Name: 新化合物调制伽玛-丁酸受体 a 型神经传递的发现方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学习利用放射配体结合与电生理技术筛选GABA A受体配体的方法，结合Xenopus卵母细胞与大鼠脑片模型，系统鉴定具有亚型选择性的候选化合物，为中枢神经系统药物研发提供可靠实验策略。

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作者感谢罗氏公司的 Judith Lengyel、Maria Karg、Grégoire Friz、Rachel Haab 和 Marie Claire Pflimlin，以及 HiQScreen 公司的 Tifany Schaer 和 Deborah Paolucci 提供的出色技术支持。

Xenopus laevis 的饲养和操作遵循日内瓦州动物使用指南。
1. 放射性配体结合
<ol>
	<li>检测板的制备
	<ol>
		<li>配制 1.5 L 检测缓冲液，含 5 mM KCl、1.25 mM CaCl₂、1.2 mM KH₂PO₄、1 mM MgSO₄、10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。2，1.25 mM MgCl2，120 mM NaCl 和 15 mM Tris；用 HCl 调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>制备待测化合物 50.76 µM (例如，一个 5 µL 10 mM 化合物 980 µL 在微量离心管中加入检测缓冲液）。使用涡旋振荡器高速混合2–5秒。</li>
		<li>用移液器吸取参考化合物氟马西尼，制备预稀释液 1 µL 化合物（10 mM）的 1,970 µL 加入检测缓冲液，使用涡旋振荡器高速混合2–5秒。</li>
		<li>稀释 [3H]flumazenil 储备液与测定缓冲液混合 4 °C 至50 mL聚丙烯管中的4 nM。</li>
		<li>移液器 50 µL/well 将检测缓冲液加入96孔微孔板的第1列以及第3–11列，具体加样布局如图示微孔板布局所示 图2.</li>
		<li>移液器 73.2 µL 化合物稀释后的 50.76 µM （参见步骤 1.1.2）加入到板的第 12 列中。</li>
		<li>使用几何级数将每种化合物稀释为9个步骤（1E-10 – 1E-06 M），具有 23.12 µL 转移体积并加样至第3–11列。充分混匀稀释液。每次稀释后更换吸头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稀释细胞膜
	<ol>
		<li>解冻先前从过表达人源GABA的HEK293细胞中分离的细胞膜A 受体（0.025–0.15 mg/mL）以获得80 mL室温（RT）悬液，并将该悬液转移至测定缓冲液中 4 °C.</li>
		<li>将仍处于膜溶液中的沉淀重悬 4 °C 使用组织匀浆器在10,000–12,000 rpm条件下匀浆30–40秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于非特异性结合（NSB）对照的安定稀释液
	<ol>
		<li>将4 mM的安定（diazepam）储备液用检测缓冲液稀释至所需浓度 40 µM 在5 mL中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始反应
	<ol>
		<li>移液器 50 µL 4 nM [3将 [H]氟马西尼加入96孔板的每孔中，并置于冰水容器中保存。</li>
		<li>添加 100 µL GABA的A 受体亚型膜制备，使蛋白浓度为0.5 mg/mL。</li>
		<li>移液器 50 µL 的 40 µM 将地西泮加入第2列。</li>
		<li>将培养板置于冰上孵育1小时。</li>
		<li>添加 50 µL 在96孔滤板的每孔中加入测定缓冲液，用于后续的膜分离和放射性测量，并在之后终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终止反应
	<ol>
		<li>用50 mM Tris-HCl（pH 7.4）配制洗涤缓冲液。</li>
		<li>使用96孔细胞收集器过滤溶液。用缓冲液洗涤反应板3次 300 µL 每孔加入冰冷的洗涤缓冲液。</li>
		<li>用塑料膜密封板的底部并加入 40 µL 每孔加入闪烁液用于液体闪烁计数，并用70%乙醇擦拭。</li>
		<li>在室温下轻轻振荡平板至少1小时。然后在室温下静置至少另外1小时。</li>
		<li>将培养板置于闪烁计数器上，测定放射性（单位为CPM），每孔计数3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>计算非特异性结合（NSB）8个复孔以及总结合（TB）和样品双复孔或三复孔的平均值。根据以下公式计算各样品平均值的特异性结合百分比（%SB）： 
