Name: Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin zebra balığı embriyo ve yetişkin beyinlerinden primer hücre kültürü hazırlama ve transfeksiyon yöntemini. Bu teknik yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme ile hücreler arası dinamikleri incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

T. Fritsch, A. kurt-Asseburg, ı. Linde ve S.-M teşekkür ederiz. Tokarski mükemmel hayvan bakım ve teknik destek için. Yoğun ve yararlı tartışmalar için Köster laboratuvar Tüm üyeler için minnettarız. Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) ve Federal Devlet Aşağı Saksonya, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından finansman minnetle anıyoruz.

<ol><li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+fish+and+men%3A+using+zebrafish+to+fight+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).</li>
<li>Sassen, W. A., Köster, R. <a target="_blank" href="https://www.ingentaconnect.com/content/doaj/11799870/2015/00002015/00000001/art00004">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. , 151(2015).</li>
<li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).</li>
<li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).</li>
<li>Driever, W., Rangini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cell+line+derived+from+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).</li>
<li>Badakov, R., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+primary+zebrafish+fibroblasts+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection.</a> Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).</li>
<li>Senghaas, N., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transfecting+zebrafish+PAC2+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).</li>
<li>Piperno, G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+specific+for+an+acetylated+form+of+alpha-tubulin+recognize+the+antigen+in+cilia+and+flagella+from+a+variety+of+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).</li>
<li>Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+phalloidin+and+nucleotide-binding+sites+on+actin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin.</a> European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, E1717(2010).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum%2C+intermediate+compartment%2C+and+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li>
<li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+proteins+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
<li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin%2C+a+stabilizer+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+dynamics+inside+cells+using+a+rationally+designed+photoconvertible+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein.</a> Nature Methods. 5, 339-345 (2008).</li>
<li>Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+chromosomal+localizations+of+two+human+genes+encoding+synaptobrevins+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133, 916-927 (2008).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, iki farklı protokol 2 dpf zebra balığı embriyo veya yetişkin zebra balığı beyin Kültür primer hücre için mevcut.
2 dpf zebra balığı birincil hücre kültürleri hazırlanması temel hücre kültürü teknikleri deneyimi olan herkes için gerçekleştirmek nispeten kolaydır. Ancak, iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yeterli sayıda embriyo malzeme başlangıç olarak çok önemlidir (100 olduğunu en azından). Embriyo yükseltme sırasında tüm olası kaynaklarını kirlenme mikroplar ve parazitler...

