Name: Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Keşfedin çoğaltılmış yapay hücresel mikroçevre dizisi imalatını. Bu yöntem, insan plüripotent kök hücrelerinin davranışlarını yüksek verimli tek hücre profilleme ile incelemek için kullanılır ve kök hücre mühendisliğinde ileri düzey tarama olanakları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Prof. N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto Üniversitesi, insan ES hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Tokyo Teknoloji Enstitüsü'nde atomik kuvvet mikroskobu kullanımında verdiği destek için Prof. A. Maruyama teşekkür. Finansman cömertçe sağlanan Japonya Derneği tarafından bilim promosyon için (JSP'ler; 22350104, 23681028, 25886006 ve 24656502); fon ayrıca yeni enerji ve Endüstriyel teknoloji geliştirme organizasyonu (Ned-o) ve Terumo Life Science Foundation tarafından sağlandı. TEFE-iCeMS dünyanın önde gelen uluslararası araştırma merkezi girişimi (TEFE), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT), Japonya tarafından desteklenir. Bu çalışmanın bir parçası Kyoto Üniversitesi Nanoteknoloji Hub ve "Nanoteknoloji platformu Projesi" MEXT, Japonya sponsorluğunda AIST Nano-işleme tesisinde tarafından desteklenmiştir.

1. MACME dizi imalatı
Not: Tüm malzeme ve ekipmanları malzemeleri tabloda listelenir.
<ol><li>
Nanofiber dizi ve bir kalıp bir mikrosıvısal yapısı için maskeler hazırlanması
	<ol>
<li>Üç boyutlu (3D) görüntüler nanofiber diziler ve 3D-Bilgisayar grafikleri yazılım paketleri (Tablo 1) kullanarak mikrosıvısal yapılar için kalıplar için kullanılan maskeler oluşturmak. Not: 3D görüntü okumak ve bir 3D basımevinde. Yazdırılan maskeleri ve kalıp 1.1.1 bir adımda grafik yazılımı kullanılarak tanımlanmış 3D görüntülerle aynı boyutlara sahip.</li>
		<li>Maskeleri ve bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak bu tasarımları dayalı bir kalıp yazdırın. Not: Bu protokol için bir mürekkep jet gibi 3D printerlere harcama maddeler UV tedavi edilebilir reçine ile kullanılan30' du. Yazıcı çözünürlüğü 635 × 400 dpi ve x, 15 µm oldu Y ve Z, sırasıyla, ancak, gerçek X, Y çözünürlüğü yaklaşık dört kat daha düşük.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nanofiber-dizi hazırlık (Şekil 3A)
	<ol>
<li>Polimer çözümleri electrospinning için hazır olun.<ol>
<li>Tetrahydrofuran ile % 13 PMGI sıvı ile %9 (w/v)22oranında seyreltin.</li>
			<li>PS 0,08 gram dissolve (sayı ortalama molekül ağırlığı (Mn): 130.000) THF:dimethylformamide (1:1 hacim oranı)21ve birimin Son 1 mL (% 8 (w/v) PS çözüm) kadar getirmek için THF:dimethylformamide ekleyin.</li>
			<li>0.1 g gt suda çözülür: asetik asit: etil asetat (1:1.6:2.1 hacim oranı) ve eklemek su: asetik asit: Etil Asetat olarak birimin Son 1 mL (% 10 (w/v) GT çözüm) kadar getirmek için açıklanan23,31.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Makine SAÇTIRMA magnetron kullanın, electrospinning Kur içinde bir katot olarak hizmet veren bir Polistiren (PS) baseplate (127.7 × 85.5 mm), üzerinde 5-nm kalınlığında ince bir platin tabaka Kasası.</li>
		<li>23-G paslanmaz çelik künt iğne ile donatılmış bir 5 mL şırınga içine her Polimer çözüm yükleyin.</li>
		<li>Yer ve çapa 12-cm toplayıcı electrospinning cihazın dışında bir şırınga pompa iğne şırınga.</li>
		<li>Şırınga iğne yüksek voltajlı güç kaynağına bağlayın ve 11'e uygulamak için ayarla kV.</li>
		<li>0.2 mL/h pompalama hızını ayarlayın.</li>
		<li>Sıcaklık ve nem 30 ° C ve < %30 (v/v) tutmak.</li>