		<img alt="静态平衡公式，%SB 计算；用于科学研究与数据分析的方程解析" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		此处， 
		总SB = 平均结核病数减去 平均非特异性结合.</li>
		<li>横坐标绘制 SB 的百分比 与 按抑制剂浓度排序。使用单一位点竞争分析方程拟合数据： 
		<img alt="逻辑斯蒂增长方程，y = A+(B–A)/(1+(X/C)^D)，用于数据建模与分析。" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
		此处， 
		y = SB 的百分比， 
		A = 最小值 y, 
		B = 最大值 y, 
		C = IC50, 
		X = 对数10 竞争化合物的浓度 
		D = 曲线的斜率（Hill 系数）。</li>
		<li>使用半数最大抑制浓度（IC₅₀）计算结合亲和力（Ki）50)，[3H]氟马西尼在相应膜上的作用9，以及[3根据以下数据使用公式，在检测中加入[H]氟马西尼： 
		<img alt="结合亲和力方程 Ki = IC50 / (1 + [放射性配体] / Kd)；用于药理学分析的公式。" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 受体表达与记录 非洲爪蟾 卵母细胞
<ol>
	<li>卵巢采集与卵母细胞制备
	<ol>
		<li>配制含有 88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO₃ 的无菌 Barth 溶液3，10 mM HEPES，0.82 mM MgSO₄4.7H2O，0.33 mM Ca(NO3)2.4H2O 和 0.41 mM CaCl2.6H2O，在 pH 7.4 条件下，添加 100 单位/mL 青霉素， 100 µg/mL 链霉素和 0.25 µg/mL 两性霉素B</li>
		<li>制备1x OR2培养基（不含CaCl₂）2) 用含有 88.5 mM NaCl、2.5 mM KCl、5 mM HEPES、1 mM MgCl₂ 的溶液2.6H2O，在 pH 7.4 条件下。</li>
		<li>处死一只 非洲爪蟾 在冷却的三卡因甲磺酸盐（浓度为150 mg/L，pH值调至7.4）和碳酸氢钠（300 mg/L）中深度麻醉20分钟后断头处死雌性个体。</li>
		<li>用洁净的剪刀和镊子迅速取出卵巢，并置于两个盛有40 mL 1x Barth溶液及抗生素/抗真菌剂的培养皿（10 cm）中。</li>
		<li>将未解离的卵巢在巴氏溶液中于4 °C保存最多2周 4 °C.</li>
		<li>对于解离，使用洁净的剃须刀片将卵巢切成小块（1–2 cm）3）并在不含 CaCl 的 50 mL OR2 培养基中孵育2 (OR2-无CaCl₂)2) 加入0.2% I型胶原酶，在17–19 °C 在100 mL的旋转烧瓶中缓慢振荡4–5小时。确保磁力搅拌子位于旋转烧瓶底部上方约3–5 cm处，以避免压碎卵母细胞。</li>
		<li>4–5 小时后，确认大部分卵母细胞已从滤泡中释放即，它们会各自游动）。用200 mL添加了1.8 mM CaCl₂的OR2溶液洗涤5次2.</li>
		<li>将去滤泡的卵母细胞转移至盛有Barth溶液以及抗生素/抗真菌剂的培养皿（10 cm）中，并在4°C下至少保存过夜 17 °C 在cDNA或mRNA注射之前。</li>
		<li>第二天，在双目显微镜下挑选一个具有清晰且明显动物极的健康卵母细胞 与 植物极（动物极为深棕色） 与 淡黄色表示植物极）。使用洁净的巴斯德吸管，将卵母细胞逐个转移至无菌的96孔锥形注射板中。 
		注意：进行 mRNA 注射时，卵母细胞的放置无需特殊定向；而进行 cDNA 注射时，必须将卵母细胞调整为动物极朝上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mRNA 或 cDNA 自动注射
	<ol>
		<li>使用市售试剂盒，按照推荐说明合成 mRNA。用 RNase 清洁仪器和实验台，并佩戴适当的防护手套。 
		注意：mRNA 的质量是获得良好表达的关键因素，在注射过程中防止 mRNA 降解至关重要。</li>
		<li>使用市售试剂盒制备cDNA，并将所需量溶解于双蒸水中，浓度为 0.2 µg/µL.</li>
		<li>注射10–50 nL浓度为的mRNA溶液 0.2 µg/µL，或10 nL浓度在0.02–0.2 µg/µL，最好以95个卵母细胞为一批进行操作。</li>
		<li>对于需要多个亚基的膜蛋白（即，异源多聚体α1β2γ2 GABAA 受体），按所需比例混合相应的 mRNA 或 cDNA（即1:1:1 或 1:10:1</li>
		<li>保持卵母细胞在 17 °C 以防止卵母细胞表达热休克蛋白；将微孔板存放在温控储存区域。</li>
