Name: 一种研究人体 T 细胞召回反应的吸水泡协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 了解吸水泡皮肤召回法用于人体适应性免疫研究的技术原理与操作流程。该方法通过PPD抗原诱导局部免疫反应，无创采集特异性T细胞及细胞因子，适用于疫苗开发与免疫学机制探索。

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我们感谢 Mads Radmer Jensen 提供的实践与学术指导；感谢 Lau Lindqvist 和 Kaare Svejstrup 提供的技术专长；感谢 Helene Bæk Juel、Jonathan Filskov、Signe T. Schmidt 和 Solveig W. Harpøth 提供的技术协助；感谢根托夫特结核病门诊诊所的工作人员在 PPD 接种方面的培训；并感谢所有参与本研究的志愿者。本项目由欧盟委员会 H2020 计划资助 [资助编号 TBVAC2020 643381]，我们感谢联盟合作伙伴所进行的富有成效的讨论。

以下所述所有方法，包括使用人类志愿者，均已获得丹麦健康研究伦理委员会（H-15002988）和丹麦数据保护机构（jr.nr. 2015-57-0102）的批准。PPD 必须是经认证并获准用于人类的合格产品，并按照制造商提供的正确剂量使用。任何剂量或给药方式的偏差可能需要额外的伦理批准，且志愿者必须签署知情同意书。
1. 结核菌素皮肤试验
<ol>
	<li>从志愿者处获得口头和书面的知情同意。注射前，确保志愿者理解并接受该操作，包括可能的不良反应。 
	注意：本方案的纳入标准为年龄 &#62; 18 岁及以上且有记录的卡介苗接种史。纳入标准可能因研究问题而异（即，另一个纳入标准可能是结核菌素皮肤试验（TST）阳性证据。</li>
	<li>使用现成的供人用PPD溶液［20结核菌素单位（TU）/mL］。用酒精棉片消毒小瓶的橡胶瓶塞。</li>
	<li>准备注射部位
	<ol>
		<li>在志愿者前臂的腹侧定位注射部位。</li>
		<li>将手臂掌心向上平放在平坦表面上，选择前臂上三分之一区域，距离肘关节约5 - 10 cm处。避开瘢痕、静脉或皮肤损伤部位。</li>
		<li>使用酒精棉片对区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备PPD溶液
	<ol>
		<li>使用1 mL无菌注射器配27-30G/短针头例如，12 mm）固定针。</li>
		<li>轻轻混匀并吸取0.1 mL PPD溶液，确保无可见气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮内PPD注射 
	注意：此步骤描述了如何进行一次PPD沉积，但在同一手臂上进行多次PPD沉积也是可行的。然而，这可能需要获得特定的伦理批准。
	<ol>
		<li>绷紧皮肤，将针头以5–15°角刺入皮肤，针尖斜面朝上。</li>
		<li>将针尖插入皮肤的真皮层，并确保针尖几乎可透过表皮看到。</li>
		<li>缓慢注射0.1 mL PPD溶液。 
		注意：若操作正确，会立即出现一个6 - 10 mm的苍白丘疹，该丘疹约10分钟后消失。</li>
		<li>进行两次或多次注射时，注射位点之间应保持最大间距（5–10 cm），同时与肘部和腕部区域保持适当距离。 
		注意：这可以防止皮肤试验反应的潜在重叠，从而确保两个吸力室能够不受干扰地定位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 皮肤反应评估 - 第3天
<ol>
	<li>48 - 72 小时后，观察皮肤反应的大小。测量硬结（肿胀）范围，而非红斑（发红）范围。</li>
	<li>用手指触诊硬结区域，然后用圆珠笔标记出硬结的边缘。使用直尺测量硬结的直径，并以毫米为单位记录结果。 
	注意：硬结大小的读数可指导选择负压吸引室的孔径直径。</li>
</ol>
3. 负压水疱诱导——第7天
<ol>
	<li>组装负压吸引装置单元。 
	注意：负压吸引装置单元是带有连接腔室的真空泵，用于诱导水疱形成。本演示中使用的装置为定制设备，但此类负压吸引装置也可从商业渠道获得。泵的压力需可在 -20 至 -40 kPa 范围内调节，并能提供稳定可靠的负压。在使用本方法开展实验前，应获得所在地区的伦理审批。
	<ol>
		<li>首先，通过将底部孔板和窗口板与腔室及连接软管组装，完成负压吸引腔室的准备。将腔室连接软管牢固地连接至真空泵。 
		注意：腔室应包含一个带孔的底板，用于诱导水疱，该孔应适合与人体皮肤接触；同时应包含一个带观察窗的顶板，以便对水疱形成过程进行可视化监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据皮肤反应的大小确定孔板上孔径的最佳尺寸；孔径越大，形成的水疱也越大。</li>
	<li>使用酒精棉片对孔板及受试者的皮肤进行消毒。</li>
	<li>将负压吸引腔室固定于皮肤上。
	<ol>
		<li>确保受试者手臂处于舒适放松状态。</li>
		<li>确保负压吸引腔室底板上的孔位于PPD反应区域上方，使皮肤反应的中心部位清晰可见。</li>
