Name: Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, fare vestibüler ve işitsel duyu organları için üç boyutlu organotipik kültür yöntemini. Bu teknik, iç kulak gelişiminde mekanik ve moleküler sinyalleşmeyi incelemek için sağlam bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi ve A. Petelski bu protokolü dayandığı orijinal araştırma katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Biz ayrıca J. Llamas ve W. Makmura teknik yardım ve Hayvancılık için teşekkür ederiz. NIDCD eğitim grant T32 DC009975, NIDCD R01DC015530, Robertson terapötik Geliştirme Fonu ve finansmanı için Caruso Aile Vakfı Hibe etmiş oluyorsunuz. Son olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Dr. Hudspeth bir araştırmacı olduğu, desteğinden anıyoruz.

Tüm yöntem tanımlamak burada Güney Kaliforniya Üniversitesi ve hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. (isteğe bağlı) kolajen hazırlanması ben eriyik--dan Mouse-tail tendonlar
Not: Kollajen ben ticari olarak kullanılabilir çözümlerdir. Jel hazırlık için üreticinin yönergelerini izleyin.
<ol><li>5-10 Genç Yetişkin (3-5 hafta eski) fare ile karbon dioksit ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi16tarafından onaylanmış protokol uyarınca herhangi bir vahşi türü baskı ötenazi. Kuyrukları toplamak ve onları 4 h, oda sıcaklığında en az % 70 etanol içinde batış tarafından dezenfekte. Not: O aşırı doku dehydration içinde sonuçları ve tendon ayıklama işlemi engellemektedir kuluçka için 48 h üzerinden kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Cilt her kuyruk boyuna kesilmiş bir neşter bıçakla tanıtan ve tüm cilt forseps ile geri çeker çıkarın. Derisi yüzülmüş kuyrukları temiz % 70 etanol ile dolu ve 10 mm parça halinde kesin 100-mm Petri kabına aktarın. Not: İşlemek zor olan kuyrukları, en ince parçalarını atın.</li>
	<li>Forseps kullanarak, her kesimi Petri kabına altına kuyruk güvenli ve iyi forseps ikinci bir çifti tendonlar kuyruk bir teker teker ayıklamak için kullanın. Bireysel tendon lifleri ile en az direnç ortaya. Not: Eski, sıkıcı #5 forseps iş de bu adım için.</li>
	<li>100 mL steril, moleküler düzeyde su asetik asit (cilt tarafından) bir % 0,1 çözeltisi hazırlamak ve bu çözüm 10 mL steril 100-mm Petri kabına için ekleyin. Tendon Petri kabına aktarın ve ben bırakın kollajen denatüre için oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>Steril neşter ya da iridectomy makas künt, kavisli ipuçları ile 1-2 mm parçalara tendon kıyma için kullanın. Steril bir 50 mL tüp kıyılmış tendon transferi ve birim için 50 mL getirmek için % 0,1 asetik asit ekleyin. Not: Dört kullanın veya beş kuyrukları için her 50 mL asit bir kollajen ulaşmak için de ben 2.0-2.5 mg/mL konsantrasyonu.</li>
	<li>Kollajen soğutmak ben çözüm tam protein denatürasyon kolaylaştırmak için 48 saat en az 4 ° C'de. Girdap masa üstü bir girdap ile günde iki kez 1 dk. için maksimal hıza ayarlayın.</li>
	<li>Bicinchoninic asit tahlil kullanarak çözüm protein konsantrasyonu ölçmek, kollajen ayarlamak ben 4 ° C'de % 0,1 çözüm, asetik asit, mağaza ekleyerek 2.0-2.5 mg/ml konsantrasyonu Not: Kollajen ben çözüm bir iki yıl boyunca saklanabilir.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Kollajen santrifüj kapasitesi ben 2.000 x g 1 h 4 ° C ve optik net kollajen ulaşmak için yarı saydam üst kesir (yaklaşık yarısı birimin), Bölüm 4'te jelleri kullanım için bir çözüm.</li>
</ol>2. diseksiyon vestibüler ve işitme organları
<ol><li>Herhangi bir baskı ile ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi16tarafından onaylanmış protokol uyarınca karbon dioksit hamile fareler ötenazi. Hulâsa ve embriyoların başını kesmek. Not: Lfng-CreERT2/tdTomato fareler kalıcı hücreleri maruz 4-hydroxytamoxifen17üzerine destekleme etiketleme izin vermek için kullanılabilir.</li>
	<li>Tüm çalışma yüzeyleri ve diseksiyon aletleri, % 70 etanol ile temizleyerek #5 forseps ve bir saç bıçak18, iki çift de dahil olmak üzere sterilize.</li>