		<li>将结合试验中呈阳性的待测化合物溶解于OR2中，浓度为0.1–1,000 µM 用于电生理记录，并将其弃置在96孔平底聚丙烯板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于表达的质粒
	<ol>
		<li>按照市售试剂盒的说明书，使用细菌T7或T6启动子进行mRNA合成，并制备 20 µL 溶液的 0.2 µg/µL 在无RNase的水中。</li>
		<li>至少准备 20 µL 含有用于cDNA表达的真核表达载体的溶液，通常在 0.2 µg/µL 溶于双蒸水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵母细胞显微注射及其质量观察
	<ol>
		<li>使用尖端直径不超过的玻璃显微注射针，注射10–50 nL含有质粒的溶液（见步骤2.3.1或2.3.2） 100 µm 安装在配备压力喷射系统或自动注射系统的显微操作仪上。 
		注意：在本示例中，卵母细胞使用适用于cDNA或mRNA的自动化系统，以每批95个进行显微注射。</li>
		<li>用注射针头吸取 1 µL 使用1%的染料（如亚甲蓝），并采用标准操作程序进行卵母细胞注射（cDNA注射至细胞核，mRNA注射至细胞质）。</li>
		<li>将注射后的卵母细胞在沸水中处理约1分钟。在双目显微镜下用剃刀片将卵母细胞切为两半。 
		注意：染料保持局部定位，如图所示 图3E，从而实现对注射过程的精确观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双电极电压钳记录
	<ol>
		<li>将含有卵母细胞的培养板放置于自动化系统上，该系统采用图示原理 图4. 
		注意：与图示的膜片钳系统不同 图5细胞的真实膜电位由电压电极读取。</li>
		<li>使用基于图标的界面来编程自动记录系统，例如采用图中所示的方案 图6 用于确定浓度与活性的关系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>曲线拟合
	<ol>
		<li>使用适当的软件分析结果，根据所示的浓度激活曲线，绘制电流幅度随激动剂浓度对数变化的曲线图。</li>
		<li>观察随后可用经验 Hill 方程拟合的 S 形曲线，其形式为： 
		<img alt="Hill方程公式；用于药理学中剂量-反应分析的Y=1/(1+(EC50/x)^nH)" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 
		此处， 
		Y= 诱发电流的比例， 
		EC50 = 达到50%激活所需的浓度， 
		x = 化合物的浓度， 
		nH = Hill系数或表观协同性。</li>
		<li>将每次反应的幅度除以1以标准化电流 与 在分析一系列细胞获得的数据时，记录最高浓度下的数值。</li>
		<li>计算平均值和标准误，并使用标准软件进行曲线拟合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑片中的电生理记录
注意：大鼠海马脑片的制备需遵循国家和机构的相关指南。
<ol>
	<li>海马切片的制备
	<ol>
		<li>配制解剖用人工脑脊液（dACSF），其中包含 124 mM NaCl 124、2.5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4、2 mM MgSO4·7H2O、2.5 mM CaCl2·2H2O、26 mM NaHCO3、10 mM 葡萄糖和 4 mM 蔗糖，并在瓶中用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体饱和。</li>
		<li>配制记录用人工脑脊液（rACSF），其中包含 124 mM NaCl、5 mM KCl、1.25 mM KH2PO4、2 mM MgSO4·7H2O、2.5 mM CaCl2·2H2O、25 mM NaHCO3 和 10 mM 葡萄糖，并在瓶中用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体饱和。</li>
		<li>使用 2.5% 异氟烷与纯氧的混合气体麻醉大鼠，随后进行断头处死。</li>
		<li>使用精细剪刀沿中线剪开头皮。沿中线切开颅骨，注意不损伤下方组织。用镊子移除颅骨，并用精细刮匙取出脑组织。</li>
		<li>将脑组织置于室温下已通入混合气体的 dACSF 溶液中，使用精细刮匙分离左侧海马结构。</li>
		<li>使用组织切片机从海马中部切取横切片（厚度为 400 µm），并用画笔将其转移至记录室。在室温下维持切片 45 分钟。</li>
		<li>以 35 °C、1.5 mL/min 的流速用已通入混合气体的 rACSF 对切片进行灌流，同时用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体持续鼓泡。
		 
