下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用透明封板膜密封检测板，并使用与检测兼容的酶标仪进行扫描。扫描时设置板与检测器之间的距离为0.2 mm，激发时间为180 ms，检测时间为550 ms。</li>
	<li>将IL-8检测的原始数据导入电子表格。</li>
	<li>对IL-8检测的标准曲线进行自动拟合，然后将每个样本的原始数据转换为pg/mL单位。</li>
</ol>

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。
免责声明：本文所表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国陆军部、美国国防部或美国政府的官方立场。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）与美国陆军化学防御医学研究所（USAMRICD）之间机构间协议的支持，部分研究还得到了美国能源部与美国陆军医学研究与物资司令部（USAMRMC）之间机构间协议通过橡树岭科学与教育研究所管理的美国陆军化学防御医学研究所博士后研究参与计划的资助。

本文介绍了我们为研究氢氟酸（HF）和氯化磷（CP）损伤而建立的高通量角膜上皮细胞筛选模型的方法与结果。同时，我们还展示了针对HF损伤的初次siRNA筛选结果。在建立用于研究化学性眼损伤（TIC）的高通量筛选（HTS）模型过程中，存在诸多挑战。文献中可查到的关于在细胞培养模型中研究HF、氢氟酸（HFA）或CP的方法，对我们的帮助十分有限。大多数 体外 关于氟离子的研究涉及口腔细胞，并使用氟化钠而非HF或HFA（部分示例如下所示，参见28,29）。一些关于该 体外 佩索尼已发表关于支气管上皮细胞暴露于CP的研究 等30最终，我们发现文献中尚无与HF、HFA或CP的高通量筛选（HTS）研究相关的特定方法，与这些有毒物质在HTS中研究相关的绝大多数挑战和变量均需自行开发解决。为确保HTS研究的成功，特别关注实现在时间和大量筛选板之间高度一致的暴露条件。
在细胞培养系统中毒性...

毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质可能迅速造成严重的组织损伤。遗憾的是，目前对毒物所致角膜损伤的治疗仅限于一般性支持措施，尚无针对此类损伤的特异性治疗方法。当前的治疗策略缺乏特异性，主要采用局部治疗，如使用润滑剂、抗生素和睫状肌麻痹剂，待角膜重新上皮化后，再使用抗炎药物（例如，类固醇）1,2。尽管现有的治疗手段已是最优选择，但由于角膜进行性混浊和新生血管形成，患者的长期预后通常较差2,3。
动物模型传统上被用于研究化学物质的毒性并阐明损伤机制。然而，动物实验耗时且成本高昂，同时目前也存在减少动物实验的努力。例如，欧盟的REACH法规（EC 1907/2006）包含旨在减少动物实验的条款，这些条款要求企业共享已有数据，以避免重复开展动物实验，并在实施拟议的动物实验前须获得欧洲化学品管理局的批准。根据REACH法规的规定，动物实验应作为最后手段。此外，欧盟《化妆品法规》（EC 1223/2009）已逐步禁止在动物身上进行化妆品测试。当必须开展动物实验时，应遵循“3R原则”（优化、减少和替代），该原则为实施更人道的动物研究、减少使用动物数量以及在可能的情况下采用非动物替代方法提供了框架。基于上述原因，毒理学领域一直在寻求采用体外（in vitro）检测方法，以深入理解毒性的分子机制，并实现高通量分析4。这是一种功能毒理学方法，通过毒性物质的功能而非仅其化学结构来定义其特性。进一步地，功能毒理基因组学旨在揭示特定基因在毒性物质效应中所起的作用5。随着siRNA技术的应用，现已能够以高通量方式筛选研究基因在毒性物质引起的分子与细胞应答中的功能。siRNA是长度为19–25个核苷酸的双链RNA分子，可利用所有哺乳动物细胞中存在的转录后基因沉默通路6。这类分子为人工合成，设计用于靶向特定基因。当siRNA被导入细胞后，其会被加工处理，其中一条链（即引导链）被装载至RNA诱导的沉默复合体（RISC）中。siRNA引导RISC结合到mRNA分子上的互补区域，进而导致该mRNA被降解，从而降低特定基因的表达水平。随后可在暴露于毒性物质的细胞中研究该基因表达水平降低所产生的影响，以确定该基因在细胞对毒性物质应答过程中的功能。该方法已被用于进一步阐明蓖麻毒素敏感性的机制以及AHR依赖性诱导CYP1A1的机制7,8。
化学恐怖主义风险评估（CTRA）清单和有毒工业化学品（TIC）目录根据化学品的毒性及其在恐怖袭击、战争或工业事故中可能被释放的风险，列出了特定的化学品9。我们正在采用siRNA高通量筛选（HTS）毒物基因组学方法，研究已被认定在恐怖袭击事件中具有高使用风险的CTRA清单中的有毒物质。传统毒理学旨在阐明化学物质对生物体产生的有害效应；然而，我们进一步希望了解其损伤机制，以指导治疗药物和治疗策略的开发，并可能发现可用于药物研发的分子靶点。从某些方面来看，这一研究工作可类比于在药物发现过程中应用高通量siRNA筛选和基于细胞的检测方法10。一个主要区别在于，药物发现通常致力于寻找单一的治疗靶点，而在我们的研究方法中，对于有毒物质暴露的治疗，极不可能存在一个具有高度治疗价值的单一靶点。我们预计，针对有毒物质暴露的有效治疗方案需要采取多方面的综合策略才能实现较高的治疗价值，而毒物基因组学数据可能对构建有效的治疗方案起到关键性的指导作用。
台式自动化将高通量方法引入制药和生物技术行业以外的实验室。 体外 我们研究所的历史研究一直采用传统的低通量检测方法11,12,13近年来，我们实验室已逐步采用台式机器人技术进行高通量siRNA筛选。本文介绍了眼细胞模型的优化以及相关技术的开发。 体外 适用于高通量siRNA筛选的氟化氢（HF）和氯opicrin（CP）暴露方法。我们的目标是鉴定在这些毒物作用下调控细胞损伤的分子。我们所选用的siRNA文库靶点包括G蛋白偶联受体、蛋白激酶、蛋白酶、磷酸酶、离子通道以及其他潜在可成药靶点。HF和CP是通过交叉比对CTRA清单中的试剂与ToxNet工业事故报告，筛选出的在蒸气暴露条件下导致眼部损伤风险最高的物质。9,14. CP（化学式 Cl3CNO2，CAS号76-06-2）最初在第一次世界大战中被用作催泪瓦斯15目前被用作农业熏蒸剂，具有杀线虫、杀菌和杀虫功能16氢氟酸（HF）被用于包括炼油厂中的烷基化反应以及有机化合物的电化学氟化等工艺过程。17. HF（化学式 HF，CAS 编号 62778-11-4）为气体，其水溶液形式为氢氟酸（HFA，CAS 编号 7664-39-3）。因此，我们在细胞暴露模型中选择使用 HFA。研究选用 SV40 大 T 抗原永生化的人角膜上皮细胞系 SV40-HCEC。细胞活力和炎症标志物 IL-8 被选为检测终点，因为参与细胞损伤的靶点应体现在细胞死亡和炎症反应中。具体而言，若某靶点在毒物暴露中发挥保护作用，则当该靶点表达被 siRNA 抑制时，细胞死亡和/或炎性细胞因子的产生应增加；反之，若靶点起负向作用，则结果相反。此外，慢性炎症在暴露后角膜病理过程中似乎发挥作用，干预细胞死亡通路可能改善临床结局2,18.