		<li>使用绑带松紧适当地固定腔室：当施加负压后，腔室将自然吸附于皮肤并保持位置稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启负压吸引装置，并将压力调节至 -20 kPa。</li>
	<li>30 分钟后，将负压增加至 -25 kPa。</li>
	<li>60 分钟后，进一步将负压增加至 -30 kPa。</li>
	<li>维持 -30 kPa 的负压，直至水疱完全形成。请注意，本方案中提供的负压值是针对特定定制仪器设定的；在其他设备上应用该方案时，可能需要对压力进行适当调整。 
	注意：水疱诱导阶段通常持续 60 至 180 分钟（1 - 3 小时），其中实际水疱形成多发生在最后 30 分钟内。水疱形成过程中常伴有瘙痒感。水疱可表现为单个或多个融合的形态。若发生水疱破裂或出血，建议通过缓慢释放压力的方式终止水疱诱导。</li>
	<li>水疱完全形成后，释放负压，并小心地将负压吸引腔室从皮肤上取下，避免水疱破裂。</li>
	<li>在水疱周围皮肤区域覆盖柔软敷料，并在水疱上方放置硬质保护帽（例如，取自 50 mL 塑料管的管帽）。</li>
	<li>先用非致敏性外科胶带固定保护帽，再用柔软弹性绷带进行包扎加固。</li>
	<li>指导受试者在接下来的 12 至 24 小时内避免对水疱区域施加过度的物理压力。</li>
</ol>
4. 水疱液采集 - 第8天
<ol>
	<li>第8天th 当天，轻轻移除保护性敷料，并使用皮肤消毒喷雾对水疱进行消毒。</li>
	<li>使用一支2 mL无菌注射器和23G针头采集水疱内容物。将针头插入水疱顶部或侧壁，缓慢抽吸液体。避免触碰水疱腔底部，但需确保完全采集所有液体。</li>
	<li>在已塌陷的水疱上敷上敷料。</li>
	<li>将水疱液转移至无菌管中。记录体积。</li>
	<li>使用台式离心机以600 × g离心4分钟，使水疱液沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至另一管中，并用500 µL细胞培养基重悬细胞沉淀。 
	注意：细胞现在可用于计数和进一步分析。上清液可于 -20 至 -80 °C 保存至使用时。</li>
</ol>
5. 吸疱细胞与液体的分析
注意：本方案不涵盖对皮肤负压水疱获取的细胞和液体进行分析的操作说明。然而，为了在本报告中提供代表性结果，我们进行了细胞内染色流式细胞术和多重分析。以下简要描述了相关方法。
<ol>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>取1名卡介苗（BCG）接种志愿者的吸疱液中分离的新鲜细胞，以每份1 × 105个细胞的密度悬浮，加入10 µg/mL PPD进行刺激，并在37 °C、5% CO2条件下培养。同时设置未刺激细胞组作为平行对照培养。</li>
		<li>取1名卡介苗（BCG）接种志愿者的外周血单个核细胞（PBMCs），以每份1 × 106个细胞的密度悬浮，加入10 µg/mL PPD进行刺激，并在37 °C、5% CO2条件下培养。同时设置未刺激细胞组作为平行对照培养。</li>
		<li>刺激2小时后，向所有细胞中加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）和莫能菌素（monensin），并在37°C下继续孵育6小时。</li>
		<li>使用以下抗体组合对细胞进行染色：活/死细胞染料-BV510、抗-CD4-AF780、抗-CD3-BV421、抗-CD8-PerCP-Cy5.5、抗-CCR7-PE、抗-CD45RA-BV786、抗-IFN-γ-AF700、抗-TNF-α-PE-Cy7 和抗-IL-2-FITC。</li>
		<li>在PBMC染色组合中设置荧光减一对照（FMO controls）。</li>
		<li>使用流式细胞仪进行流式细胞术分析，并采用相应软件分析结果。</li>
		<li>采用以下设门策略对产生细胞因子的CD3+CD4+CD8-细胞亚群进行设门分析：单细胞群体 - &#62; 活性CD3+细胞 - &#62; CD4+CD8-细胞 - &#62; IFN-γ+、TNF-α+ 或 IL-2+细胞。</li>
		<li>采用以下设门策略对效应记忆T细胞群体进行设门分析：单细胞群体 - &#62; 活性CD3+细胞 - &#62; CD4+CD8-细胞 - &#62; CCR7-CD45RA-细胞。</li>
		<li>使用布尔门控（Boolean gating）方法计算各细胞因子的表达谱型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞因子释放检测
	<ol>
		<li>为展示体内（in vivo）细胞因子释放情况，采用多重分析法（multiplex analysis）检测4名志愿者吸疱液解冻样本中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13的浓度水平。</li>