		注：完成此步骤后，切片即可用于电生理实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单群体峰电位记录
	<ol>
		<li>将一片脑切片放入显微镜载物台上的记录室中。</li>
		<li>以 3 mL/min 的流速用 rACSF 对切片进行灌流。</li>
		<li>使用拉针仪制备硼硅酸盐玻璃微电极，使其电阻约为 2 MΩ。
		 
		注：该微电极用作记录电极，并与放大器电连接。</li>
		<li>用含 2 M NaCl 的溶液填充微电极，并将其插入放大器的电极夹持器中。</li>
		<li>使用右侧显微操作器将记录微电极定位至海马切片 CA1 区的锥体细胞层。
		 
		注：该位置在 图7 中有示意图表示。</li>
		<li>将一根绝缘双极铂/铱电极置于左侧显微操作器的夹持器中。
		 
		注：该电极用作刺激电极，并与刺激发生器电连接。</li>
		<li>使用右侧显微操作器将刺激电极定位至海马切片 CA1 区的Schaffer侧支。
		 
		注：该位置在 图7 中有示意图表示。</li>
		<li>通过刺激发生器每隔 30 秒向刺激电极施加一个电流脉冲（持续时间为 100 µs，起始强度为 10 µA），并逐步增加刺激强度，直至出现群体峰电位（PS）。</li>
		<li>调节刺激强度，使诱发的群体峰电位（PS）幅度达到最大可诱发幅度的 45%。PS 信号通过信号放大器以 2.4 KHz 滤波，并以 20 KHz 进行数字化采样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双脉冲抑制实验
	<ol>
		<li>制备脑切片（步骤 3.1），并按前述方法操作（步骤 3.2.1–3.2.7）。</li>
		<li>通过刺激发生器每隔 30 秒向刺激电极施加两个电流脉冲（持续时间均为 100 µs，间隔为 20 ms），并将刺激强度设定为诱发幅度为最大值 45% 的群体峰电位（PS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物测试
	<ol>
		<li>将待测化合物用已通入混合气体的 ACSF 进行稀释，确保终浓度中 DMSO 不超过 0.1%。</li>
		<li>在对照溶液中加入与化合物溶液中相同浓度的 DMSO。</li>
		<li>每隔 30 秒记录一次由 Schaffer 侧支刺激诱发的单脉冲（步骤 3.2）或双脉冲（步骤 3.3）群体峰电位（PS），持续至少 30 分钟。在此基线期，PS 波形应保持稳定。</li>
		<li>准备一个烧杯，其中盛有含固定浓度待测化合物的已通入混合气体的 rACSF 溶液。</li>
		<li>用该溶液对海马切片进行灌流，同时继续记录单脉冲或双脉冲 PS。</li>
		<li>通过用不含化合物的已通入混合气体的 rACSF 对切片进行灌流，评估化合物效应的恢复情况。
		 
		注：对于可逆性效应，PS 波形将恢复至施加化合物前基线期所观察到的初始状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用数据分析软件将实验过程中记录的 PS 信号按每 4 个一组进行平均。</li>
		<li>测量平均后波形的 PS 幅度。</li>
		<li>将幅度归一化为施加化合物前 10 分钟内记录的基线值的百分比。</li>
		<li>数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者 Frédéric Knoflach 和 Maria-Clemencia Hernandez 为瑞士巴塞尔 4070 的制药公司 F. Hoffmann-La Roche AG 的员工。作者 Daniel Bertrand 为瑞士日内瓦 Vésenaz 1222 Compois 路 6 号 HiQScreen Sàrl 公司的员工，该公司为制药企业提供筛选服务。