		<li>1.2.2 adımda hazırlanan baseplate maskeyi tak.</li>
		<li>Electrospinning zaman değiştirerek farklı yoğunlukları ile maske deliklerden baseplate üzerinde nanofibers imal (örneğin, 20, 60, 90 ve 180 s).</li>
		<li>Maskeyi baseplate kaldırın. Not. Etanol electrospun GT nanofibers GT nanofibers maskesi ile birlikte kapalı soyulması önlemek için maskeyi çıkarmadan önce püskürtülür.</li>
		<li>Adım 1.2.4-1.2.10 nanofiber-dizi imalat tamamlanması kadar yineleyin.</li>
		<li>Nanofiber dizi 16 h için 25 ° C'de bir desiccator içinde kalan solvent buharlaşır için yerleştirin.</li>
		<li>0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) ve 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) 4 h2325 ° C'de etanol içinde Crosslink GT nanofibers.</li>
		<li>16 h için 25 ° C'de GT nanofibers iki kez %99,5 (v/v) etanol ve vakum-kuru ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmalat mikrosıvısal yapıları (Şekil 3B)
	<ol>
<li>Ajan ve PDMS Bankası 20 g kür PDMS 2 g mix (1:10 ağırlık oranı; Pre-PDMS). 24
</li>
		<li>1.2. adımda fabrikasyon kalıp üzerine pre-PDMS karışımı dökün.</li>
		<li>Bir desiccator 30 dk için pre-PDMS karışımı de-gaz.</li>
		<li>Pre-PDMS karışımı için 16 h 65 ° c fırında tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MACME derleme diziler (Şekil 3B)
	<ol>
<li>Adımda 1.3.4 kalıp ve temiz %70 (v/v) etanol ile tedavi PDMS yapısı akasındaki.</li>
		<li>Atmosferik corona deşarj PDMS yapısı32alt tarafında tedavi. Not: Bu protokol için corona bir katman 3 veya 4 kez bir "Kullanışlı" corona deşarj aparatı ile tüm yüzeyi serbesttir. Oksijen Plazma tedavi atmosferik corona deşarj ile yüzey adhesiveness değiştirmek için değiştirildi.</li>
		<li>Nanofiber dizi PDMS yapısıyla hızlı bir şekilde bir araya getirin.</li>
		<li>Fırın-65 ° C de 2 gün boyunca pişir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yükleme hESCs MACME diziye
<ol><li>Xeno-Alerjik hücrelerde kimyasal olarak kültür orta (hPSC orta olarak adlandırılır) 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü34 35-mm hücre kültürü ile takıma hPSC bakım33 için tanımlanan H9 insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rutin kültür için korumak çanak membran jel matris (MG) ile kaplı.</li>
	<li>Geçiş hücreleri her 4-7 gün rekombinant tripsin benzeri proteaz kullanarak.</li>
	<li>MACME dizi ile % 99.5 etanol, salonları 10 min için yükleme tarafından sterilize ve etanol kaldırın. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Mg, 10 µg/mL vitronectin (VN), 12 µL tanıtmak ve %0,1 (w/v) GT denetimine chambers kültür ve odaları odası yüzeylerde kat 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Bu protokol için MG, VN ve GT başvuru proteinler hücre adezyon ve kültür olarak seçildi. Çünkü MG ve VN hPSC öz-yenileme korumak için kullanılan standart hücre kültürü matrisler olumlu denetim kullanılır; iki boyutlu GT kaplama (2DGT) ya da non-kaplama (NC) negatif denetimler olarak kullanılmıştır.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış hPSC orta MACME dizi tüm odaları tanıtmak. Salonları 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Yıkama H9 hESC ile DPBS, 35 mm çanak üzerinde kültürlü rekombinant tripsin benzeri proteaz 0.5 mL yemek için ekleyin ve 1 dk. için 37 ° C'de kuluçkaya ve dikkatli bir şekilde sadece proteaz ile karışık supernatants Aspire edin. Not: Aspirasyon aşamada hücreleri müstakil değil.</li>