	<li>İki yarım bir boyuna kesim bir steril neşter bıçakla tanıtan veya iki çift #5 forseps kullanarak her kafasından bölün. İç kulak19içeren, temporal kemik ayıklamak ve buz gibi Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 60 mm Petri kabına içinde 15 mL içine koyun. Buz üzerinde çanak tutmak. Not: Embriyo aşamalara E13.5 gelen E18.5 bir mesafeden başarıyla kullanılmaktadır.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Yavaşça onları 30 mL içeren 50 mL konik tüp içinde sallayarak iç kulak yıkama buz gibi HBSS ve HBSS üç ya da dört kez değiştirme. Tüp buz üzerinde tutun. Not: Bu adım doku kültürü olası bulaşma sınırlar ve hızlı sıcaklık 4 ° C, doku bozulması ve hücre ölüm önleyen getiriyor.</li>
	<li>İki çift iyi #5 forseps kullanarak, iç kulak şakak kemiğinden ayrı ve kulaklar, üç veya dört teker, 60 mm Petri kabına buz gibi HBSS ile dolu içine transfer.</li>
	<li>Vestibüler duyu organları incelemek.<ol>
<li>Kadar kulakları medial tarafa yönlendirmek ve utricle bulun. #5 forseps iki çift ile vestibüler organları çevreleyen kıkırdak kaldırın. Yavaşça vestibular sinir, utricle ve saccule ve semisirküler kanallar arasında bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever. Utricle ve üstün ve yatay semisirküler kanallar kulağından ekli ampullae yavaşça çekin. Not: Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış iç kulaklara Etap E16.5 - E18.5. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koklea incelemek.<ol>
<li>#5 forseps iki çift ile işitme organı çevreleyen kıkırdak dokuyu. Yavaşça koklear Bankası ve saccule arasındaki bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever. Not: İç davranarak aşamaları E13.5 - E14.5, kıkırdak diseksiyon önce yumuşatmak için kulaklar %0.25 collagenase ile ben fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm için oda sıcaklığında 5 dk içinde. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200-µL damlalıklı kullanarak geniş yapışmaz bir ucu ile donatılmış, utricles ve cochleae DMEM/F12 33 mM Dglucose, 19 mM sodyum bikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - ile desteklenmiş oluşan büyüme orta dolu 30 mm Petri kabına aktarın 1piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nikotinamid, 20 mg/L epidermal büyüme faktörü, 20 mg/L fibroblast büyüme faktörü, 10 mg/L insülin, 5.5 mg/L transferrin ve 5 µg/L Sodyum selenit.</li>
	<li>Kesim sırasında diseksiyon tanıttı epitel içinde şifa izin vermek için en fazla 3 saat % 5 karbon dioksit ile benzin bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de utricle hazırlıkları korumak. Koklea hazırlıklar kollajen jel 10 dk sonra diseksiyon aktarılmalıdır. Not: Diseksiyon buz gibi HBSS gerçekleştirildiğinden, 37 ° c büyüme ortamına önceden ısıtmak için gerek yoktur</li>
</ol>3. (isteğe bağlı) kolajen ayarlamak değişen kondrosit konsantrasyonları ekleyerek sertlik jel
Not: Kondrosit yalıtım için yöntem Gosset vd. güncellenmiştir 20
<ol><li>Collagenase % 1 çözeltisi hazırlamak ben PBS ve mağaza 100-200 µL aliquots-80 ° C'de x steril 1 Gerektiğinde buza defrost, birden çok donma-çözülme çevrimleri kaçınarak.</li>
	<li>Kullanım iyi forseps 10-12 kulakları vestibüler ve işitsel organ diseksiyon üzerinden kalan kıkırdak parçaları toplamak için. Ayrı bağ ve iç kulak dokulardan kıkırdak. Kıkırdak için 30 mm Petri kabına aktarmak ve steril büyüme ortamının 300 µL ekleyin.</li>
	<li>Steril neşter bıçak veya iridectomy makas künt eğri ipuçları ile doku kıkırdak parçaları yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda ulaşmak için bin dereden su getirmek için kullanın.</li>
	<li>Collagenase ekleyin ben son enzim konsantrasyonu % 0.25 ulaşmak için kıkırdak ile orta. Çanak doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de aktarın. Kıkırdak parçaları ayırmak ve artık çözümde ayırdedilebilir kadar şiddetle 1.000 µL damlalıklı her 20 dk kullanarak damlalıklı sonra bir ek 20 dk için kuluçkaya. Not: Utricle hazırlıkları durumunda, kondrosit yalıtım adım sırasında 2,9 gerçekleştirilebilir; yaklaşık 2 saat (3-4 pipetting mermi) alır.</li>
	<li>15 mL konik tüp hücre süspansiyon toplamak ve 10 ml steril 1 x PBS ile ses seviyesini. 4 ° C'de 5 min için 800 x g, santrifüj Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril 1 x PBS hücrelerde resuspend. Vasıl 800 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Not: Hücreleri iki kez yıkamak için önemlidir; kalan herhangi bir collagenase ben jel kollajen sindirmek.</li>