开发作用于配体门控离子通道（如GABAA受体）的新型化合物需要采用多种方法。通常，第一步常通过结合实验进行；然而，此类测量不足以表征化合物的生理活性或其精确的药理学特性。特别是，能够与受体结合的化合物可能增强或抑制其功能，甚至不产生任何功能性效应（即为“沉默”状态）（即，与受体结合但不改变其功能）。因此，必须进行功能性检测，以实现对化合物的全面表征。
结合实验： 
结合实验的主要优势在于，它能够高效地对多达数千个样品进行检测，并可提供活性分子的结合亲和力。如本文所述，第一步是建立针对目标受体亚型的检测方法。具体而言，尽管结合实验可在来源于组织组分或完整脑组织的天然受体上进行，但这种方法将无法测定特定受体亚型上的亲和力。因此，有必要使用重组表达系统来对目标分子进行筛选。如今，在细胞系中瞬时或稳定转染目标受体亚基的cDNA，已成为表达特定受体亚型（例如，GABAA α5β3γ2）的一种高效且可靠的方法。传统的结合实验依赖放射性配体，但目前已有多种技术可避免放射性操作带来的不便（例如，基于定量荧光的配体结合检测法）。
在宿主系统中的功能表达： 
为了在宿主系统中表达基因，必须将目的编码序列插入含有适当启动子的质粒中。通常，对于 体外 mRNA合成通常使用细菌T7或T6启动子。对于cDNA表达，目的基因的转录必须由真核生物启动子（如CMV（巨细胞病毒）或类似启动子）调控。目前，已有多种质粒同时包含这两种启动子即，pUNIV、pCMV-6AC、psf-CMV/T7、pCI-neo、pcDNA）可供选择，可用于实现 体外 mRNA 或 cDNA 表达的合成，如图所示 图15. GABA 表达的检测A 受体可从细胞系或在 非洲爪蟾 卵母细胞。后者的优点主要在于无内源性受体表达、操作简便，以及具备自动化显微注射与记录系统。本方案所述步骤展示了该自动化系统的高效性，可在约7分钟内完成96个卵母细胞的注射，且无需显微操作技能。需注意，单个卵巢所获取的 非洲爪蟾 含有10,000至30,000个卵母细胞，显然可在单次制备样本上进行大量细胞水平的测量。此外，通过cDNA注射可实现基因表达，因此用于结合实验的相同质粒可直接用于功能表征，无需进一步的分子生物学操作。
由于卵母细胞体积较大且表面表达水平高，单个卵母细胞所获得的受体数量大约相当于一个35 mm培养皿中汇合细胞的产量。然而，与细胞系相比，卵母细胞的制备和注射成本仅为其一部分，因为该实验无需特定的培养基和无菌操作。单个GABAA通道的激活可产生数皮安（10-12）的电流，而在单个卵母细胞中记录到的电流可高达数十微安（10-6），这证实了在一次反应中数百万个受体同时发挥作用。
配体门控离子通道表征的第一步通常是测定受体的表观亲和力。所需进行的实验包括施加一系列短暂的激动剂测试脉冲，并将诱发电流的幅度或在某些情况下曲线下面积（AUC）对激动剂浓度的对数作图。由于在同一组卵母细胞中显微注射不同浓度和比例的质粒是很容易实现的，因此该表达系统特别适用于此类表征。此外，批次间的比较显示不同EC50值具有高度稳定性。使用蜘蛛图可以直观地展示亚基组成对受体表观亲和力的影响，如图10所示。
双电极电压钳实验所获得的结果 非洲爪蟾 卵母细胞常与采用膜片钳电极记录的方法进行比较。尽管对这两种系统进行详细比较将超出本研究的范围，但仍可考察若干要点。尽管细胞中的膜片钳技术在快速给药条件下的生物物理表征方面具有优势，但其操作要求比双电极记录更为复杂 非洲爪蟾 卵母细胞。一个首要且不可忽视的困难在于目标蛋白的表达，这需要进行细胞培养、瞬时或稳定转染，并鉴定出表达目标构建体的细胞。此外，必须考察所选细胞中内源性表达可能产生的影响。同时，膜片钳记录需要由熟练的操作人员在高倍显微镜下进行显微操作，且该人员还需在实验过程中进行适当的分析，以评估封接质量、通路电阻等参数。 等等。 相比之下，双电极电压钳记录（尤其是使用自动电生理系统的记录）不需要特殊技能，实验室技术人员即可完成。
在购置电生理实验装置时，成本因素无疑是需要仔细分析的重要方面。例如，尽管自动化系统的成本相对较高，但进一步比较发现，安装一套完整的电生理实验系统需要购买多种设备，包括高性能显微操作器、双目透镜、放大器、灌流系统和防震台，同时还需进行数据采集与分析。两种电极电压钳装置之间的成本比较 与 膜片钳装置进一步揭示了更多差异。此外，自动化系统具有设备全自动运行的优势，可全天候无人值守操作。
化合物的药理学特性由其在受体上的作用方式决定。例如，竞争性抑制剂是能够进入与激动剂相同结合位点（即正构位点）的分子，从而产生竞争。非竞争性抑制剂则是通过与另一个位点相互作用来抑制受体功能的化合物，在配体门控离子通道的情况下，这类抑制剂可进入并阻断离子孔道。深入探讨各种相互作用机制已超出本研究的范围，但更多相关信息可参阅药理学教科书，或参考其他文献，如 Bertrand 和 Bertrand 的研究22。
对于变构调节剂而言，化合物结合于与正构位点不同的位点，但该分子的存在会改变受体在激活态与其他状态之间的能量势垒。正向变构调节剂（PAMs）是一类能够降低受体从静息态转变为激活态所需能量势垒的化合物，从而增强激动剂的作用效果。因此，为了表征可能存在的PAM效应，有必要确定该化合物是否能够增强激动剂引起的反应，以及产生增强效应的具体浓度。在图11和图14中展示的实验说明了可用于GABAA受体上PAMs表征的可行实验方案。
在某些情况下，单独暴露于PAM可能足以激活受体。此类活性可通过对此处所述实验方案进行轻微修改来确定。具体而言，不再在暴露于GABA的同时共施加调节剂，而是可将方案修改为先单独施加待测化合物，然后再在GABA存在的情况下施加。通过测定化合物本身所诱发反应的幅度，并与GABA诱发的电流进行比较，即可表征其直接激动活性。
在脑切片中进行的实验，如图所示 图7用于在推进动物模型研究及临床试验路径之前，确认化合物在特定抑制性环路中天然受体上的活性。相对简单的数据记录与分析流程，可通过对不同化合物对PS振幅调节效应的评估，实现对多种化合物的活性排序。此外，还可检测与GABA系统无关的化合物非特异性效应。例如，当观察到突触后电位（PS）形态发生变化时）。在这些情况下，可通过全细胞膜片钳技术测量化合物对抑制性突触后电流（IPSCs）的影响，以评估直接的GABA能神经传递作用8.