	<li>Yavaşça tekrar tekrar hücreleri ayırmak ve müstakil hücreleri 15 mL konik tüp aktarmak için çanak yüzeye karşı orta dağıtmak, hemen hPSC orta ekleyin.</li>
	<li>3 dk. aspiratı süpernatant 200 x g, santrifüj kapasitesi ve önceden ısıtılmış hPSC orta hücrelerde askıya alma.</li>
	<li>Hücre süspansiyon (1,2 × 106 hücre/mL) 12 µL her mikrosıvısal odasına tanıtmak. Not: Hücreleri bir odasına başka bir micropipette kullanarak tanıtmak. Odama seribaşı hücre sayısı odası kat yukarıda sütun yoğunluğu ile orantılı olduğundan, düz-se bile aynı hücre süspansiyon örnekleri kullanılmıştır ilk hücre tohum yoğunluğu denetlenebilecek. Pipetting nazikçe yapılır emin olun. Aşırı orta odalarından bir pamuk uçlu sopa yükledikten sonra kullanarak kaldırın. MACME dizi sık kullanılan laboratuvar Pipetler ve otomatik pipet sistemleri ile uyumludur ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez.</li>
	<li>HPSC orta her 12 h ve kültür için 4 gün değiştirin. Not: Orta sabit birimler (1.6, 3.2 ve 6.4 µL) odaları farklı boyutlarda kullanılarak sürdürülür. Kültür hücreleri kesme hücre kültürü orta35,36alışverişi dışında stres en aza indirmek için statik bir koşul altında.</li>
</ol>3. nicel tek hücreli profil oluşturma
<ol><li>
Plaka üzerinde floresan hücre boyama Not: hPSCs kendini sürekli yenileyen, fenotipik değişiklikler çözümlemek için bu iletişim kuralı için üç anahtar fenotipik işaretleri bu iletişim kuralı seçili: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ve Annexin V pluripotency, yayılmasını önleme ve Apoptozis durumunu ölçmek için , sırasıyla (Şekil 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) hücre çekirdeği tanımlamak için kullanılır. Pluripotent kritik transkripsiyon faktörlerin OCT4 biridir.<ol>
<li>H9 hESCs 30 dk 37 ° C'de 10 µM EdU alkin ile takıma hPSC orta MACME dizilerde kuluçkaya.</li>
		<li>Annexin-bağlama arabellek (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) ile yıkadıktan sonra bir turuncu-floresan boya Annexin V eşlenik 15dk için 20 ° C'de hücrelerle leke.</li>
		<li>PBS hücrelerde 15dk için 20 ° C'de % 4 (v/v) paraformaldehyde ile düzeltmek ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
		<li>PBS ile % 0.3 (v/v) Triton X-100 16 h için 20 ° C'de kullanarak hücreleri permeabilize. Not: Paraformaldehyde plastik taban plakası ve PDMS mikrosıvısal yapısı arasındaki bağı zayıflar. Böylece, dekolmanı adımda 3.2.1 diziden PDMS tabakasının da bu adımdan sonra gerçekleştirilir.</li>
		<li>Kırmızı-floresan boya azid 30 dk 20 ° C'de önbellekle Tris tabanlı reaksiyon hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>Engelleme arabellek (PBS ile %5 (v/v) normal keçi serum, %5 (v/v) normal eşek serum, %3 (w/v) Sığır serum albümin, % 0,1 (v/v) ara-20 ve %0.1 (w/v) N-Lauryl-β-D-maltoside) 16 h için 4 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>%0,5 (v/v) Triton X-100 çözüm ile PBS ve insan OCT3/4 antikor (fare IgG) 16 h için 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Fareyle yeşil-floresan boya etiketli eşek Anti-IgG (H + L) 60 dk 37° C'de engelleme arabellekte kuluçkaya.</li>
		<li>PBS DAPI ile içinde 30 dk 20 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PBS-DAPI PBS ile değiştirin.</li>
		<li>4 ° C'de MACME dizi resim alma kadar korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü edinme (Şekil 4)
	<ol>
<li>MACME dizi PDMS mikrosıvısal yapısından akasındaki.</li>