<table><tbody><tr><td>Bravo液体处理平台</td><td>Agilent或同等产品</td><td>G5409A</td><td></td></tr><tr><td>Bravo平板振荡器</td><td>Agilent或同等产品</td><td>Option 159</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 96LT一次性吸头头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>Option 178</td><td>96通道大吸头移液头单元</td></tr><tr><td>Bravo 96ST一次性吸头头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>Option 177</td><td>96通道小吸头移液头单元</td></tr><tr><td>Bravo 384ST一次性吸头头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>Option 179</td><td>384通道小吸头移液头单元</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &amp;mu;L无菌屏障吸头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &amp;mu;L无菌屏障吸头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &amp;mu;L无菌屏障吸头</td><td>Agilent或同等产品</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire多功能酶标仪</td><td>Perkin Elmer或同等产品</td><td>2300-0000</td><td>配备高功率激光激发的AlphaLISA检测仪</td></tr><tr><td>IL-8（人）AlphaLISA检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer或同等产品</td><td>AL224F</td><td>免洗涤珠基检测法</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus白色384浅孔微孔板</td><td>Perkin Elmer或同等产品</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>13778500</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1减血清培养基</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco或同等产品</td><td>12605010</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments或同等产品</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>置于培养箱内的全自动显微镜</td></tr><tr><td>氯化苦</td><td>Trinity Manufacturing或同等产品</td><td>N/A</td><td>具有急性毒性和刺激性</td></tr><tr><td>DMEM-F12细胞培养基</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>11330-057</td><td>含HEPES</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>1891471</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（细胞培养级）</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>重组人胰岛素（细胞培养级）</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（细胞培养级）</td><td>Invitrogen或同等产品</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松（细胞培养级）</td><td>Sigma或同等产品</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;（细胞培养级）</td><td>Sigma或同等产品</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;（细胞培养级）</td><td>Sigma或同等产品</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon或同等产品</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>噻唑蓝四氮唑溴盐</td><td>Sigma或同等产品</td><td>M5655</td><td>MTT检测底物</td></tr><tr><td>siRNA缓冲液</td><td>Thermo或同等产品</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Corning或同等产品</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150细胞培养瓶</td><td>Corning或同等产品</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2级细胞培养生物安全柜</td><td>Nuaire或同等产品</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL机器人用储液槽</td><td>Thermo或同等产品</td><td>12-565-572&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96孔带挡板自动化储液槽</td><td>Thermo或同等产品</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 mL无菌一次性储存瓶</td><td>Corning或同等产品</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>微孔板热封仪</td><td>Thermo或同等产品</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>微孔板热封膜</td><td>Thermo或同等产品</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>豆蔻素</td><td>Tocris或同等产品</td><td>2509</td><td>抗炎剂，用作阳性对照</td></tr><tr><td>SKF 86002&amp;nbsp;</td><td>Tocris或同等产品</td><td>2008</td><td>抗炎剂，用作阳性对照</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma或同等产品</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48%氢氟酸</td><td>Sigma或同等产品</td><td>339261</td><td>具有腐蚀性和急性毒性</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L单通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L单通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L单通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 12通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 12通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 12通道移液器</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 1000 &amp;mu;L</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 200 &amp;mu;L</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 20 &amp;mu;L</td><td>Rainin或同等产品</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384孔样品储存板</td><td>Thermo或同等产品</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma或同等产品</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>50 mL锥形管</td><td>Thermo或同等产品</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL血清移液管</td><td>Corning或同等产品</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>25 mL血清移液管</td><td>Corning或同等产品</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>10 mL血清移液管</td><td>Corning或同等产品</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>5 mL血清移液管</td><td>Corning或同等产品</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC永生化人角膜上皮细胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>这些细胞不对外销售，但可从本文引用的研究人员处获得</td></tr><tr><td>Sceptor手持式自动细胞计数仪</td><td>Millipore或同等产品</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan多通道（MC）仪器</td><td>Affymetrix或同等产品</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24孔和96孔阵列板</td><td>Affymetrix或同等产品</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger HF管</td><td>Draeger或同等产品</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Draegger CP管</td><td>Draeger或同等产品</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>Draegger泵</td><td>Draeger或同等产品</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>透明板密封膜</td><td>Resesarch Products International或同等产品</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>VistaLab Technologies或同等产品</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS或同等产品</td><td>N/A</td><td>用于自动曲线拟合的Excel插件</td></tr></tbody></table>

高通量sirna筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质有可能迅速造成严重的组织损伤。目前对毒物引起的角膜损伤的治疗通常为支持性治疗，尚无针对此类损伤的特异性治疗药物。为了开发有效的治疗方法和治疗手段，了解这些损伤的分子和细胞机制至关重要。我们提出，利用高通量小干扰RNA（siRNA）筛选可能是一种重要工具，有助于更快地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。siRNA是长度为19-25个核苷酸的双链RNA分子，通过转录后基因沉默途径降解与siRNA具有同源性的mRNA。随后可在暴露于毒物的细胞中研究特定基因表达降低的影响，以确定该基因在细胞对毒物反应中的功能。本文介绍了用于氢氟酸（HF）和氯化苦（CP）引起ocular损伤的体外（in vitro）暴露模型及高通量筛选（HTS）方法的建立与验证。尽管我们选择了这两种毒物作为研究对象，但经过对毒物暴露方案进行少量修改后，我们的方法同样适用于其他毒物的研究。本研究选用SV40大T抗原永生化的人角膜上皮细胞系SV40-HCEC。细胞活力和IL-8的产生被选为筛选方案的终点指标。本文还阐述了在建立适用于HTS研究的毒物暴露和细胞培养方法过程中所面临的若干挑战。建立这些毒物的高通量筛选模型，有助于进一步深入理解损伤机制，并可用于筛选潜在的化学性ocular损伤治疗药物。