本文介绍了针对 GABAA 受体活性化合物的发现方案，涵盖从结合到生理学与药理学的各个环节。在寻找特异性作用于 GABAA 受体的新分子时，至关重要的是尽可能精确地定义目标亚型，并评估新发现化合物的特异性（例如，综述见 Rudolph 和 Knoflach1 或 Sieghart2）。药物发现的典型路径及所需完成的步骤如图1所示。
结合实验长期以来一直是药物发现的第一步，并且至今仍被广泛使用。对于GABAA受体而言，这类实验经过优化，可用于鉴定能够结合到受体苯二氮䓬结合位点的化合物，该位点正是具有治疗价值且安全性良好的药物的作用部位。其他技术则采用基于荧光成像微孔板读数仪（FLIPR）的膜电位红色染料检测方法3，用于发现如巴比妥类药物等结合于其他附加位点的化合物，但由于这些位点常伴随不良副作用，因此并不理想。此外，所使用的染料可能直接激活GABAA受体，从而对这些实验在药物发现中的应用价值提出质疑4。结合实验仅能提供某一化合物可与特定受体类别结合的证据。体外实验利用细胞膜来鉴定选择性的人源GABAA α5β3γ2受体配体。通过瞬时转染表达人源GABAA α5β3γ2、α1β3γ2、α2β3γ2和α3β3γ2受体的HEK293细胞，制备实验所需的细胞膜。配体的作用通过检测膜受体上结合的[3H]氟马西尼的闪烁信号来测定（即对[3H]氟马西尼结合的抑制作用）。该技术的主要优势在于，能够快速、高效地测定化合物在目标受体上的结合亲和力。
功能研究对于评估化合物的功能活性，以及提出化合物与受体结合所引起机制的生理学和药理学解释至关重要。目前公认，功能性GABAA受体由五个亚基围绕离子孔道形成的假对称轴组装而成，也可由五个相同亚基组装形成。大多数GABAA受体由两种或更多不同的亚基组成。例如，大脑中主要的GABAA受体由α1、β2和γ2亚基构成，其化学计量比分别为2、2和15,6。在宿主系统（如Xenopus卵母细胞或HEK293细胞）中进行重组，可快速探索这些受体的药理学特性。
随后通过脑片细胞外记录来研究这些化合物的药理学特性7。该方法可用于探究化合物对神经传递的影响，并提供一种有效手段，以在神经元整体环境中，于天然受体水平上验证在异源表达系统中所确定的化合物功能效应。GABA能神经传递也可通过检测化合物对抑制性突触后电流（IPSCs）的影响，在分子水平上进行评估8。但此处所采用的基于脑片全细胞膜片钳记录的方案更为复杂，通量较低。
最后，该方法的优点与局限性 体外 讨论了用于鉴定α5β3γ2选择性配体的筛选级联，重点分析了不同技术及其内在局限性。本研究旨在为GABA领域的专家和非专家提供参考A 受体 不同组合的综合评述 体外 用于发现这些配体门控离子通道新调节剂的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;通用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞收集器 -（Filtermate 196）&amp;nbsp;</td><td>帕卡德</td><td></td><td>过滤结合了放射性配体的膜</td></tr><tr><td>微量滴定板液体闪烁计数器（Top Count NXT）</td><td>帕卡德</td><td></td><td>微孔板闪烁和发光计数器</td></tr><tr><td>Vial 液体闪烁计数器（Beta-Couter 2500 TR）</td><td>帕卡德</td><td></td><td>小瓶闪烁和发光计数器</td></tr><tr><td>液体&amp;nbsp; 移液工作站（Biomek 2000）</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>配制化合物稀释液</td></tr><tr><td>涡旋振荡器（Vortex Genie 2）</td><td>Scientific Industries 公司</td><td></td><td>混合化合物储备液</td></tr><tr><td>组织匀浆器（Polytron PT1200E）</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>重悬膜制备物</td></tr><tr><td>XLfit5 软件</td><td>Microsoft Excel&lt;br/&gt; &amp;nbsp;IDBS 增强模块</td><td></td><td>曲线拟合软件</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>电极拉制仪</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>自动化注射（非洲爪蟾卵母细胞）</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>自动电压钳&lt;em&gt;Xenopus&lt;/em&gt; 卵母细胞</td></tr><tr><td>数据挖掘</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel Systems</td><td>-</td><td>数据处理软件</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>低噪声数据采集系统</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 或同等型号</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>可编程信号调节器</td></tr><tr><td>pClamp 程序套件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>防震台&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>为避免微电极振动&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar 微操纵器</td><td>科学仪器</td><td></td><td>准确放置脑片中的微电极</td></tr><tr><td>法拉第笼&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>为消除噪声干扰而分离记录信号</td></tr><tr><td>McIlwain组织切片机</td><td>Campden Instruments LTD&amp;nbsp;</td><td></td><td>制备脑切片</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃微量移液管&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>记录脑片中的细胞外电位</td></tr><tr><td>双绞铂铱丝刺激电极</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>刺激脑切片以施加电流</td></tr><tr><td>用于电流和电压驱动刺激的刺激发生器</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>向刺激电极输送电流</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板圆底</td><td>康宁</td><td>#3365</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>GF/C 玻璃纤维滤底 96 孔微孔板，孔径 1.2 &amp;micro;m 孔径，用于使用真空 manifoldwell 过滤器进行细胞收获测定&amp;nbsp;</td><td>帕卡德&amp;nbsp;</td><td>#6005174</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#352070</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>安全锁扣管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>安全锁扣管 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>180 mL 运输管&amp;nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&amp;nbsp;</td><td>#3722</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>6 mL 聚乙烯小瓶&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>顶部密封&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#60051859</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>旋转烧瓶</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>旋转烧瓶</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; 孔板（锥形）</td><td>赛默飞世尔科技 Milian</td><td>56368</td><td>卵母细胞注射板</td></tr><tr><td>96&amp;nbsp; 培养板（平底）</td><td>Corning（Vitaris 瑞士）</td><td>3364-冠</td><td>用于HiClamp的化合物板</td></tr><tr><td>玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Hilgenberg（德国）</td><td>-</td><td>硼硅酸盐玻璃，外径1.2，内径0.76，带纤维丝</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 合成</td></tr><tr><td>化学品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测定缓冲液：KCl 5 mM；CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM；MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1.25 mM；NaCl 120 mM；Tris 15 mM，用 HCl 调节 pH 至 7.4；4 ℃ 保存，最长可保存 3 个月 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液：Tris 50 mM-HCl，pH 7.4；4 ℃保存 &amp;deg;C.</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>测试化合物的DMSO储备液（10 mM）</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>氟马西尼（RO0151788）10 mM 溶于 DMSO</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>地西泮 4 mM 溶于 DMSO</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;[H]-氟马西尼 60-85 Ci/mmol，溶于乙醇；-20℃保存 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>Microscint 40&amp;nbsp;</td><td>帕卡德&amp;nbsp;</td><td>#6013641</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>Ultima Gold&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>#6013329</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>抗生素 / 抗真菌剂</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>I 型胶原酶</td></tr><tr><td>RNase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>人工脑脊液用盐类（NaCl、KCl 等）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;膜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自瞬时或稳定转染的过表达不同人源GABA受体的HEK293细胞的冷冻膜制备物&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; 受体亚型： &amp;alpha;1&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;2&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;3&amp;beta;3&amp;gamma;2, &amp;alpha;5&amp;beta;3&amp;gamma;2. 参见 Ballard &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2009年以获取详细方法。</td><td></td><td></td><td>用于结合实验</td></tr></tbody></table>