		<li>Kalan PBS MACME diziden çıkarın, PBS 90%(v/v) gliserol hücrelere uygulayın ve coverslips lekeli hücrenin üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Plaka baş aşağı bir ters floresans mikroskobu sahnede ayarlayın.</li>
		<li>12-bit renkli görüntüler düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop tarafından kontrol (sahne, filtreler, çekim hızı ve odak sistemleri) tüm motorlu bileşenleri kullanılarak otomatik olarak elde. Not. Bu protokol için maksimum yoğunluk değerleri ulaşmak için pozlama süreleri ayarlanır (en yüksek piksel yoğunluğu: 4096), ama yok doygunluk, her görüntü, DAPI, OCT4, Annexin V ve EdU.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bilgisayar destekli görüntü işleme ve floresan sinyal miktar (Şekil 5) Not: aşağıdaki hücre görüntü analizi dayalı bir yukarıda açıklanan Yöntem37olarak gerçekleştirilir.<ol>
<li>Renkli görüntüler gri tonlamaya dönüştürme.</li>
		<li>Otsu yöntemi ile her DAPI görüntü için bir tek eşik değerini hesaplamak ve piksel olarak ön plan ve aşağıda eşiğin sınıflandırmak arka plan olarak. Ön plan değeri DAPI floresan yoğunluğu uygun olmasını sağlamak. Not: Görüntü analiz süreci 5 adım içerir; birincil nesneleri DAPI tanımlaması görüntüler, OCT4, Annexin V ve EdU görüntüleri, ikincil nesneler tanımlaması sırasıyla ve nesne yoğunluğu ölçümü. Şekil 3 görüntü işleme ayarda görüntüleri grafik kullanıcı arabirim (GUI) sağlar.</li>
		<li>Her resmin üzerine OCT4 ve EdU yoğunluklarda floresan ölçmek.</li>
		<li>Annexin V ile yayılma yöntemi ile lekeli bölgeyi tanımlamak ve floresan yoğunluğu ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3.4. istatistiksel analiz bireysel hücresel fenotipleri tek hücreli görüntüleme üzerinde görselleştirmek için
	<ol>
<li>Her fenotipik işaretçisi giriş floresan yoğunluklarda merkezleme ve eşit ağırlık vermeyi bu değişkenler ölçekleme normalleştirmek.</li>
		<li>Kendiliğinden organize harita (SOM) analizi istatistiksel bilgi işlem ve önceki çalışmalar38,39tarafından açıklandığı gibi grafik için bir yazılım ortamı kullanarak gerçekleştirin.<ol>
<li>"Dört işaretleri, DAPI, EdU, Annexin V ve OCT4 floresan yoğunluklarda karşılık gelen kendine özgü dört kitabında vektörel çizimler" ile 25 SOM düğümleri oluşturur.</li>
			<li>Her microenvironment tek tek hücreleri "kazanan" (en çok benzeyen) düğüme atamak ve arsa göre kazanan düğümün kitabında vektörel çizimler ağırlıklı ortalama ağırlığı öğrenme oranı nerede kullanarak güncelleştirilmiş hücre frekans (burada, 0,05 olarak varsayılan). Not: Verileri veri kümeleri birkaç hücreleri içeren istatistiksel SOM sonuç vermedi çünkü az 1.000 hücreleri içeren odalarından dışarıda.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Denetimsiz hiyerarşik kümeleme tarafından kümeleme yazılımı40Pearson korelasyon dayalı ortalama-bağlantı yöntemini kullanarak SOM-düğüm değerleri ile gerçekleştirin.</li>
		<li>Küme veri dendrogram ve heatmap sayısı41işlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Bu iletişim kuralı nitelikli hPSCs bakım için sağlam kültür sistem kurmak için ilk tarama yöntemi gösterir. İlk olarak, nasıl farklı yapay ECMs ve hücre yoğunluğu ile a nanofiber düzenlemek, MACME dizi entegre bir mikrosıvısal aygıtını kullanarak tohum bir platform hazırlamak için nitelendirdi. İkinci, nicel yansıma tabanlı tek hücreli fenotipleme bireysel hücresel sonuçları ve farklı biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri tarafından değiştirilmiş davranışları değerlendirmek için gerçekleştirilen50</s...