暴露方法的开发
我们优化并评估了人角膜上皮细胞系 SV40-HCEC 在高通量筛选（HTS）研究中的适用性。SV40-HCEC 细胞通过 SV-40 大 T 抗原永生化获得，由 Dhanajay Pal23 惠赠。在暴露方法学开发过程中探索的变量过多，无法在此简洁呈现，因此仅展示部分我们认为可能对多种毒性物质具有更广泛适用性的研究结果。
通过加样或培养基更换进行毒物暴露
我们最初尝试通过将5 µL用蒸馏水、生理盐水或培养基稀释的毒物工作液加入到96孔板每个孔中已有的95 µL培养基中，使细胞暴露于目标终浓度。SV4...

高通量小干扰RNA筛选是一种重要工具，有助于更快速地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。本文介绍了用于氢氟酸和氯化苦诱导角膜上皮损伤的高通量筛选暴露模型与方法的建立及验证。

高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

有毒物质引起的ocular损伤是一种真正的ocular急症，因为化学物质可能迅速造成严重的组织损伤。治疗……

本视频展示了我们在角膜上皮细胞毒性损伤模型中进行高通量siRNA筛选的方法。这项工作具有重要意义，因为高通量siRNA筛选是一种经济高效且省时的方法，可用于阐明细胞对毒性物质反应的通路和调控因子。该研究可能有助于进一步理解角膜如何应对毒性物质的侵害。在一次性培养基瓶中，用预热的含有0.5微克/毫升氢化可的松的培养基制备角膜上皮细胞悬液。轻轻旋转瓶子使细胞均匀悬浮，然后倒入自动液体处理仪的轨道摇床巢中的储液槽内。在细胞接种过程中，将细胞悬液置于37摄氏度的加热板上保温。使用自动化液体处理仪，在96孔板中每孔加入70微升培养基，接种密度为每孔一千个细胞。针对每块待研究的siRNA文库板，至少需接种14块96孔板。在接种过程中，持续以每分钟100个循环的速度运行轨道摇床，并在所有步骤中使用每秒50微升的移液速度。在接种第一块培养板之前，使用自动液体处理仪混匀细胞悬液。吸取140微升细胞悬液，向两块细胞培养板的每孔中各分配70微升。重复混匀和分配操作，直至所有培养板均完成细胞接种。根据需要补充细胞悬液储液槽。培养板加样完成后，将其从液体处理仪中取出，在室温下孵育30分钟，随后转移至细胞培养箱中。次日早晨使用位于细胞培养孵育箱内的自动成像系统评估所有培养板的细胞密度。排除培养板内孔中细胞融合度不在15%至22%范围内的实验组。接种细胞24小时后，按如下方法进行转染：每孔加入4皮摩尔的siRNA和0.3微升的转染试剂。从供应商处获取siRNA文库板，配置为每板包含80个siRNA靶点，第一列和第十二列留空。根据生产商说明书，用siRNA缓冲液重新配制siRNA文库板，使每孔siRNA的终浓度为每微升2皮摩尔。所有转染操作均使用自动化液体处理仪，并在所有步骤中采用每秒25微升的移液速度。使用预设的加样提示框，仅对需要转染的孔进行操作。使用文库板的上半部分转染一组六块复制板，称为“上板组”；使用文库板的下半部分转染另一组六块复制板，称为“下板组”。这十二块板共同构成一个完整的板组，每块细胞板均包含相同的对照组。在所有上板组和下板组均完成文库siRNA转染后，对所有板的B2至B6孔转染阴性对照池siRNA。另取两块未加入文库siRNA的培养板，将其中B2至B6孔转染阴性对照siRNA混合物，作为未暴露对照组。所有细胞培养板在加入转染混合物后，于细胞培养箱中孵育4小时，每隔1小时轻轻敲击培养板混匀。使用自动化液体处理仪，用预热的培养基（按1:5比例用PBS稀释）将孔板洗涤两次，并以每孔100 µL预热培养基重新加样。所有步骤均采用每秒50 µL的移液速度。将C2至C6孔用作未转染对照。将B7至B11以及C7至C11的孔保持未转染状态，用作毒性物质暴露实验中的药物和溶剂对照。转染后24小时，使用自动化液体处理仪重新换液。所有步骤中，移液速度均设为每秒50微升。从每个孔中吸出 100 微升液体，并弃入废液槽中。每孔加入 100 微升预热的 H-Cort. 培养基进行换液。根据需要清空废液槽。根据需要向储液槽中补充培养基。转染后两天，在暴露前两小时，用H-Cort.培养基配制62.5微摩尔的阳性对照卡达明（Cardamonin）溶液，并加入8排稀释储液槽的B行。在H-Cort.培养基中配制06.25%的DMSO溶液，并加入同一储液槽的C行。DMSO用作溶剂对照。使用自动化液体处理仪从每块细胞培养板的B7至B11和C7至C11孔中移除10微升培养基，并将其弃至储液板的G行和H行。务必使用预配置的吸头盒，仅处理将要加入阳性对照和载体对照的孔，并在所有步骤中采用每秒50微升的移液速度。向这些孔中转移10微升的阳性对照和载体对照，并混合三次。将这些细胞板放回培养箱。对所有其他细胞板重复上述步骤。所有化学暴露操作均须在化学通风橱中进行，并佩戴双层腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。