调控γ-氨基丁酸a型受体神经传递的新型化合物发现方法

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

本文提供了一种针对γ-氨基丁酸A型（GABAA) 受体及其在临床前实验中用于鉴定新型活性分子的应用 体外 重组受体与其在啮齿类动物脑片中天然受体上的药理效应。对于作用于受体苯二氮䓬位点的化合物，第一步是建立初级筛选，包括在表达主要GABA受体的细胞膜上开发放射性配体结合实验。A 亚型。随后，利用啮齿类和人类GABA的异源表达A 受体在 非洲爪蟾 卵母细胞或HEK 293细胞中，可通过电生理实验研究不同受体亚型的生理特性以及所鉴定化合物的药理学特性。 非洲爪蟾 本文将介绍卵母细胞系统，内容从卵母细胞的分离及其显微注射不同mRNAs开始，到利用双电极电压钳进行药理学表征。最后，将描述在啮齿类动物脑片上进行的记录，该记录作为次级生理学检测手段，用于评估分子在其天然受体及明确神经环路中的活性。同时演示使用多神经元群体反应进行的细胞外记录及药物应用。

本文介绍了从结合到生理学和药理学层面发现作用于GABAA受体的活性化合物的实验方案。

调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

本文提供了一种针对γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体筛选化合物的逐步实验方案，及其在……中的应用。

