Name: 利用超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡，该方法操作简便、高效且纯度更高。本技术适用于小体积样本，为肺相关细胞外囊泡研究提供可靠方案。

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本工作由美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NHLBI/NIH）资助项目 HL103868（授予 P.C.）和 HL137076（授予 P.C.）、美国心脏协会研究资助（授予 P.C.）以及塞缪尔·奥斯钦综合癌症研究所（SOCCI）肺癌研究奖（授予 P.C.）提供支持。&#160;我们衷心感谢 Cedars-Sinai 医疗中心的斯密特心脏研究所为我们提供纳米流式检测仪用于细胞外囊泡（EV）纳米颗粒的追踪分析。

所有动物使用及相关操作程序均经西达斯-西奈医学中心（CSMC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集与制备
<ol>
	<li>支气管肺泡灌洗液采集
	<ol>
		<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（300 mg/kg）和赛拉嗪（30 mg/kg）混合物实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>将22 G套管针插入气管。连接含有1 mL冰冷无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的胰岛素注射器，通过套管针向双肺灌注1 mL DPBS。</li>
		<li>缓慢回抽注射器活塞以收集支气管肺泡灌洗液（BALF），并将 BALF 滴入一个 50 mL 锥形管中。将 BALF 置于冰上保存。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2 和 1.1.3，共 3 次（每只小鼠总计 4 次）。 
		注意：每毫升灌注液通常可回收约 0.8 mL。此外，以下步骤可对单只小鼠分别进行即，3 mL的BALF），但合并多个BALF样本可获得更大量的EVs，以确保后续实验的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支气管肺泡灌洗液制备
	<ol>
		<li>将25只小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）混合，均分为两份（每份约35 mL）。</li>
		<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟，去除BALF中的细胞及其他细胞碎片，收集上清液。</li>
		<li>在4 °C、1,500 × g条件下离心上清液10分钟，以去除细胞碎片。收集上清液，进行细胞外囊泡（EV）分离步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡
注意：本研究采用两种细胞外囊泡（EV）分离技术，即超滤离心（UFC）和使用浮力密度的超速离心法，用于从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离EV。每种方法的详细实验步骤如下所述。
<ol>
	<li>超滤离心（UFC）富集方法 
	注意：本方法改编自先前描述的方案10。
	<ol>
		<li>将步骤1.2.3中的上清液通过0.2 μm无菌注射器滤膜过滤，并将滤过的BALF置于冰上保存。 
		注意：此为尺寸排阻步骤，仅收集小于200 nm的囊泡。</li>
		<li>用无菌DPBS平衡100 kDa截留分子量的离心过滤装置10分钟。在4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟，弃去DPBS。 
		警告：一旦滤器装置中的膜被DPBS平衡后，必须始终保持湿润，直至装置使用完毕。</li>
		<li>将步骤2.1.1中获得的15 mL BALF样品加入过滤装置中，在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟。穿过滤膜的BALF可弃去，或收集至另一标准离心管中，并于-80 °C保存以备后续使用。</li>
		<li>对剩余的0.2 µm滤过BALF重复步骤2.1.3。 
		注意：从初始体积35 mL的BALF中充分浓缩EVs通常需要进行三次离心，最终得到1–1.5 mL的截留液。</li>
		<li>用14 mL无菌DPBS通过反复轻柔吹打清洗截留液。在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟，去除DPBS并进一步浓缩EV截留物。</li>
		<li>将移液器插入过滤装置底部，采用左右扫动的方式吸取样品，以确保完全回收浓缩的BALF来源EVs。</li>
		<li>将BALF来源EVs分装后于-80 °C保存，用于后续颗粒定量与表征（见步骤3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差速超速离心（UC）结合浮力密度梯度离心（DGC） 
	注意：以下方案改编自先前描述的方法24。
	<ol>
		<li>将步骤2.1.1中的上清液转移至37 mL超速离心管中，在4 °C条件下使用超速离心机以10,000 × g离心30分钟。收集上清液后，在4 °C条件下以100,000 × g离心60分钟。在EV沉淀离心过程中，准备不同浓度的浮力密度梯度缓冲液（表1），用于步骤2.2.3。</li>