		<li>为展示来源于吸疱液细胞的体外（ex vivo）细胞因子释放情况，使用1名卡介苗（BCG）接种志愿者的新鲜吸疱细胞及其外周血单个核细胞（PBMCs）进行实验。</li>
		<li>用100个菌落形成单位（CFU）的Mtb H37Rv感染PBMCs和吸疱细胞，并培养4天。</li>
		<li>采用多重分析法检测所有培养上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13的浓度水平。</li>
		<li>将高于检测计算范围的测量值调整至该检测方法的最高计算限值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种研究人类免疫记忆反应的实用方法 体内，通过吸疱法诱导皮肤抗原回忆反应并采集细胞。以结核菌素皮肤试验（TST）为例，展示皮内抗原注射及卡介苗（BCG）疫苗回忆反应。最后，通过流式细胞术和多重细胞因子分析对吸疱样本进行表征，结果表明约三分之一的吸疱细胞为具有效应记忆表型的抗原特异性多功能T细胞。
本方案的关键步骤包括皮内注射技术、负压水疱诱导以及水疱穿刺。首先，正确的皮内注射需要经过培训的专业人员操作，不当的注射可能导致效果不理想。PPD通常是一种广为人知且安全的皮肤抗原，但其成分在不同生产商之间可能存在差异，从而限制了结果的可比性13,20。本报告提供了单次皮内注射2 TU的指导，也可选择进行两次平行注射（2 × 2 TU），后者可能需要额外的伦理审批。然而，其他研究曾使用10 TU剂量，这会增加出现强烈皮肤反应的可能性10,21。在负压水疱诱导过程中，逐步小幅增加负压可降低出血和水疱破裂的风险。血液中的红细胞或白细胞污染的可能性通常较低2。无菌穿刺技术可防止微生物污染，避免穿刺针接触真皮层水疱底部则可减少碎屑或常驻皮肤细胞的混入。然而，部分研究人员更倾向于通过对穿刺后的水疱施加滚动压力来收集水疱液10。必要时可穿刺水疱内部的间隔结构。负压水疱技术本身属于微创操作；塌陷后的水疱可无瘢痕愈合，感染极为罕见2。但可能出现一定程度的色素减退，因此对于有胶样瘢痕病史的个体，应尽量避免使用负压水疱诱导方法。
技术局限性包括细胞总产量较低，因此长期保存的选择有限。白细胞产量、临床TST反应、水疱大小以及红细胞污染之间的关系已在其他文献中得到充分描述2,10。在本文展示的BCG回忆实验中（图1），每个水疱的细胞中位总产量为50,000个，这意味着使用这些细胞进行的实验规模较小，尤其是当单独研究SBCs时15。然而，SB样本中的特异性T细胞群体在相对数量和绝对数量上大多超过PBMC样本中的相应细胞。在图2所示的示例中，100,000个SB细胞样本中三重阳性PPD特异性T细胞的数量比来自同一供体的1×106个PBMCs中的数量高出两倍以上（数据未显示）。对TST反应进行视觉评分是评估结核分枝杆菌（M. tuberculosis）免疫记忆最常用的临床方法。需要注意的是，潜在的适应性免疫反应与临床皮肤反应的峰值时间并不一致2,21。并非所有接种过BCG疫苗或暴露于Mtb的个体都会产生强烈的TST反应，因此在启动使用该方法的回忆试验之前，必须考虑对TST无反应者样本的分类策略和处理方法，以及研究人群中预先存在的分枝杆菌致敏情况。此外，在SB取样和视觉评分过程中，由于全身性或皮肤相关的免疫功能受损（例如在HIV感染和某些年龄组中所见），皮肤反应减弱的个体可能存在理论上的偏倚2,13,18,20。另外，重复检测会导致TST反应的免疫增强效应是众所周知的现象20,22。然而，当重复进行TST检测时，SB细胞的表型保持相对稳定10。这一观察结果支持了SB回忆反应在细胞免疫应答纵向研究中的应用价值。
对于T细胞免疫学家而言，水疱法（SB）回收能够获得高比例的抗原特异性细胞。然而，从PPD沉积部位取样时，水疱采集的时机至关重要，因为细胞组成和细胞因子微环境会随时间发生变化。在本方案中，水疱于PPD攻击后第7天诱导形成，所分离的细胞主要为CD4+效应记忆T细胞，其中包含大量共表达IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞。这些观察结果与先前研究一致，表明T细胞的活化、增殖和分化发生在经PPD致敏的皮肤中2,15,21。在PPD致敏个体中的动力学水疱研究表明，皮肤的早期反应是非特异性的；但在PPD攻击后的最初几天内，反应迅速转为以CD4+ T细胞为主（已有研究报道包括中枢记忆和效应记忆表型），且在第3天后，反应主要由高比例的PPD特异性细胞因子分泌型CD4+ T细胞主导2,8,10,15,21。这种适应性细胞因子反应可在皮肤中持续检测超过2周2,8,10,23。结核菌素皮肤试验（TST）后第7天似乎是收集细胞因子分泌型记忆CD4+ T细胞的最佳时间点2。然而，具体最佳时间点可能因所研究的抗原及免疫反应类型而异。值得注意的是，有研究报道适应性PPD反应的峰值可能略早，在TST后第5天时促炎性细胞因子的分泌已开始下降10。
SB 液体中含有高水平的促炎性细胞因子及其他可代表皮肤微环境的蛋白质15,24动力学研究表明，SB 液中 TNF-α 和 IFN-γ 水平在 3 天后达到峰值，而 IL-2 水平在 7 天后达到峰值2,10，可能反映了在此后期阶段适应性反应占主导地位。由于SB细胞已被激活 体内，它们表现出较高的自发性细胞因子释放，以及在再次刺激后特异性释放的潜力（图3 和 4).