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs)1,2 unlimitedly kendi kendini yenilemek ve ilaç geliştirme, hücre tabanlı terapiler, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp devrim olabilir çeşitli doku soy, ayırt etmek 3 , 4 , 5 , 6. genel kültür yemekleri ve microtiter levha, ancak, tasarlanmamıştır hücresel genişleme için kritik bir faktör olduğunu, kesin fiziksel ve kimyasal hücre manipülasyon ile sıra nano - için mikro-metre, hücresel düzeyde etkinleştirmek için kendini yenileme ve farklılaşma. Bu dezavantajı yönelik olarak çalışmalar hücre-kader karar ve hücre fonksiyonları4düzenlenmesinde hücresel microenvironments rolleri araştırdı. Son yıllarda, hücresel microenvironments vitro7,8yeniden oluşturmak için giderek artan sayıda çalışmalar yapılmıştır. Nano ve mikro imalat işlemleri bu microenvironments kimyasal9,10,11,12,13manipülasyonu yoluyla kurduk, 14,15,16,17 ve fiziksel18,19,20 çevre ipuçları. Şimdiye kadar sistematik olarak kimyasal ve fiziksel çevre yardımlar hücre-kader karar ve fonksiyonları içinde tek bir platform üzerinde temel mekanizmaları araştırmak için hiçbir raporlar vardı.
Burada, bir güçlü tarama platform (Şekil 1) kurmak için basit tasarım ilkelerine dayanan bir strateji tanıtmak. İlk olarak, çok yönlü, yapay hücresel microenvironments nanofiber dizi ve bir mikrosıvısal yapısı kullanarak oluşturmak için entegre bir platform geliştirme prosedürü açıklamak: Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi (Şekil 1A ve 2A). Nanofiber dizi nanofiber malzeme ve yoğunlukları farklı kombinasyonlarda 12 farklı microenvironments var. Electrospinning nanofibers imal etmek kullanıldı. Nanofiber malzemeleri, polistiren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22ve jelatin (GT)23, gibi hücre adezyon ve pluripotency ( bakımından etkileyebilecek kimyasal özelliklerini test etmek için tasarlanmıştır Şekil 2B). Nanofiber yoğunlukları çeşitli electrospinning zaman değiştirerek ve oluşturulan nanofibers onların yoğunlukları göre tanımlanmış (DNF, d = XLow/düşük/orta/yüksek). Mikrosıvısal yapısı 96-şey Mikroplaka standart boyut üzerinde konumlandırılmış olabilir 48 hücre kültürü chambers, yataklık polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. PDMS mikrosıvısal cihazlar24imal etmek genellikle kullanılan biyouyumlu ve gaz değiştirilebilen bir polimerdir. Her mikrosıvısal kanal 700-µm olarak tasarlanmıştır geniş ve 8.4 mm uzun ve kenarlarından (Tablo 1), iki giriş vardı. Odalar farklı yükseklikte vardı (250, 500 ve 1000 µm) hangi hayatta kalma, yayılması ve hPSCs25 farklılaşma ile ilişkilendirmek ilk hücre tohum yoğunlukları (0,3 0,6 ve 1,2 × 105 hücreleri/cm2), işlemek (Şekil 2C). Bir odaya seribaşı hücre sayısı sütun yoğunluğu odası kat yukarıda orantılıdır ve böylece ilk hücre yoğunluğu tohum kültür chambers ile farklı yükseklikte içine aynı hücre süspansiyon tanıtımı tarafından kontrol ediliyordu. Tüm kanallar ≥ 250-µm-yüksek26 hücreleri düşük oksijen gerginlik27 ve yamultma stres28 etkilerini en aza indirmek için tasarlanmıştır. 250, 500 ve 1000 µm kanal yüksekten burada kısaltılmış olarak XCD x = düşük, orta ve yüksek, anılan sıraya göre. Farklı nanofiber yoğunlukları ve ilk hücre tohum yoğunlukları ortamlarıyla "Material_NF density_Cell yoğunluğu" kısaltılmış (örneğin, GT_HighNF_HighCD: yüksek yoğunluklu GT nanofibers ve yüksek ilk hücre tohum ile karakterize bir ortam yoğunluk).