		<li>弃去上清液，将EV沉淀用200 μL DPBS重悬。</li>
		<li>将EV悬液与300 μL 50%碘克沙醇工作液（表1）混合，转移至15 mL超速离心管中。在50%碘克沙醇-EV混合悬液上方，按从下到上的顺序依次叠加以下缓冲液：30%碘克沙醇（4.5 mL）、25%碘克沙醇（3 mL）、15%碘克沙醇（2.5 mL）和5%碘克沙醇（6 mL）。在4 °C条件下以100,000 × g离心230分钟。 
		注意：浮力密度梯度基于碘克沙醇浓度由底部最高浓度（50%）至顶部最低浓度（5%）递减。为制备不同浓度的碘克沙醇溶液，将不同体积的匀浆介质（表1）与工作液（50%碘克沙醇）混合。</li>
		<li>收集15%和25%密度区带，并用无菌DPBS稀释至总体积15 mL。转移至新的小型超速离心管中，在4 °C条件下以100,000 × g离心60分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将EV沉淀用50 μL无菌DPBS重悬，用于后续表征。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞外囊泡定量
注意：支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡回收率通过两个指标进行定量。
<ol>
	<li>纳米颗粒追踪分析（NTA）测量
	<ol>
		<li>将EV样本用1 mL DPBS稀释1:200–1:500，加载至胰岛素注射器中。将样本注射器连接至注射泵，并开始测量颗粒数量和大小（参见材料表）。</li>
		<li>所有样本测量的相机水平设为14，检测阈值设为1。每个样本记录5次重复测量，每次30秒采集1500帧，读取间隔为20秒。合并数据并取平均值，用于最终的浓度和粒径报告。 
		注意：为准确捕获所有颗粒，应根据需要适当调整相机水平以可视化所有颗粒，并在每次实验的所有样本测量中使用相似的设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质定量 
	注意：采用二辛可宁酸（BCA）蛋白测定法测定来自BALF的EVs的蛋白浓度。
	<ol>
		<li>将EV样本溶解于1x裂解缓冲液中。</li>
		<li>按照BCA标准操作流程，使用酶标仪在560 nm处测定吸光度，通过比色法定量BALF来源EVs中的蛋白质含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡的检测
注意：使用常见的外泌体表面标志蛋白（TSG101、CD63、CD81 和 CD9）通过 SDS-PAGE 和免疫印迹以及流式细胞术分析来验证细胞外囊泡的回收情况。
<ol>
	<li>SDS-PAGE 和免疫印迹
	<ol>
		<li>在 1.6 mL 离心管中，将各样品等量的 EV 蛋白溶解于上样缓冲液（十二烷基硫酸锂）和 50 mM 二硫苏糖醇（DTT）中。于 70 °C 加热 10 分钟。</li>
		<li>将步骤 4.1.1 的样品上样至 4–12% Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶，进行电泳（150 伏，35 mA）35 分钟。</li>
		<li>采用干转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。</li>
		<li>用 5% 脱脂牛奶在室温下摇动封闭膜 60 分钟。</li>
		<li>将膜与针对 EV 表面蛋白标志物肿瘤易感基因 101（TSG101）的一抗在含 5% BSA 的 Tris-缓冲盐水 Tween-20（TBST）中按 1:500 稀释，于 4 °C 摇动孵育过夜。</li>
		<li>次日，用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，随后在室温下与 1:5,000 稀释的 HRP 标记的抗兔 IgG 二抗孵育 60 分钟。</li>
		<li>用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。使用化学发光 HRP 抗体检测试剂显影，并成像（参见材料表中的成像系统）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>将支气管肺泡灌洗液（BALF）来源的 EV 溶于 49 μL PEB 染色缓冲液（PBS + 5 mM EDTA + 0.5% BSA，经 0.1 μm 注射器滤膜过滤）中。</li>
		<li>向每个独立样品中分别加入以下抗体：1）大鼠抗小鼠 PE 标记 CD63 抗体（每反应 100 ng）；2）大鼠抗小鼠 PE 标记 CD81 抗体（500 ng）；3）大鼠抗小鼠 FITC 标记 CD9 抗体（200 ng）。于 4 °C 避光摇动孵育 60 分钟。</li>
		<li>用 450 μL 经膜过滤的 PEB 染色缓冲液稀释样品，并进行流式细胞术分析（参见材料表）25。</li>
		<li>按如下方式调整流式细胞仪设置：1）将所有通道设为超对数（hlog）模式；2）将触发阈值设为 SSC 4；3）关闭次级触发。以低速模式运行样品，每个样品至少采集 10,000 个事件。</li>
		<li>使用分析软件对每个样品进行流式细胞术数据分析（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何披露信息。