本报告聚焦于CD4+ T细胞免疫。如图2所示，分离出的T细胞绝大多数为CD4+，而吸疱液中几乎检测不到CD8+ T细胞。这与其他关于吸疱法PPD回忆反应的研究结果一致，这些研究均报道CD8+ T细胞的比例较低，且迁移能力较CD4+ T细胞更弱2,8,10,23。进一步表征CD8+ T细胞的贡献将更有助于理解其作用；然而，这超出了本报告的范围。
T细胞被认为在Mtb的免疫控制中起关键作用；然而，目前尚难以确定血液中适应性免疫反应所反映的保护效果的可靠相关指标25,26。这一障碍严重阻碍了新型结核病疫苗的研发，因为目前尚无替代大规模且极其昂贵的有效性试验的可行方案27。结核病疫苗研发人员通常通过评估血液中疫苗特异性T细胞群体的微小且短暂的变化来判断疫苗的免疫原性28,29。然而，血液中所检测到的循环抗原特异性T细胞的微小比例是否具有生物学意义仍存疑问（即，能否迁移至感染部位，并代表控制Mtb的富含T细胞的微环境）27,30,31。
根据以往的研究及本文提供的数据，SB皮肤回忆模型在研究疫苗特异性T细胞方面具有尚未开发的潜力。该模型不仅能够唤起数十年前产生的疫苗免疫应答，还可在组织特异性的背景下评估真正的记忆潜能15,18,19,21。新型特异性皮肤试验（包括由候选亚单位结核疫苗抗原组成的抗原）提示，利用该模型进行疫苗评估具有新的前景28,32。此外，转录组学分析表明，在PPD刺激的皮肤中产生的细胞介导免疫应答与Mtb感染肺组织中观察到的免疫应答相似18。
虽然皮肤钻孔活检也可从皮肤中获取细胞，并提供空间信息，但与SB取样相比，该方法更具侵入性，且需要通过酶解或机械处理来制备单细胞悬液33。两种方法在细胞因子和细胞标志物的检测结果上具有可比性2,10。
除了皮肤病学领域外，抽吸水疱法已单独或联合全身性或局部皮肤激发试验应用于医学研究的多个领域。例如脓毒症、EB病毒相关性淋巴组织增生性疾病、糖尿病性神经病变、糖皮质激素摄入效应的研究，以及用于测试治疗性抗体或T细胞靶向治疗模型的人体试验10,34,35,36,37,38。
从治疗学角度来看，SB皮肤回忆法在研究中枢T细胞记忆潜能方面具有独特优势；并且从生物学和技术角度来看，皮肤似乎提供了一个相关的取样区室2,15,18,19,21。特别是与传统的被动采集循环PBMCs方法相比，SB皮肤回忆法能够研究那些已证明可在相应抗原刺激下从淋巴结迁移出来，并在组织特异性的体内环境中完成局部扩增和分化的T细胞15,18,19,21。
总之，本文展示的模型可能对人类适应性免疫及T细胞靶向制剂领域的研究人员具有重要意义即，在传染病疫苗学或癌症研究领域）。本方案中采用的TST模型当然在结核病疫苗学领域具有特殊相关性。然而，该模型的基本概念在其他研究领域也具有广泛的应用价值。

皮肤水疱（SB）是一种人工诱导产生的水疱，可直接从皮肤中收集细胞和液体。通过负压法诱导形成水疱的技术是皮肤科学领域中广为人知的工具，用于研究健康与疾病状态下的皮肤免疫学1,2,3,4,5,6,7,8本报告展示了SB技术与皮肤抗原回忆反应相结合（SB皮肤回忆法）如何为适应性免疫应答提供直接的洞察 体内.