Daha sonra sistematik olarak hücre davranış çevresel faktörler (Şekil 1B) yanıt olarak araştırmak için tek hücreli çözümlemesi yapma nasıl açıklar. Bir kanıtı-of-concept olarak, biz en iyi hücresel ortam hPSC öz-yenileme, hangi hPSC bakım (Şekil 1B)29tuşu fonksiyonu tanımlanır. İstatistiksel analizler tarafından takip, yansıma tabanlı sitometresi bireysel hücresel fenotipik yanıt-e doğru hücresel ortamlar nicel yorumu sağlar. Çeşitli hücresel işlevler arasında bu kağıt hPSC öz-yenileme korumak için en uygun koşulları tanımlamak için detaylı bir yordam içermektedir.

<table><tbody><tr><td>Polistiren (PS)</td><td>Sigma</td><td>#182435</td><td>Ortalama Mw: 290.000, ortalama Mn: 130.000</td></tr><tr><td>Polimetilglutarimid (PMGI)</td><td>MicroChem</td><td>G113113</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin (GT)</td><td>Sigma</td><td>G2625</td><td>Domuz derisinden, A tipi</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td>Doe Corning Toray</td><td>#1064291</td><td>PDMS kürleme maddesi ve silikon elastomer taban bu kitin bileşenleridir.</td></tr><tr><td>OpenSCAD</td><td></td><td></td><td>Bu, mikroakışkan cihazın kalıbını tasarlamak için kullanılan ücretsiz bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (http://www.openscad.org/).</td></tr><tr><td>AutoCAD 2014</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Bu, nanofiber dizi hazırlamada kullanılan maskenin tasarımı için kullanılan bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview).</td></tr><tr><td>3D yazıcı, AGILISTA-3000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV ile kürlenebilen reçine, AR-M2</td><td>Keyence</td><td></td><td>Bu, Agilista tarafından 3D baskı için kullanılır.</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma</td> <td># 338826</td><td>&ge; % 99,99</td></tr> <tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma</td> <td># 270989</td><td>Susuz,% 99,8</td></tr> <tr><td>Tetrahidrofuran (THF)</td> <td>Sigma</td> <td># 401757</td><td></td></tr><tr><td>MSP-30T</td><td>Vakum Cihazı</td><td></td><td>Magnetron püskürtme makinesi</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 242811</td><td>Bu, nanofiber dizisinin oluşturulduğu bir polistiren taban plakasıdır. Bu plaka boyutu tipik olarak 127,7 x 85,5 mm'dir.</td></tr><tr><td>Tabanca tipi korona deşarj makinesi</td><td>Shinko Electric & Enstrümantasyon</td><td>CFG-500</td><td>Bu kullanışlı cihaz, protokoldeki 1.5 "MACME dizilerinin montajı" adımında PDMS katmanının alt yüzeyinin aktivasyonu için korona oluşturmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik künt iğne (23 gauge)</td><td>Nipro</td> <td># 2166</td><td>Dış çap ve uzunluk sırasıyla 0,6 ve 32 mm'dir.</td></tr><tr><td>Yüksek voltajlı güç kaynağı</td><td>TechDempaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid, hidroklorür</td><td>Dojindo</td><td>W001</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroksisüksinimid</td><td>Sigma</td> <td># 56480</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC Nitelikli Matris</td><td>Corning</td> <td># 354277</td><td>Bu protein protokolde bazal membran jel matrisi olarak adlandırılır.</td></tr><tr><td>CellStick Vitronektin, İnsan, Çözüm</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td> <td># 07004</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td> <td># 05940</td><td>İnsan ES ve iPS hücrelerinin bakımı için besleyici içermeyen, kseno içermeyen kültür ortamı</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td> <td># 253-00513</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1X), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 12605028</td><td>Bu, yapışık memeli hücrelerinin ayrışması için rekombinant tripsin benzeri bir proteazdır.