将接触过氢氟酸的移液器吸头和储液槽，以及任何液态氢氟酸，在排入危险废物处理系统前，均使用2.5%葡萄糖酸钙进行去污处理。针对每一块待检测的文库板，在150毫升瓶中，向80毫升预热的H-Cort.培养基中加入288微升1%氢氟酸，配制0.0036%氢氟酸培养液。轻轻旋转瓶子，将稀释的氢氟酸置于化学通风橱内的37度培养箱中孵育10分钟。将氢氟酸培养基溶液加入到置于板式加热器上的试剂储液槽中。由两名技术人员协同操作完成暴露步骤。让右侧的技术人员使用十二通道移液器从细胞培养板中移除培养基，然后将培养板传递给左侧的技术人员。让左侧的技术人员向每孔加入 100 µL 氢氟酸培养基溶液。对所有需要暴露于毒物的细胞培养板重复此操作。同时，对未暴露的对照组培养皿重复此过程，使用新鲜培养基代替氢氟酸溶液。将培养皿置于化学通风橱内的培养箱中孵育20分钟，然后放回细胞培养箱中。当所有培养皿完成暴露并返回细胞培养箱后，重复之前所示的阳性对照添加步骤。收集细胞培养上清液，并在暴露后24小时使用MTT法检测细胞活力。配制含有10克/升葡萄糖的PBS溶液，其中加入0.5毫克/毫升的MTT底物，并预热至37度。将MTT底物溶液加入自动液体处理系统的储液槽中。所有步骤均使用每秒 50 微升的移液速度。预先配置吸头盒，仅对应需要检测的孔位。使用自动化液体处理设备从细胞板内侧 60 个孔中吸取 95 微升培养基，并将 42.5 微升分别加入两个 384 孔储存板中的对应孔位。立即向细胞培养板的每孔中加入 100 微升 MTT 底物溶液，并在 37 度的细胞培养箱中孵育一小时。密封 384 孔储存板，并于 -80 度保存以用于后续分析。对所有顶部和底部板组及其相应的未暴露对照组重复此过程。根据需要补充 MTT 底物储液。若需在重复样本间重复使用吸头，可在添加 MTT 底物溶液以及在不同培养板组之间切换时进行清洗。在 1 小时孵育后，使用自动化液体处理仪从每块细胞培养板的内侧 60 个孔中移除 MTT 底物溶液，并向每个孔中加入 100 微升 DMSO。所有步骤均使用每秒50微升的移液速度，并预先配置吸头盒，仅针对需要检测的孔进行操作。根据需要清空废液储槽并重新填充DMSO储槽。将板在板式振荡器上振荡三分钟。使用酶标仪在570纳米和690纳米处测定吸光度。将570纳米处的吸光度减去690纳米处的背景吸光度，然后计算未暴露组中每个对照组的吸光度平均值。通过将每个处理组的吸光度值除以未暴露对照组的平均吸光度值，计算细胞存活率百分比。使用平均未暴露的阴性对照组来计算所有靶标的细胞活力百分比。根据生产商说明书，采用无需洗涤的基于微珠的检测方法测定细胞培养上清液中IL-8的浓度。设计检测板布局以容纳样本和标准品。从-80℃冰箱中取出384孔储存板，在室温下解冻。短暂离心以使样品沉降至孔底。向黑色384孔储存板中加入抗IL-8受体珠和生物素化抗体。根据检测板布局，将磁珠-抗体混合物加入指定用于样品和标准曲线的孔中。在含有354 µM氯化钠的培养基中重悬标准品。对标准品进行两倍系列稀释，并以三复孔形式加入另一黑色384孔储存板中。使用自动化液体处理仪进行检测。根据检测板布局，使用预配置的吸头盒对孔位进行加样。所有步骤的移液速度为每秒50微升。将8微升受体珠-抗体混合物转移至白色384孔浅孔检测板中。根据检测板布局，将珠-抗体混合物加入指定用于样品和标准曲线的孔中。随后，将标准曲线样品加入浅孔检测板上的相应孔中。接下来，在浅层储液槽中配制3.54摩尔的氯化钠溶液。通过向黑色384孔储存板中的样品加入4.5微升氯化钠溶液，调节样品的盐浓度，使其与标准曲线的浓度一致。使用30微升的混匀体积将样品重复混匀三次，然后根据检测板布局，将2微升样品转移至白色浅孔检测板中。室温避光孵育1小时。将二抗磁珠加入黑色384孔储存板中。根据检测板布局，将磁珠加入指定用于样品和标准曲线的孔中。根据检测板布局，将10微升的二抗磁珠转移至白色384孔浅孔检测板中用于标准曲线或样品的各孔中。每次移液后需在不同板之间更换吸头。室温避光再孵育一小时。使用透明板封膜将检测板密封，并使用与基于微球的检测兼容的酶标仪进行扫描。扫描时，设置板与检测器之间的距离为0.2毫米，激发时间为180毫秒，检测时间为550毫秒。将IL-8检测的原始数据导入电子表格中。使用自动曲线拟合方法对IL-8检测的标准曲线进行拟合，然后将每个样本的原始数据转换为每毫升皮克（pg/mL）。计算每个目标样本六个重复的平均值，随后计算相对于暴露阴性对照的SSMD值和倍数变化。使用双荧光棒图显示每个靶标的数据，其中x轴表示倍数变化，y轴表示严格稳健的Z值（SSMD）。综上所述，我们已开发出适用于毒物引起眼部损伤的高通量筛选研究的方法和培养条件，并通过在氢氟酸损伤模型中完成siRNA文库的初筛，验证了这些方法的有效性。高通量基因组数据集可极大促进对特定基因在损伤或疾病中所起作用的理解，从而有助于更高效地开展后续的体外或体内研究。