SB诱导的原理很简单：在皮肤的小面积区域施加轻微负压。负压最终会迫使表皮与真皮分离，形成一个充满液体和细胞的局部水疱1,2,9。可通过细针穿刺抽吸获取水疱液，其内容物可用于后续体外研究 in vitro。
近年来，SB方法在研究中的应用引起了日益增长的兴趣 体内 除局限于皮肤的疾病外的免疫反应10,11人类适应性免疫的研究受到一定限制，因为通常只能从外周血中采集目标细胞和细胞因子，而对淋巴结或胃肠道黏膜组织进行侵入性取样可能无法被接受且不符合伦理要求。例如，在疫苗接种后对持久性人类记忆T细胞应答的研究即面临此类限制。12在这些试验中，相关T细胞的取样可能面临巨大挑战，因为介导免疫反应的细胞群体主要存在于淋巴组织中，仅有极少量的特异性T细胞在外周血中循环。
SB 技术为研究记忆性 T 细胞及其他特定细胞群体提供了独特的机会。在皮肤接种抗原后，针对该抗原特异的 T 细胞会从其淋巴器官的隐匿部位被募集至皮肤，并可轻易地从 SB 中取样。这种皮肤回忆模型的方法学及其研究应用已由 Akbar 进行描述。 等 2013年2一种常用于皮肤回忆反应的抗原是商业化的结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD），该抗原用于结核菌素皮肤试验（TST）。13，其中PPD被注射到皮肤的真皮层。在对PPD具有既往免疫记忆的个体中[例如，具有 结核分枝杆菌 (Mtb）感染或既往接种过卡介苗（BCG）疫苗]，抗原沉积会引发记忆性免疫应答，导致免疫细胞向皮肤迁移并产生 体内 PPD特异性CD4+ T细胞的克隆扩增2,11,14,15.&#160;因此，大量针对PPD的多功能CD4+ T细胞在皮肤中积聚，可随时用于刮取采样。通过该方法采集的T细胞已被证实具有良好的稳定性，且数量充足，可用于多种免疫学检测以及长期培养研究。 体外 培养15因此，皮肤回忆模型与SB诱导可能成为研究的有效方法 体内 T细胞反应 离体 分析，加深对这一方法的了解可能使对细胞免疫学和疫苗学感兴趣的研究人员受益。
本报告首次提供了在注射PPD的皮肤区域诱导人皮肤负压水疱的分步操作指南。通过卡介苗（BCG）接种志愿者的结核菌素皮肤试验（TST），展示了皮肤抗原回忆反应模型。最后，相关 离体 通过SB分离的细胞和细胞因子的分析示例. PPD特异性T细胞的表型和功能特征已在其他文献中详尽描述2,10,11,16,17,18,19本报告旨在探讨该方法在实践和免疫学方面的相关问题，以促进其他研究团队更便捷地应用此技术。

<table><tbody><tr><td>实验室用手套</td><td>Imtex, Denmark</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>消毒喷雾&amp;nbsp;</td><td>Apotek, Denmark</td><td></td><td>含甘油的82%酒精，适用于人体皮肤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Mediq, Denmark</td><td>1131892</td><td></td></tr><tr><td>PPD RT 23 &quot;SSI&quot; (2 T.U./0.1ml)</td><td>AJ Vaccines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;带固定针头的Myjector注射器&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>A236</td><td>1 ml/29G/12mm</td></tr><tr><td>直尺&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td></td><td>&amp;nbsp;用于皮肤反应评估</td></tr><tr><td>圆珠笔</td><td>不适用</td><td></td><td>&amp;nbsp;用于皮肤反应评估</td></tr><tr><td>便携式肺部吸引装置</td><td>Laerdal Medical, Denmark</td><td>78000011</td><td>注意：&amp;nbsp; 由Hvidovre医院技术部门改装，适用于-40kPa以下压力范围，并配备压力表&amp;nbsp;（货号1031107）</td></tr><tr><td>未加热负压室组件，带连接管路</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>孔板，47mm，10mm孔径</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>负压仪器密封套件</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>负压室绑带&amp;nbsp;</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td>12英寸</td></tr><tr><td>Micropore外科胶带</td><td>&amp;nbsp;3M</td><td>1533-1</td><td>2.5cm x 9.1m</td></tr><tr><td>15ml塑料管盖</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>Tubigrip弹性绷带</td><td>M&amp;ouml;lnlycke Health Care, Sweden</td><td>1443</td><td></td></tr><tr><td>Cosmopor无菌粘性敷料</td><td>Hartmann</td><td>9008337</td><td>7.2 x 5 cm</td></tr><tr><td>2ml 同轴鲁尔滑动注射器&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 23G/30mm针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>300700</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock微量离心管（已高压灭菌）</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030120086</td><td>已高压灭菌</td></tr><tr><td>Minispin plus离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Gibco AIM V培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12055-091</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究人类t细胞记忆应答的负压水疱实验方案 体内

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

皮肤抗原回忆模型可用于研究人类记忆免疫应答 体内结合皮肤负压水疱（SB）诱导技术，该模型可获取代表细胞记忆应答的稀有抗原特异性T细胞群体及其细胞因子微环境 原位.