	<li>200-µL damlalıklı kullanarak, kültür ortamının 100 µL hücre Pelet ve damlalıklı yavaşça resuspend ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve kullanmadan buz önce üzerinde proje.</li>
	<li>Jel sertlik artırmak için kondrosit jel çözüm (Bölüm 1) ve hızla karıştırın etkisiz kollajen için eklemek hücreleri katılaşma önce jel boyunca dağıtmak için. Not: Elastik modül kollajen (sertlik ölçümü) jel, kondrosit sayısı ile doğrusal olarak artar ekledi11. İlişkinin deneysel olarak kararlı doğrusal fonksiyon E tarafından anlatılan 206· = NC + 15 E paskal ve Nc elastik modül olan, milyonlarca kondrosit sayısıdır. Jel için detaylı bir protokol sertlik ölçümleri lütfen Orijinal Makale11' e bakın.</li>
</ol>4. ben jel bir kollajen vestibüler veya işitme duyu organı yerleştirin
<ol><li>Steril bir 1.5 mL tüp içinde kollajen hazırlamak ben 10 x PBS fenol red pH göstergesi, 133 µL 0,34 M sodyum hidroksit, 70 µL 0.9 M sodyum bikarbonat ve 1 M HEPES 40 µL 160 µL karıştırma tarafından polimerizasyon çözüm. Tüp buz üzerinde tutun. Not: Bu tarifi 2 mL jel, ama gerektiği gibi ölçeklendirilebilir kollajen hazırlamak için gerekli olan polimerizasyon çözüm sağlar.</li>
	<li>Mix 100 µL polimerizasyon çözüm ve kollajen 400 µL ben çözüm yavaşça yukarı ve aşağı bir soğutulmuş 1.5 mL tüp içinde pipetting tarafından buz üzerinde. Jel sertlik artırmak için büyüme ortamının kondrosit içeren 50 µL ve Bölüm 3'te açıklandığı gibi hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Etkisiz kollajen 500 µL aktarım ben çözüm soğutulmuş 30 mm Petri kabına 10 mm cam alt eklemek veya bir dört-şey plaka bir kuyu. Not: Hızlı ve düzensiz polimerizasyon kollajen önlemek için buz üzerinde tüm reaktifler tutmak için önemlidir ben.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde cochleae veya utricles etkisiz kollajen transfer ben çözüm ve istenen konumlarını bir steril saç bıçak18 ya da iyi forseps çifti ile organları ayarlayın. Not: Kollajen ben çözüm bulanık hale geldikçe polimerizasyon 1-2 dakika sonra fark olur.</li>
	<li>Sonra doku etrafında çözüm polimerli, Petri kabına veya dört-şey plaka 20 min için bir doku kültürü kuluçka eksiksiz polimerizasyon sağlamak için % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de yerleştirin.</li>
	<li>Petri kabına veya aynı orta iyi bir dört-şey plaka başına 500 µL % 0.5 fetal Sığır serum ile (FBS) takıma büyüme orta 3 mL ekleyin. Kültür bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de korumak. İstenirse, büyüme orta ile 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) Proliferasyona hücreleri etiketlemek için ek. Not: Daha yüksek FBS konsantrasyonları istenirse kullanılabilir.</li>
</ol>5. viral enjeksiyonları vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürleri
<ol><li>Buz üzerinde istenen virüs defrost ve trypan mavi çözüm % 0.05 son boya konsantrasyon elde etmek için bir 0.5 mL konik tüp ile karıştırın. 10-20 x boya önemli seyreltme virüs önlemek için kullanın. Buz üstünde tutun. Not: Adenovirus serotip 5 işleri en iyi virüs Anc80 adeno ilişkili her iki saç hücreleri enfekte olabilir, ancak utricle19, destek hücreleri bulaşmasını ve utricle ve koklea21hücreleri desteklemek.</li>
	<li>Bir micropipette çektirmenin bir binoküler mikroskop dissekan en yüksek büyütme oranında kesilmediğini gözleyerek temiz iyi forseps ile hazırlanan cam iğne ucu kır. Not: İğne çektirme ayarları optimize etmek önemlidir. 9 - 12 mm shanks iğne ve 20 - 30 µm açıklıklar en iyi çalışır.</li>
	<li>Bir organ duyusal kültür kuluçka makinesi kaldırın. İğne için microinjector ekleyin ve 2-3 µL boya ve virüs karışımı ile doldurun. İğne duyusal organ binoküler mikroskop dissekan altında kesilmediğini gözleyerek ilerlemek.</li>
	<li>Yavaşça iğne ucu üç boyutlu bir utricular kültür çatı epitelyal ve mezenkimal katmanı üzerinden götürmek. Mavi boya ile utricle ve ampullae boşluklar doldurana kadar viral karışımı enjekte et. Not: Çünkü duyu organları kolay erişim sağlar, 10 mm cam alt Petri kabına enjeksiyonlar için en iyi yöntemdir.</li>
	<li>Bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Kırmızı veya yeşil flüoresan protein viral yapı içinde kullanıldığında, floresans belirgin 24 saat sonra virüs iletim var.</li>
</ol>