在过去的几十年中，科学家们揭示了细胞外囊泡（EVs）在细胞稳态中的重要意义。更重要的是，EVs通过其生物活性货物分子调控邻近及远端细胞，在多种疾病过程中发挥关键作用1,21,22,26,27,28,29,30。该领域的未来发展与进步在很大程度上依赖于可靠且高效的方法，这些方法不仅能够识别并分离出正确的EV亚群，还能保持其生物学功能以用于后续应用10,11,<sup cla...

外泌体是细胞外囊泡（EVs）中最小的亚群，直径为50–200 nm，在多种信号传导过程中具有多重生物学功能1,2,3,4,5。它们主要通过脂质、蛋白质和核酸等 cargo 分子介导细胞间通讯，从而调控细胞和组织的稳态6,7,8,9。EV 研究中的一个关键步骤是分离过程。差速超速离心法（UC），无论是否结合密度梯度离心（DGC），被认为是金标准方法，但该方法存在重大局限性，包括EV回收率低和可扩展性差10,11,12，这限制了其最佳应用范围，仅适用于较大体积的样本，如细胞培养上清液或高产量外泌体样本。其他方法的优缺点已有充分描述，例如基于超滤或层析的尺寸排阻法、基于微珠或层析柱的免疫亲和分离法以及微流控技术；现代辅助技术也已发展，以克服并最小化每种方法的技术局限11,12,13,14,15。已有研究显示，使用滤芯中带有纳米多孔膜的超滤离心法（UFC）是一种可替代的技术，其纯度可与UC方法相媲美16,17,18。该技术可被视为一种替代性分离方法。
支气管肺泡灌洗液（BALF）含有细胞外囊泡（EVs），在多种呼吸系统疾病中具有多种生物学功能19,20,21,22。由于支气管镜检查对人体具有侵入性，且灌洗液回收量有限，研究来源于BALF的EVs面临一定挑战。在小动物（如小鼠）中，正常肺组织条件下仅能回收数毫升灌洗液，在炎症或纤维化肺组织中回收量更少23。因此，通过差速超速离心法收集足够量的BALF用于EV分离及后续实验可能难以实现。然而，准确分离EV群体是研究其生物学功能的关键因素。在已建立的EV分离方法中，效率与有效性的平衡仍是一个持续存在的难题。
在本研究中，我们证明了采用截留分子量为100 kDa（MWCO）的纳米膜滤器单元的离心超滤方法适用于支气管肺泡灌洗液（BALF）等小体积生物样本。该技术操作简便、高效，可提供高纯度和可扩展性，有助于支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡（EVs）的研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心滤器 Ultracel-100K</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International, Prospect, IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>MKCD9753</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>VetOne, Boise, ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>20 G 血管导管</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠 TSG101 抗体</td><td>AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 PE-CD63 抗体</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 还原剂（Bolt）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 裂解缓冲液（Bolt）</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 硝酸纤维素小型转印膜堆</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>化学发光 HRP 抗体检测试剂 HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>17 mL 超速离心管</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL 超速离心管</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Corning SFCA 0.2 &amp;micro;m 孔径注射器滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight（NS300）</td><td>Malvern, Worcestershire, UK</td><td>-</td><td>用于测量颗粒大小分布和颗粒浓度</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 流式细胞仪</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转印装置</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>分析软件</td></tr></tbody></table>