本报告描述了皮肤回忆反应、SB诱导以及抗原特异性T细胞采集的实用操作步骤。为示例该方法，采用结核菌素皮肤试验对先前接种过卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin）以预防结核分枝杆菌感染的个体进行抗原回忆刺激 结核分枝杆菌 最后，提供了SB样本的多重分析和流式细胞术分析示例，表明与从血液中分离的细胞相比，该取样方法可获得较高等比例的抗原特异性多功能CD4+ T细胞。
此处描述的方法安全且侵入性极小，为研究先天性和适应性免疫反应提供了独特的机会 体内并且可能对从事疫苗开发中细胞介导免疫和人类记忆应答研究的广大科研人员具有重要意义。

纳入八名健康成年志愿者（中位年龄：30岁，范围：26–43岁），均有记录在案的既往卡介苗（BCG）接种史（距卡介苗接种的中位时间：5.5年，范围：1–30年）。受试者于第3天经皮内接种2 TU的PPD后进行结核菌素皮肤试验（TST）评估。第7天诱导血清疱（SB），第8天采集样本，所有血清疱均使用孔径为10 mm的负压吸引疱装置诱导形成。其中七名个体在同一手臂同时接种两份独立的PPD制剂，并进行两个平行的血清疱诱导（详见《实验方案》中步骤1.4下方关于多次PPD接种的说明）。第7天采集外周血，通过密度梯度离心法分离血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）。血浆及血清疱液上清储存于-20 °C。新鲜血清疱细胞（SBCs）采用尼格罗素染色结合显微镜计数。
临床TST反应和SBC产量如图1所示。TST硬结的中位大小为10.25 mm（范围：0 - 20 mm），每个水疱的中位细胞数为50,000个（范围：15,000 - 210,000个细胞，水疱数量：15）。两名志愿者在两次TST中均无临床反应，相应的总细胞产量较低，为15,000个细胞/水疱。细胞产量与TST的平均临床反应相关（Spearman's r = 0.643，p = 0.094）。
<img alt="在琼脂平板上进行菌落计数及平均细胞数与平均TST硬结直径的散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：负压水疱细胞收获量。（a）本图显示了从TST后第7天采集的负压水疱（SB）中分离出的经尼格罗素染色细胞的代表性显微图像。（b）本图显示了8名接种过卡介苗的志愿者中，平均TST硬结直径（mm）与平均细胞收获量（n/水疱）之间的关系（水疱数量 = 15）。每个圆点代表个体的平均测量值。请注意，有两个圆点重叠，因为有两名志愿者的TST硬结直径均为0 mm，细胞收获量均为15,000。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为展示流式细胞术对SB的表征，从一名43岁的志愿者处获取SBCs，该志愿者30年前接种过卡介苗，且无已知的结核分枝杆菌暴露史 Mtb. SBCs 在单个水疱形成后被分离（硬结：1.4 mm/100,000 SBCs）。 图2 显示SBCs细胞内细胞因子染色的代表性图谱 与 外周血单个核细胞（PBMCs）
在此志愿者中，CD3+CD4+CD8- SBCs 的比例从未刺激细胞的 67% 上升至 &gt; 90% 在 PPD 上 体外 再次刺激后，CD3+CD4+CD8- PBMCs 的比例保持不变（约 51%）， 图2。超过92%的 体外 PPD刺激以及未刺激的CD3+CD4+CD8- SBCs均为效应记忆型（CCR7-CD45RA-，数据未显示）。PPD刺激诱导产生的特异性CD3+CD4+CD8-细胞比例在SBCs中高于PBMCs（33.1％） 与0.2%，减去未刺激样本）。在PBMC中，针对PPD特异性的CD3+CD4+CD8-多能性细胞所占比例均 &lt; 0.05%.