<ol><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).</li>
<li>Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+proliferation+in+inner+ear+sensory+epithelia+from+adult+guinea+pigs+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans.</a> Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).</li>
<li>Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Notch+activity+promotes+nonmitotic+regeneration+of+hair+cells+in+the+adult+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+the+Notch+and+Wnt+signaling+pathways+promotes+supporting+cell+proliferation+and+hair+cell+regeneration+in+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles.</a> Sci Rep. 6, 29418(2016).</li>
<li>Chai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+induces+proliferation+of+sensory+precursors+in+the+postnatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+cells+regenerate+hair+cells+via+proliferation+and+direct+transdifferentiation+in+damaged+neonatal+mouse+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle.</a> Nat Commun. 6, 6613(2015).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+is+required+for+regenerative+proliferation+in+the+cochlea%3A+conservation+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals.</a> Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).</li>
<li>Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+force+restricts+growth+of+the+murine+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Elastic force restricts growth of the murine utricle.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Aragona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+checkpoint+controls+multicellular+growth+through+YAP%2FTAZ+regulation+by+actin-processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors.</a> Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+universal+size-control+mechanism+in+Drosophila+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals.</a> Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).</li>
<li>Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+as+mechanosensors+and+mechanotransducers+in+regulating+organ+size+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth.</a> FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , (2013).</li>
<li>Semerci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lunatic+fringe-mediated+Notch+signaling+regulates+adult+hippocampal+neural+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/series/7651">Methods in molecular biology</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).</li>
<li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+mouse+utricle+and+adenovirus-mediated+supporting-cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection.</a> J Vis Exp JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+phenotyping+of+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Burns, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcement+of+cell+junctions+correlates+with+the+absence+of+hair+cell+regeneration+in+mammals+and+its+occurrence+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).</li>
<li>Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li>
<li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulates+extension%2C+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li>
<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aracılık büyüme ve iç kulak farklılaşma Geliştirme sırasında olmuştur moleküler sinyaller kapsamlı5,6,7,8,9,10okudu. Ancak, hücre kavşaklar ve su aygırı sinyal, harekete geçirmek ile hissedilen, mekanik yardımlar bu işlemleri2,11', de önemli bir rol oynamak...