Zebra balığı (Danio rerio, D. rerio) temel ve Biyomedikal araştırma1çok sayıda alanlar için omurgalı popüler bir modeldir. Zebra balığı embriyolar rahimhızla geliştirmek, şeffaf ve böylece canlı bir organizma olarak omurgalı geliştirme eğitim mükemmel önkoşulları sağlayan bir mikroskop altında Sığdır. Zebra balığı2genetik tractability nedeniyle, birçok istikrarlı transgenik muhabir satırları hücre türüne özgü ifade çeşitli floresan işaretleri ile belirli hücre popülasyonlarının gözlem için izin kurulmuştur. Zebra balığı topluluk sentetik Kal4TA4 (veya KalTA3-eşdeğer GalFF) ifade bir transgene taşımaya sözde Gal4-sürücü satırları geniş sunar gen Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı Maya ile erimiş viral transkripsiyon harekete geçirmek hücre türüne özgü arttırıcılar kontrolü altındaki etki alanları. Bu sürücü satırları transgenes bir muhabir gen erimiş bir tanımlanmış ters yönde harekete geçirmek sırasında (UAS) oluşan taşımak efektör satırlar için üzerinden geçilen. Kal4TA4 protein böylece hücre türü Seçici ifade muhabir gen3,4aktive UAS öğesine bağlar. Hemen hemen tüm kullanılabilir artırıcı ve muhabir'ndaki öğelerin çift transjenik hayvanlar çok çeşitli Kombinatorik çalışmaları için bu yaklaşım sağlar.
Ancak, tek tek hücreler veya hücre altı içeriklerini odaklanmak ile derinlemesine canlı görüntüleme bir bütün ve sürekli değişen embriyo sınırlıdır. Belirli hücre biyolojik soruları ile en yüksek çözünürlük için hücre kültürlerinde kullanımı genellikle tercih edilir. Zebra balığı, bazı hücre satır yok, ama ağırlıklı olarak seçilen5,6,7 olarak kabul edilir ve onların yayılma kez zaman alır. Ayrıca, tüm kullanılabilir hücre satırlarını türetilmiş, fibroblast hücreleri bir tür hücre kültürü kullanarak deneyler sınırlama vardır. Bu nedenle, biz doğrudan doğruya--dan zebra balığı embriyo ve yaklaşımlar ve uzun ömürlü kültür artırmak ekili çeşitliliği genişletmek için birlikte yetişkin zebra balığı beyin primer hücre hazırlamak için hem bir etkili ve kullanımı kolay iletişim kuralı kurulan hücre tipleri. Buna ek olarak, biz embriyonik primer hücre ifade yapıları floresan organel işaretleri ile transfect için bir yordam mevcut. Böylece, hücresel türleri Morfoloji ve hücre altı yapıları korumak onların temel özellikleri farklı hücre tipleri yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte ile çözümlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Balık hatları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (vahşi tip)</td><td></td><td></td><td>Streisinger ve meslektaşları tarafından kurulan, Zebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'nden (ZIRC) temin edilebilir</td></tr>, <tr><td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>zebrabalığı gen<inin geliştiricisinin >floresan protein EGFP'nin ekspresyonunu yönlendirdiği kararlı transgenik hat (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>kararlı transgenik çizgi> Xenopus nöral-spesifik beta tubulin promotörünün, floresan protein DsRed&nbsp'nin ekspresyonunu yönlendir<diği; (Peri ve N&uuml; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5804</td></tr><tr><td>R ChemiDoc MP görüntüleme sistemi</td><td>BioRad</td><td></td><td>1 da embriyo konfokal lazer tarama mikroskobu içeren Petri kaplarının siyah-beyaz görüntülerini elde etmek için kullanılan model XRS+</td></tr><tr><td></td><td>Leica mikrosistemleri</td><td></td><td>model SP8, 28 & derece ile donatılmış; C sıcaklık kutusu ve 63X objektif</td></tr><tr><td>epifloresan mikroskop</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>model DM5500B, 28 & derece ile donatılmıştır; C sıcaklık kutusu ve 40X objektif</td></tr><tr><td>Gen Pulser Kapasitans genişletici ile Xcell</td><td>BioRad</td><td>1652661</td><td>elektroporasyon cihazı</td></tr><tr><td>Yatay çalkalayıcı</td> Hücre kültürü için <td>GFL</td><td></td><td>model 3011</td></tr><tr><td>inkübatör (28 &derece; C)</td> <td>Memmert</td><td></td><td>model inkübatör I</td></tr><tr><td>embriyolar için inkübatör (28 &° C; C)</td> <td>Heraeus</td><td></td><td>tipi B6120</td></tr><tr><td>ışık mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>model TELAVAL 31</td></tr><tr><td>mikro pipetler</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steril çalışma tezgahı</td><td>Bio Base</td><td></td><td>, laminer akışlı ve UV ışıklı</td></tr><tr><td>cımbızlı</td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5, Inox</td></tr><tr><td>dikey tüp döndürücü</td><td>Labinco B.V.</td><td></td><td>model LD-79</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Yazılımı</td><td>BioRad</td> ImageJ Ulusal <td>Enstitüleri'nden ChemiDoc MP görüntüleme sistemi için BioRad</td><td></td></tr><tr><td></td><td> İlgili</td> siyah-beyaz görüntülere Parçacıkları Sayma aracını uygulayarak 1 dpf embriyoyu saymak için kullanılan sağlık<td></td><td>; Rasband, W.S., ImageJ, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, ABD, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>Leica Microsystems'den hem konfokal hem de epifloresan mikroskoplar için</td> <td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1599</td>, <td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 7</td><td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2379</td>, <td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 3865</td>, <td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2199</td>, <td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 4330</td>, <td>omurga pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2291</td>, <td>omurgaya dayalı pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&ouml; ster Lab</td> <td># 1062</td><td>, Stratagene Plazmid numaralarının pBluescript omurgasına</td></tr><tr><td>dayanarak, K&ouml'un veritabanı girişlerine bakın; ster laboratuvarı. Plazmitler istek üzerine temin edilebilir.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plastik ve cam eşya</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Hücre Süzgeci (40 & mikro; m)</td> BD Bioscience tarafından dağıtılan <td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>, " iniş ağı" Sarısı alınmış embriyoları etanole daldırmak ve bunları hızlı bir şekilde taze hücre kültürü ortamına aktarmak</td></tr><tr><td>için 1.5 mL reaksiyon tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>50 mL falkonik tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 &mikro; m)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td>, <td>havalandırma yuvaları ile; kollajenaz aracılı ayrışma elektroporasyon küvetinden sonra hücreleri filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>küvet (0,4 cm)</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>cam lameller</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri (plastik; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları (plastik; çap 10 cm)</td>Zebra <td>balığı embriyoları için</td> <td>Sarstedt</td><td>821473</td></tr><tr><td>pipet uçları</td><td>Sarstedt</td><td>Blue (1000 & mikro; l): 70762; Sarı (200 & mikro; l): 70760002; Beyaz (10 & mikro; L): 701116</td><td></td></tr><tr><td>steril hücre kültürü kapları (plastik; çap 3 cm)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>steril hücre kültürü kapları (plastik; çap 6 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>steril Petri kapları (plastik; çap 10 cm)</td><td>Beyin diseksiyonu için</td> <td>Sarstedt</td><td>83.3902</td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kimyasallar ve Reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS'de %4 paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum nitrat tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>etanol pa %100</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>keçi ve alfa;-fare IgG (Fc'ye özel) FITC konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>yüksek vakumlu gres</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>kendi kendine yapılan cam alt yemekler için kullanılan silikon gres</td></tr><tr><td>magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>metilen mavisi</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-Tubulin, Asetillenmiş antikor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (montaj ortamı)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Eşanlamlı: Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenase (Tip 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>tozu hücre kültürü ortamında (8 mg / mL) çözün ve çözeltiyi steril süzün, alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>pronaz (Streptomyces griseus'tan)</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>Sigma-Aldrich tarafından dağıtılır,% 30 Danieau (10 mg / mL) içinde çözülür ve alikotları -20 ° C'de saklar; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Hücre kültürü için ortam ve çözümler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-169</td>, <td>Thermo Fisher Scientific tarafından dağıtıldı</td></tr><tr><td>CO2</alt> bağımsız ortam</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>18045054</td><td>Thermo Fisher tarafından dağıtılmaktadır Scientific</td></tr><tr><td>filtrelenmiş sığır serumu (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>bireysel toplu</td></tr><tr><td>glutamin 100x</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Thermo Fisher Scientific tarafından dağıtılan</td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 ortamı</td><td>Gibco Life tarafından dağıtılmaktadır. Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>tarafından dağıtılan teknolojiler 11415049</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15140148</td><td>Thermo Fisher Scientific tarafından dağıtılmaktadır</td></tr></tbody></table>.