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ile Click-iT EdU Görüntüleme Kiti Azides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10086</td><td>Plaka üzerinde floresan boyamada çoğalan hücrelerin floresan etiketlemesi, bu kitin ürün kılavuzu boyunca gerçekleştirilmiştir.</td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 594 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13203</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antikor (C-10)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-5279</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare IgG H & L (DyLight 488)</td><td>abcam</td><td>ab96875</td><td>Bu, plaka üstü floresan hücre boyamada kullanılan ikincil bir antikordur.</td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Bu, CFI Plan Fluor 4&times;/0.13 NA objektif lens (Nikon), CCD kamera (ORCA-R2, Hamamatsu), cıva lambası (Intensilight, Nikon), XYZ otomatik tabla (enkoderli Ti-S-ER motorlu tabla, Nikon) ve dört floresan kanalı (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>Bu, otomatik görüntü elde etmek için kullanılan bir mikroskop görüntüleme yazılımıdır.</td></tr><tr><td>CellProfiler, Sürüm 2.1.0</td><td></td><td></td><td>Bu, hücre görüntü analizi (http://cellprofiler.org/) için ücretsiz bir açık yazılımdır.</td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>SOM analizi bu yazılımın kohonen paketi ile gerçekleştirilir. Bu ücretsiz olarak kullanılabilir (https://www.r-project.org/).</td></tr><tr><td>Küme 3.0</td><td></td><td></td><td>Bu, açık kaynaklı kümeleme yazılımıdır (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Bu yazılım ile denetimsiz hiyerarşik kümeleme gerçekleştirilir.</td></tr><tr><td>Java TreeView</td><td></td><td></td><td>Bu açık kaynaklı yazılım (http://jtreeview.sourceforge.net/), kümeleme verilerini bir ısı haritası ve bir dendrogram olarak görselleştirmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>H9 insan embriyonik kök hücre</td><td>WiCell Kök Hücre Bankası</td><td>WA09</td><td></td></tr></tbody></table>

Çoğaltılmış yapay hücresel microenvironment dizi imalatı

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Hücresel microenvironments büyüme faktörleri, hücre dışı matrisler ve hücreler arası etkileşimleri gibi yardımlar çeşitli oluşur. Bu cues de orkestra ve canlı bir sistem içinde hücre fonksiyonları düzenlenmesinde önemlidir. Her ne kadar bir dizi araştırmacılar çevresel faktörler ve istenen hücresel işlevler arasındaki ilişkiyi araştırmak için çalıştılar, pek bilinmeyen kalır. Bu büyük ölçüde bu tür çevre ipuçları vitrotaklit ve aynı anda farklı çevresel yardımlar hücreleri üzerinde test için uygun bir metodoloji eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, entegre bir platform mikrosıvısal kanalları ve yüksek-içerik tek hücre analizi, kök hücre fenotipleri farklı çevresel faktörler tarafından değiştirilmiş incelemek için ardından bir nanofiber dizi raporu. Bu platform uygulama göstermek için bu çalışma insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) kendini sürekli yenileyen fenotipleri üzerinde duruluyor. Burada, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi imalatı nanofiber dizi veya mikrosıvısal yapısı için hazırlık yordamlarını mevcut. Ayrıca, profil oluşturma, hücre birden çok floresan işaretleri, birden çok floresan görüntü ve istatistiksel analizler, boyama tek hücrenin genel adımlar açıklanmaktadır.