Pek çok yönden memeli organ gelişiminin incelenmesi, vitro sistemleri tarafından kolaylaştırılmış. İki temel yöntem şimdi vestibüler duyu organları kültürü için kullanılan: serbest yüzer1 ve yapışık2 hazırlıkları. Her iki yöntem saç hücre güvenlik açıkları3 ve rejenerasyon1,4 içinde vitrosoruşturma izni. Buna ek olarak, çentik5,6, Wnt7,8ve iç kulak Cascade'lerde sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)9,10 gelişimsel rollere sahip , kısmen, duyu epiteli vitro kültürleri kullanımı ile kurulmuştur. Ancak, hücre büyümesi ve farklılaşma, değil sadece morfojenlerdeki, ama aynı zamanda aracılığıyla gibi hücreler arası kişiler, fiziksel ve mekanik yardımlar tarafından hücre dışı matriks, sertliği sinyal ve mekanik germe veya daralma ile kontrol edilir. Böyle mekanik uyaranlara içinde gelişmekte olan iç kulak içinde vivoaraştırmak için zorlu bir roldür. Ayrıca, varolan serbest yüzer ve yapışık kültür yöntemleri için bu tür çalışmalar içinde vitrouygun değildir. Burada bir yöntemi açıklamak için kollajen kültüründe üç boyutlu organotypic ben jelleri değişen sertlik. Bu yöntem büyük ölçüde vestibüler ve koklear duyu organları içinde vivo mimarisini korur ve mekanik kuvvet etkisi büyüme ve farklılaşma11incelenmesi sağlar.
Mekanik stimülasyon birleştirmek önemli çünkü mekanik uyaranlara yolu12,13,14,15, sinyal su aygırı gibi aşağı akım moleküler olayları etkinleştirmek bilinmektedir biyokimyasal ve genetik manipülasyon ile. Burada anlatılan kültür yöntemi virüs-aracılı gen teslim izin verir ve bu nedenle mekanik ve moleküler iç kulak geliştirme11sırasında sinyal eğitim için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td># 10 Cerrahi Bıçaklar</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Forseps</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kabı</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL büyük delikli pipet uçları</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mm cam tabanlı Petri kabı</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyu plaka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hidroksitamoksifen ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Petri kabı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vektör Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, tavuk IgY fraksiyonu</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikoru (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bikinkoninik asit tahlili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Görüntüleme Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>İridektomi makası&nbsp;</td><td>Zepf Tıbbi Aletler</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı pH indikatörü ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saf Etanol, 200 Kanıt Decon</td><td>Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP antikoru</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü girdap&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu organotypic