kültür ve zebra balığı primer hücre transfection

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebra balığı embriyo şeffaf ve hızla böylece bir sağlam ve gelişmekte olan omurgalılar dinamik biyolojik süreçlerin mükemmel vivo içinde görüntüleme için izin Anne, dışarıda geliştirmek. Ancak, farklı hücre tipleri ve hücre altı yapıları türleri morfoloji ayrıntılı görüntüleme tüm bağlar sınırlıdır. Bu nedenle, etkili ve kullanımı kolay bir iletişim kuralı kültür canlı primer hücre için zebra balığı embriyo ve yetişkin doku kurduk.
Kısaca, dechorionated, deyolked, steril ve collagenase sahip tek kişilik hücrelerin ayrışmış 2 dpf zebra balığı embriyo vardır. Filtrasyon adımdan sonra primer hücre cam alt yemekleri kaplama ve birkaç gün için ekili. Taze kültürler, olduğu kadar uzun vadeli differenciated olanlar, yüksek çözünürlüklü confocal görüntüleme çalışmaları için kullanılabilir. Kültür çizgili miyositler ve poli-L-lizin kaplama üzerinde önemli varlık nöronlar ile farklı hücre türleri içerir. Özellikle etiket hücre altı yapıları için floresan marker proteinler tarafından plazmid DNA nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, içine transfection sağlayan bir adım iletişim kuralı da kurduk. Böylece, operatör huzurunda tanımlanmış uyaranlara, karmaşık hücre davranış ve hücre içi birincil zebra balığı hücre dinamiği yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile değerlendirilebilir. Buna ek olarak, Yetişkin zebra balığı beyin kullanarak, açıklanan ayrılma tekniği gibi temel kodlamayla koşulları da yetişkin zebra balığı doku için iş göstermektedir.