本视频的总体目标是展示一种筛选级联方法，用于发现新型 GABA-A 受体配体。通过迭代方式结合使用放射性配体结合实验、非洲爪蟾卵母细胞的电生理记录以及啮齿类动物脑片电生理记录，其优势在于能够不断优化化合物的特性。最终可鉴定出高效、亚型选择性强且具有活性的化合物。本演示将由 HiQScreen 的 Kumico Kambara、Jenna Tognaccini、Sonia 和 Daniel Bertrand 以及罗氏的 Marie Claire Pflimlin 完成。使用安装在配有压力喷射系统或自动注射系统的显微操作器上的玻璃微量注射针，注入 10 至 50 纳升含有质粒的溶液，注射针尖端直径不超过 100 微米。开始该操作时，将卵母细胞保持在 17 摄氏度，以防止热休克蛋白的表达。将微孔板存放在温度可控的储存区域。然后，将OR2结合实验中检测呈阳性的测试化合物分别溶解于0.1和1000微摩尔浓度，用于电生理记录，并将其加入96孔平底聚丙烯板中。为进行双电极电压钳记录，将含有卵母细胞的板放置于自动系统上。使用基于图标的界面按照此方案对自动记录系统进行编程，以适当确定浓度-活性关系。进行曲线拟合时，参考所示的浓度-激活曲线，将电流幅度作为激动剂浓度对数值的函数进行绘图。进行电生理记录时，将脑组织置于室温下用碳氧混合气饱和的dACSF溶液中。然后，用精细的解剖刀分离左侧海马结构。随后，使用组织切片机从海马的中段切取厚度为400 µm的横切片。用毛笔将切片转移至记录室，并在室温下维持45分钟。随后，用以碳合气饱和、温度为35摄氏度、流速为每分钟1.5毫升的回收型人工脑脊液（rACSF）灌注脑片。为记录单个群体峰电位，将脑片置于显微镜载物台上的记录室中，并以每分钟3毫升流速的回收型人工脑脊液（rACSF）进行灌注。使用拉针仪将一根硼硅酸盐玻璃微电极拉制成电阻约为两兆欧姆的尖端。用含有两摩尔氯化钠的溶液填充该微电极，并将其装入电极 holder 中。使用右侧的显微操作器，将记录用微电极置于海马脑片 CA1 区的锥体细胞层（stratum pyramidale）中。随后，将绝缘的双极铂铱电极插入左侧显微操作器的电极 holder 中。使用左侧显微操作器，将刺激电极置于海马脑片 CA1 区的 Schaffer 侧支处。利用刺激发生器，每 30 秒向刺激电极输送一次电流脉冲，并逐步增加刺激强度，直至出现群体峰电位。调节刺激强度，以诱发相当于最大可获得幅度45%的群体峰电位。为进行成对脉冲抑制实验，使用刺激发生器每隔30秒向刺激电极输送两个电流脉冲。将刺激强度设定为诱发相当于最大幅度45%的群体峰电位。为了测试化合物，将待测化合物用人工脑脊液（ACSF）进行稀释，使DMSO的终浓度不超过0.1%。在对照溶液中加入与化合物溶液相同浓度的DMSO。每隔30秒记录一次由Schaffer侧支刺激诱发的单个或成对脉冲群体峰电位，持续至少30分钟。在此基线期，群体峰电位的波形应保持稳定。接下来，准备一个烧杯，其中装有含固定浓度待测化合物的碳合人工脑脊液（rACSF），并在记录单脉冲或双脉冲群体峰电位期间，将该溶液灌流至海马脑片。此外，通过使用不含该化合物的碳合rACSF灌流脑片，评估化合物作用后的恢复情况。图中所示为大鼠海马脑片的示意图，以及起源于CA3锥体细胞轴突的Schaffer侧支投射至CA1锥体神经元树突分支的结构。将微电极置于锥体细胞层以记录群体峰电位，并置于辐射层以记录树突的场兴奋性突触后电位。刺激电极放置于Schaffer侧支内。该图显示了通过同一刺激电极以20毫秒间隔施加成对刺激所诱发的群体峰电位。群体反应对第二个刺激的反应幅度小于对第一个刺激的反应幅度。在不存在和存在β-CCM（一种非选择性GABA A受体负向变构调节剂）的情况下记录了群体峰电位。β-CCM通过部分阻断任何前馈性GABA能抑制，增强了第二个群体峰电位的幅度。通过该实验步骤，还可进一步开展药代动力学、受体占有率及体内功效以及安全性药理学等其他方法，以回答有关所鉴定化合物临床开发潜力的其他问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

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BS3 化学交联实验：评估慢性应激对啮齿类动物脑内细胞表面 GABAA 受体表达的影响

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Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

学习利用放射配体结合与电生理技术筛选GABA A受体配体的方法，结合Xenopus卵母细胞与大鼠脑片模型，系统鉴定具有亚型选择性的候选化合物，为中枢神经系统药物研发提供可靠实验策略。

调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

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