<img alt="外周血单个核细胞与负压抽吸水疱细胞的流式细胞术图谱。CD3+ 刺激效应分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：SBCs 的代表性流式细胞术图谱 与 外周血单个核细胞（PBMCs） 面板 a 和 b 显示CD8+和CD4+细胞群的代表性密度图（a未刺激的 与PPD刺激的PBMCs和（c) SBCs。图示面板 b 和 d PPD刺激的CD3+CD4+CD8-细胞内细胞因子染色的慢时程图b) 外周血单个核细胞（PBMCs）和（dSBCs。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
如预期所示，CD3+CD4+CD8- SBCs 被激活 体内，表现为高比例的细胞染色显示细胞因子上调（12%），主要上调的细胞因子为TNF-α和IFN-γ。然而，在PPD刺激后，分泌细胞因子的细胞则转向以三重或双重阳性IFN-γ+TNF-α+IL-2+（17%）和IFN-γ+TNF-α+（15%）表型为主（图3b，同一供体的PBMC谱型被纳入用于比较 图 3a）。在PPD刺激下，效应记忆CD4+ T细胞亚群（CD3+CD4+CD8-CCR7-CD45RA-）的细胞因子表达谱与图2和图3中所示的CD3+CD4+CD8-细胞群相似（数据未显示）。
<img alt="PBMCs和吸疱细胞细胞因子反应柱状图；IFN-γ、IL-2、TNF-α；免疫学分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3CD4+ PPD刺激与未刺激的SBCs与PBMCs的细胞因子谱 这些图示展示了产生细胞因子的个体谱型 (aCD3+CD4+CD8- PBMC 细胞和 (bCD3+CD4+CD8- SBCs。柱状图表示未刺激细胞（白色柱）及刺激后抗原特异性细胞因子谱的比例 体外 使用PPD刺激（彩色柱状图）。 
为了探究水疱液作为皮肤试验部位细胞因子微环境信息来源的价值，检测了在结核菌素皮肤试验（TST）后7天诱导产生的水疱液中的细胞因子水平。图4a）。IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 的中位水平分别为 339 pg/mL、19 pg/mL 和 1 pg/mL（n = 6）。血浆中的水平通常非常低。从SBs中分离的细胞产生高水平的促炎性细胞因子 离体 (图4b). 来自1名志愿者的SBCs滴定物在强毒株存在下培养4天 M. tuberculosis ± 自体外周血单个核细胞。IFN-γ 水平为 &gt; 无论是否存在PBMCs，在含有SBCs的培养物中均高出30倍。
<img alt="细胞因子浓度，IFN-γ、IL 水平；血浆、支气管肺泡灌洗液、PBMC 与 SBC 检测结果的柱状图比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：SB 液、血浆中的细胞因子水平及 Mtb-感染后的培养上清液。 (a此图展示了6名接种BCG疫苗的志愿者的SB液上清和血浆中的细胞因子水平。柱状图表示细胞因子水平的中位数，误差线表示范围。b该图展示了来自4个平行样本上清液中的细胞因子水平 600 µl 离体 4天培养的1 × 106 外周血单个核细胞（PBMCs，黑色柱状图），1.75 x 105 SBCs（白色柱状图）和 1 × 106 加入0.5或1.75 × 10的PBMCs5 被感染的SBCs（灰色柱状图） Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

在此，我们展示了吸疱皮肤回忆反应模型的操作方法。该模型为研究人类皮肤免疫反应提供了简便的途径 体内 适应性免疫反应，例如在疫苗开发中的应用。

一种用于研究人类T细胞记忆应答的负压水疱实验方案 体内

皮肤抗原回忆模型可用于研究人体记忆反应的体内过程。当该模型与皮肤负压水疱（SB）诱导技术结合时，……

本视频的总体目标是演示吸疱皮肤回忆反应法，该方法可使我们采集到代表体内适应性免疫反应的抗原特异性T细胞和细胞因子。此方法可用于研究人类的细胞免疫反应和适应性免疫。该技术的主要优势在于，它能够通过一种相对无创且安全的方法，直接从免疫反应部位采集抗原特异性T细胞。皮肤回忆反应的基本原理是将抗原注入皮肤的真皮层。对于已存在该抗原免疫记忆的个体，T细胞会迁移至反应部位，并在局部引发免疫反应，导致特异性T细胞在原位发生克隆扩增和分化。在该反应区域诱导产生负压水疱，可使我们收集到这些特异性T细胞以及体内产生的细胞因子。在本视频演示中，我们使用PPD作为回忆抗原。PPD通常用于诊断结核分枝杆菌感染。但是，正如您在本视频中将看到的，它也会在既往接种过BCG疫苗的人群中引发皮肤反应。