Şekil 1G çizgili miyositler ve en bol olan nöron benzeri hücre kümeleri ile vahşi türü embriyo elde tipik bir kültürün iletilen bir ışık görüntü gösterir. Bazı hücre tipleri daha kolay tanımlamak için hücre türüne özgü ifade floresan bir protein ile transgenik bir çizgi olabilir (Şekil 1 H) kullanılır.
PCS2 + transfection-floresan protein (eGFP)15</sup...

Biz birincil hücre kültürleri zebra balığı embriyo transfection ve canlı hücre görüntüleme gibi primer hücre--dan yetişkin zebra balığı beyin hazırlamak için bir protokol için hazırlanması için etkili ve kullanımı kolay bir protokol mevcut.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Bu yöntem, zebra balığı topluluğuna, in vivo olarak elde edilemeyen bir çözünürlükle hücreler arası dinamiklerin analizi için bir araç sağlar. Ayrıca zebra balığı hücre hatlarının eksikliğini telafi etmeye izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, bu birincil hücreleri doğrudan orijinal dokudan izole etmeniz ve aktarmanızdır, böylece hücre hatlarını tutmanıza gerek kalmaz.Protokole başlamak için zebra balığı embriyolarını döllenmeden iki gün sonra veya dpf'yi hazırlayın. Birinci gün, tercih edilen zebra balığı türünün birkaç geçişini ayarlayın. İkinci gün balıklarla çiftleşin ve yumurtaları yumurtladıktan hemen sonra 10 santimetrelik plastik bir Petri kabında toplayın.Ölü ve kontamine yumurtaları plastik bir Pasteur pipeti ile çıkarın. Yumurtaları Danieau ile bir kez yıkayın %30 ile hacim başına %0.0001 ağırlık metilen mavisi. Daha sonra ortamı metilen mavisi içermeyen %30 taze Danieau ile değiştirin ve yumurtaları gece boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Üçüncü günde, ölü ve kontamine embriyoları çıkarın ve ortamı Danieau ile değiştirin %30Daha sonra embriyoları gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Dördüncü günde, tabakta yaklaşık 10 mililitre kalana kadar ortam

culture-and-transfection-of-zebrafish-primary-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Video, zebra balığı embriyolarından primer retinal ganglion hücrelerinin kültürlenmesi için bir yöntemi göstermektedir. Erken evre embriyolar, gözleri izole etmek için diseksiyona tabi tutulur ve daha sonra mekanik olarak retinal ganglion hücrelerinin bir süspansiyonuna ayrışır. Bu hücre süspansiyonu, akson gelişimini kolaylaştırmak için yapışkan proteinlerle kaplanmış lameller üzerinde kültürlenir.

Zebra Balığı Embriyolarından Primer Retinal Ganglion Hücre Kültürlerinin Üretilmesi

Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Burada, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattının sferoidlerinin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü sunuyoruz: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit).

Embriyonik ve Karaciğer Zebra Balığı Hücre Hatlarının Sferoidlerinin 3D Kültür Yöntemi

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Öğrenin zebra balığı embriyo ve yetişkin beyinlerinden primer hücre kültürü hazırlama ve transfeksiyon yöntemini. Bu teknik yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme ile hücreler arası dinamikleri incelemeyi kolaylaştırır.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Daha fazla video keşfet