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

İç kulak duyu organları deneysel manipülasyon ve optik gözlem için onların erişilememesi nedeniyle memelilerde çalışmaya zorlu. Ayrıca, mevcut kültür teknikleri biyokimyasal tedirginlikler olanak, ancak bu yöntemler mekanik kuvvet ve doku sertlik iç kulak duyu organları geliştirilmesi sırasında çalışması için bir yol sağlamaz. Burada olduğu gibi fare utricle ve bu sınırlamaların üstesinden koklea üç boyutlu organotypic kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan üç boyutlu matris sertlik düzeltilmesi için teknik manipülasyon doku büyüme karşı elastik kuvvet verir. Bu yöntem bu nedenle iç kulak geliştirme sırasında mekanik Kuvvetleri rolü eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, kültürler kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu deneyler için kullanılan virüs-aracılı gen teslim izin verir. Bu kültür yöntemi doğuştan gelen saç hücreleri koruyan ve destekleyen hücreleri ve vestibüler ve işitme duyu organları geleneksel iki boyutlu kültür potansiyel olarak üstün bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Vestibüler ve işitme duyu organları embriyonik kulaklar, gelen kültürlü 40-Pa kolajen ben düşük sertlik embriyonik koşulları11taklit jelleri, nispeten normal üç boyutlu yapılar (Şekil 1) korumak ve saç hücreleri korumak ve Destek hücreleri (Şekil 2 ve Şekil 3). Her ne kadar hücre yoğunluğu destekleyen üzerinden % 30 oranında azaltır (öğrenci t -testi: n 4, p ...

Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Bu prosedürün genel amacı, murin, vestibüler ve işitsel duyu organlarının üç boyutlu organotipik kültürlerini oluşturmaktır. Bu yöntem, iç kulak duyu organlarının gelişimi sırasında mekanik kuvvet ve doku sertliğinin rolleri nelerdir gibi iç kulak araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, vestibüler kokleanın doğuştan gelen mimarisini büyük ölçüde koruması ve iç kulak gelişimi sırasında hem moleküler hem de mekanik sinyalleri incelememize izin vermesidir.Dr. Hudspeth ve ben bu yöntem fikrine ilk olarak, üç boyutlu kültürlerin vestibüler organ büyümesini in vitro olarak incelemek için morfizyolojik koşullar sağlayabileceğini fark ettiğimizde sahip olduk. İlk olarak, çalışma alanını ve beş numaralı forseps ve bir saç bıçağı da dahil olmak üzere gerekli tüm diseksiyon aletlerini temizlemek ve dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Ardından, uzunlamasına bir kesim yapmak için steril bir neşter bıçağı kullanın, farenin kafasını ikiye bölün ve temporal kemikleri çıkarın.Buz üzerinde 60 milimetrelik bir Petri kabında 15 mililitre HBSS tamponuna aktarın. Daha sonra, iç kulakları temporal kemiklerden izole etmek için iki çift ince

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Bu video, spiral ganglion eksplantlarının iç kulaktan izole edilmesi ve bunların çok elektrotlu bir dizi üzerinde Corti organı ile birlikte kültürlenmesi sürecini göstermektedir. Spiral gangliyonlar dikkatlice ekstrakte edilir ve daha küçük doku bölümlerine veya eksplantlara ayrılır. Bu eksplantlar, nöronal süreç büyümesini teşvik etmek için çok elektrotlu dizinin aktif alanı üzerinde kültürlenir.

Murin Spiral Ganglion Nöron Eksplantlarının Çok Elektrotlu Dizilerde Kültürlenmesi

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Nöronal yanıt profillerini incelemek ve stimülasyon parametrelerini optimize etmek için çoklu elektrot dizileri üzerinde primer murin spiral ganglion nöron eksplantlarını kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tür çalışmalar, koklear implantların nöron-elektrot arayüzünü, hastalarda işitmeye ve cihazın enerji tüketimine fayda sağlayacak şekilde iyileştirmeyi amaçlamaktadır.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Burada, labirentektomi sırasında fizyolojik koşullar altında insan vestibüler uç organlarının toplanması ve bunların immün boyama kullanılarak analizi için bir teknik tanımlanmıştır.

Labirentektomi Sırasında Fizyolojik Koşullar Altında Vestibüler Uç Organların Çıkarılması

Öğrenin, fare vestibüler ve işitsel duyu organları için üç boyutlu organotipik kültür yöntemini. Bu teknik, iç kulak gelişiminde mekanik ve moleküler sinyalleşmeyi incelemek için sağlam bir platform sunar.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

Daha fazla video keşfet