使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

细胞外囊泡（EVs）是一类新近发现的亚细胞组分，在生理和病理状态下多种生物学信号传导功能中发挥重要作用。由于每种技术本身存在局限性，EVs 的分离纯化在该领域中仍是一个主要挑战。差速超速离心结合密度梯度离心法是一种常用方法，被公认为 EVs 分离的金标准操作流程。然而，该方法耗时较长、劳动强度大，且通常可扩展性较低，可能不适用于支气管肺泡灌洗液等小体积样本。我们证明，超滤离心分离法操作简便，节省时间和人力，同时可实现较高的回收率和纯度。我们建议，该分离方法可作为 EVs 分离的一种替代方案，尤其适用于小体积生物样本的 EVs 分离。

我们于同一天采用超滤离心法（UFC）和超速离心密度梯度离心法（UC-DGC）从小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离细胞外囊泡（EV）。UFC 方法耗时约 2.5–3 小时，而 UC-DGC 技术需要 8 小时的处理时间。此时间不包括缓冲液和试剂的准备时间。需要注意的是，在长时间离心过程中可同时进行其他实验操作。尽管如此，UC-DGC 分离技术的整个流程几乎持续了一整天。
通过UFC法分离的正常小鼠BALF来源EVs表现出较小的粒径和更均一的粒径分布（148.8 ± 1.1 nM， 图1A）相较于 UC-DGC EVs（176.7 ± 7.8 nM， 图1B）。与UC-DGC分离法相比，UFC技术的总颗粒数显著高出65倍（29.4 ± 18.4 与 0.5 ± 0.1 × 1010 颗粒； <e...

本文介绍了两种细胞外囊泡的分离方案：超滤离心法和密度梯度超速离心法，用于从小鼠支气管肺泡灌洗液样本中分离细胞外囊泡。通过这两种方法获得的小鼠支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡均进行了定量和表征。