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高通量 SiRNA 筛选氯化苦和氟化氢引起的角膜上皮细胞损伤

本视频介绍了一种 体外 使用基于刃天青的Alamar...

alamarBlue 检测：一种灵敏的荧光法，用于筛选人工泪液配方对人角膜上皮细胞代谢活性的细胞毒性作用

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

我们开发了一种眼刺激性测试方法，该方法采用三维重建的人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该测试能够区分具有眼刺激性或腐蚀性的物质（GHS 第1类和第2类合并）与无需标注分类的物质（GHS...

使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

本研究旨在利用基于阻抗的实时细胞分析仪与基于高内涵筛选（HCS）的平台相结合的方法，评估15种香烟烟雾成分的生物学影响 体外本研究提供了有关受试化合物的有效剂量、毒性和作用机制的信息。...

高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（HPHC）的毒理学效应

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。...

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。...

哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

本方案展示了在小鼠眼表细胞的原代活体培养物中，同时检测活性氧（ROS）、活细胞和死细胞的方法。分别使用2',7'-二氯荧光素双乙酸酯、碘化丙啶和Hoechst染色来评估活性氧、死细胞和活细胞，随后进行成像与分析。...

小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

本文描述了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代细胞系和永生化细胞系毒性的实验步骤。...

测定紫外线辐射和化学物质对原代及永生化人角膜上皮细胞的毒性

本文建立了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮机械性和化学性损伤的研究，以筛选新的治疗方法及其潜在机制。...

Ex Vivo 和 In Vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。...

使用二氢乙啶（DHE）荧光染料高通量筛选评估活性氧（ROS）的生成

利用器官培养的猪角膜和上皮伤口愈合评估治疗和化学毒性

了解高通量siRNA筛选技术在角膜上皮细胞毒性损伤模型中的应用方法。本研究利用自动化液体处理系统建立氯化苦和氟化氢暴露模型，为阐明角膜细胞对毒物的反应机制及开发治疗策略提供重要基础。

高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

探索更多视频