进行结核菌素皮肤试验所需的材料包括酒精棉片、1毫升注射器配27至30号短针头，以及经批准用于人体的PPD溶液。应使用每毫升含20结核菌素单位的PPD溶液。用酒精棉片对药瓶进行消毒。请注意，不同制造商的产品成分可能有所不同。然后在志愿者前臂的掌侧确定注射部位，并使用酒精棉片对该区域进行消毒。使用带有29号、12毫米固定针头的1毫升无菌注射器。轻轻混匀并吸取0.1毫升PPD溶液，确保无可见气泡。绷紧皮肤，将针头以5至15度角刺入，针尖斜面朝上。将针头尖端插入皮肤的真皮层，并确保针尖几乎可在表皮下可见。缓慢注射0.1毫升PPD溶液。若操作正确，立即会出现一个直径6至10毫米的丘疹。丘疹大约十分钟后消失。可进行多次PPD接种，但可能需要额外的伦理审批。若进行两次注射，应尽量分开注射部位，同时与肘部和腕部保持足够距离。临床皮肤反应通常在24小时内出现，并伴有瘙痒感。在注射后48至72小时测量皮肤反应的大小。评估反应时，重要的是测量硬结范围，而非红斑范围。用手指触诊帽状肿胀，然后用圆珠笔标记浸润边缘。最后，使用软尺测量浸润直径，并以毫米为单位记录结果。七天后，开始诱导产生吸疱。诱导皮肤吸疱时，使用带有吸疱室的真空泵，可选用市售装置或定制设备。重要的是，泵的压力需要在负20至负40千帕范围内可调，并能提供稳定可靠的负压。吸力室的底部由一块带有小孔的板组成，该板与皮肤接触。根据皮肤反应的不同，可使用单孔或多孔的板，并采用不同尺寸的孔板以适应需要。腔室顶部应允许对水疱进行视觉观察。诱导前，对皮肤和腔室板进行消毒。确保手臂舒适地放置。使用可调节的绑带固定反应室。皮肤反应的中心应通过底板上的孔清晰可见。打开抽吸装置，并将负压调节至-20千帕。30分钟后，将压力增加至负25千帕。60分钟后，进一步将压力增加至负30千帕。并保持此压力，直至形成一个完整的水疱。水疱诱导阶段通常需要大约一到三个小时。实际的水疱形成在最后30分钟内逐渐发生，如这里高速展示的那样。如果出现水疱破裂或出血的迹象，建议缓慢释放压力并提前终止诱导。水疱可能表现为单个或多个融合的水疱。该过程常伴有瘙痒感。水疱完全形成后，释放压力，并小心移除吸疱装置。在正确诱导形成的水疱中，表皮层完全与皮肤的真皮层分离，形成一个充满液体的腔隙。通过在水疱周围皮肤区域覆盖柔软敷料，并在水疱上方放置一个硬质保护盖（此处使用一个15毫升塑料管的管盖）来保护水疱。先用防过敏胶带固定管盖，再用柔软、有弹性的绷带包扎固定。指导志愿者将保护性敷料保留过夜。次日，小心移除敷料，并使用喷雾对水疱区域进行消毒。使用带有23号针头的2毫升无菌注射器抽取水疱内容物。将针头插入水疱顶部的侧缘，缓慢抽吸液体。避免触碰水疱腔的基底，但需确保收集全部液体，因为水疱内的液体量可能较少，如此例所示。塌陷的水疱将无瘢痕愈合。在水疱处覆盖保护性敷料。然后将水疱液转移至无菌管中。使用台式离心机在600 G条件下离心4分钟。随后，收集上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升细胞培养基中。新鲜细胞现可用于计数及进一步分析。吸疱细胞可用于体外分析，例如流式细胞术。在本项针对接种过BCG疫苗的志愿者的实验中，每个水疱的细胞产量范围为15,000至超过200,000个细胞。在此，我们从单个负压吸引水疱中分离细胞，并在体外用PPD刺激这些细胞，随后进行染色和流式细胞术分析。作为对照，我们对同一位接种过PCG疫苗的志愿者的外周血单个核细胞（PBMC）进行了平行分析。在图示中，您可以看到经细胞内染色检测TNF-α、干扰素-γ和IL-2产生的CD4阳性T细胞群体。在此志愿者中，从皮肤分离的CD4阳性T细胞中有超过30%具有抗原特异性，而在外周血单个核细胞（PBMCs）中，该比例低于1%。此外，水疱细胞的单个细胞因子谱具有中枢记忆T细胞和效应T细胞的特征，说明该方法使我们能够研究体内产生的长期记忆免疫应答。图A表明，可对抽吸水疱获得的液体进行分析，以检测体内产生的细胞因子。在图B中，我们将抽吸水疱获得的细胞在结核分枝杆菌存在条件下培养四天，展示了抽吸水疱细胞在体外产生干扰素-γ和TNF-α的能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何在皮肤抗原沉积后诱导并采集抽吸水疱中的细胞。在本演示中，我们使用了一种在结核病研究领域具有特殊意义的抗原。然而，该方法的基本原理也可应用于适应性免疫领域的研究，或用于评估靶向T细胞制剂的试验中。同时，请务必牢记，在涉及人类志愿者的研究中，伦理与安全始终是首要考虑的因素。还需记住，处理人类样本可能存在危险，因此在实验室中应始终遵守安全预防措施。

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