细胞外囊泡（EVs）是一类新近发现的亚细胞组分，在多种生物信号传导过程中发挥重要作用。

该方法有助于解决与采用超滤离心法提取支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡的效率、回收率及纯度相关的问题。我们直接将该技术与超速离心结合密度梯度纯化技术进行了比较。该技术的主要优势在于操作简便、高效，且适用于小体积样本，例如小鼠支气管肺泡灌洗液。更重要的是，与超速离心分离法相比，该方法可提供更高的纯度和显著更强的可扩展性。演示该实验操作的是我实验室的研究助理 Norman Garrett III 先生。首先，将一根 22 号套管针插入已处死小鼠的气管中。连接一支含有1毫升冰冷无菌DPBS的胰岛素注射器，将1毫升液体注入两侧肺部。缓慢回抽注射器活塞以回收支气管肺泡灌洗液（BAL液），并将灌洗液滴入置于冰上的锥形管中。此后，收集 25 只小鼠的支气管肺泡灌洗液，并将其均分为两组。在 4°C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。收集上清液，并在 4°C 条件下以 15,000 × g 离心 10 分钟。然后收集上清液，并立即进行细胞外囊泡（EV）分离步骤。首先，使用0.2微米的无菌注射器滤器过滤上清液。随后，用无菌DPBS平衡离心过滤装置10分钟。然后在4°C条件下，以15,000 × g离心离心单元10分钟。用15毫升支气管肺泡灌洗液填充滤器，并在4°C条件下以3,000 × g离心30分钟。此后，用14毫升无菌DPBS轻轻反复吹打，洗涤截留物。在4摄氏度下以3,000 × g离心30分钟，去除DPBS并浓缩截留物。为收集浓缩的支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡（EV），将移液器插入滤器单元底部，采用左右扫动的方式吸取样品。然后将支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡进行分装，并于-80°C保存。或者，也可先将先前获得的上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以10,000 × g离心30分钟。然后收集上清液并进行离心。弃去上清液，将EV沉淀重悬于200微升DPBS中。之后，将EV悬液与300微升50%碘克沙醇工作液混合。然后将其转移至一个15毫升的超速离心管中。根据文本所述方案加入缓冲液，以形成浮力密度梯度，并在100,000 ×g 条件下离心3小时50分钟。收集15%和25%的碘克沙醇组分，并用DPBS稀释至总体积达到15毫升。将组分转移至新的超速离心管中，在4°C条件下以100,000 × g离心60分钟。弃去上清液，并将EV沉淀重新悬浮于50 µL无菌DPBS中。开始纳米颗粒追踪分析前，将EV样本用1 mL DPBS稀释。将样品加入胰岛素注射器中。然后将注射器连接至注射泵，测定颗粒数量和大小。将相机水平设为14，检测阈值设为1。接下来，使用酶标仪通过比色检测法定量EV样本中的蛋白质含量。将各样本中等量的EV蛋白质溶解于上样缓冲液和DTT中，然后在70摄氏度下加热10分钟。将样品加入 Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶中，电泳运行 35 分钟。然后采用干转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。随后，用 5% 脱脂牛奶在轻柔摇动条件下封闭膜 60 分钟。将膜在4°C下与外泌体表面蛋白标志物的一抗共同孵育，轻轻振荡过夜。室温下用HRP标记的二抗孵育膜60分钟以进行显色。用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。最后，在进行成像之前，使用化学发光HRP抗体检测试剂对膜进行显色。开始流式细胞术时，将支气管肺泡灌洗液（BAL）来源的EV加入49 µL PEB染色缓冲液中稀释。然后向每个样本中加入三种抗体，随后在4°C、避光、振荡条件下孵育60分钟。最后，用40 µL经膜过滤的PEB染色缓冲液稀释样品，并进行流式细胞术分析。在本实验方案中，采用超滤离心法（UFC）和超速离心-密度梯度离心法（UC-DGC）从小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中分离出细胞外囊泡（EV）。通过UFC方法从正常小鼠BAL液中分离得到的EV比通过UC-DGC方法获得的EV具有更小的粒径和更均一的粒径分布。与UC-DGC技术相比，UFC技术的总颗粒数也显著更高。UFC-EV的总蛋白回收量（以毫克计）也高于UC-DGC-EV，表明UFC技术在时间和精力上更具效率。最后，还通过流式细胞术对来自BAL液的EV进行了进一步表征。UFC-EV 和 UC-DGC-EV 均表达 CD63、CD9 和 CD81。在进行此操作时，需注意用 DPBS 重新水化超滤装置的膜。一旦膜完成水化，该装置必须始终保持湿润，直至使用为止。从滤过装置中回收细胞外囊泡截留物可能具有挑战性。务必左右扫动移液器吸头，以从滤过装置中回收大部分细胞外囊泡。该技术建立后，为小动物正常或病理状态下支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡生物学功能研究，提供了细胞外囊泡分离领域研究人员的重要途径。

isolation-extracellular-vesicles-from-murine-bronchoalveolar-lavage

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：DeMarino, C.，等．远离病毒的高产量细胞外囊泡制备物的纯化．J. Vis. Exp.

在病毒颗粒共存条件下细胞外囊泡的分离与富集

本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。...

从肝脏中分离组织细胞外囊泡

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。...

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。...

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

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快速分离人乳源性细胞外囊泡

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡，该方法操作简便、高效且纯度更高。本技术适用于小体积样本，为肺相关细胞外囊泡研究提供可靠方案。

使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

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