MACME diziler: tasarım ve üretim: Nanofiber teknolojisi ile birlikte, biz mikrosıvısal hücre kültürü ve önce hPSC öz-yenileme veya farklılaşma35,36 (Şekil 1) için en iyi koşulları tanımlamak için istihdam teknikleri eleme kullanılır. Bu hücre kültür odalar ve koşulları tam olarak kontrol edilebilir ve Genişletilebilir42,43<sup...

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Bu yöntem, kök hücre mühendisliği alanında, hücresel mikro çevrenin hücresel fenotipleri ve işlevi nasıl değiştirdiği gibi önemli bir soruya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mikro temaslı plakada geleneksel bir yöntemle gerçekleştiremeyeceğiniz tek bir plakadaki hücreler için çoklu yapay olarak oluşturulmuş ortamı sağlamasıdır ve bu prosedürü laboratuvarımızdan Koki Yoshimoto ve Risako Sakai teknisyenleri gösterecektir. Metin protokolüne göre mikroakışkan yapılardan nano fiber diziler ve kalıplar için maskelerin 3D görüntülerini oluşturduktan sonra.Maskeleri ve kalıbı yazdırmak için bir 3D yazıcı kullanın. Elektro eğirme için polimer çözeltileri hazırlamak için, yüzde 13 PMGI sıvısını tetrahidrofuran ile yüzde dokuza seyreltin. 0.08 gram PS'yi THF'nin dimetilformamide bire bir hacim oranında çözün ve hacmi, hacim PS çözeltisi başına ağırlığın yüzde sekizlik son bir mililitresine getirmek için sıvı bir regent kullanın.0.1 gram GT'yi su, asidik asit ve etil asetat içinde çözün ve hacmi hacimce yüzde 10 GT çözeltisinin son bir mililitresine getirmek için karışık çözücü çözeltisini kullanın. Daha sonra, bir magnetron püskürtme makinesi kullanarak, elektro eğirme kurulu

fabrication-multiplexed-artificial-cellular-microenvironment

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Hücresel fonksiyonları üzerinde mikro moleküler bileşim etkileri ilgili bilgi sağlamak için bir kombinatoryal fonksiyonel tarama yöntemi tarif edilmektedir. Yöntemi hücre yapışması ve fonksiyonel analiz destekleyen tanımlı Kombinatoryal mikroçevrelerde diziler oluşturmak için varolan mikroarray tabanlı teknolojileri yararlanır.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.

Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey

Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Burada sunulan yöntemin amacı, mikroortam mikrodiziler (Mema) nasıl imal edilebilir ve kültürlü hücrelerin fenotürü üzerinde basit Kombinatoryal mikroortamlar binlerce etkisini sorgulamak için kullanılan göstermek için.

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Keşfedin çoğaltılmış yapay hücresel mikroçevre dizisi imalatını. Bu yöntem, insan plüripotent kök hücrelerinin davranışlarını yüksek verimli tek hücre profilleme ile incelemek için kullanılır ve kök hücre mühendisliğinde ileri düzey tarama olanakları sunar.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Daha fazla video keşfet