Name: Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a utilizar biosensores microbianos anaerobios para evaluar la biodisponibilidad de mercurio y cadmio en entornos anóxicos. Este protocolo proporciona datos en tiempo real esenciales para comprender el ciclo biogeoquímico de estos metales tóxicos.

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Nos gustaría agradecer comentarios de dos revisores anónimos como bien miembros del laboratorio de Poulain para la discusión profunda sobre el desarrollo del biosensor anaerobio. Un premio de investigador temprano de la provincia de Ontario y una subvención de descubrimiento y un suplemento de acelerador de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá a AJP financian este estudio.

Los autores no tienen nada que revelar.

Biosensores microbianos son herramientas útiles para identificar los mecanismos por los cuales los metales están interactuando con los microbios. Aquí, describimos un método que puede cuantificar anaeróbicamente HgII y CdII biodisponibilidad a una célula huésped bacterias Gram negativas (e. coli) y dan un resultado cuantificable dentro de unas horas. Una de las fortalezas principales de este protocolo es que permite control extenso de la especiación de metales en el medio de exposición evitando ligandos vinculante fuerte o componentes que pueden llevar a la precipitación del metal. Especiación de metales ha sido modelada y probado en este medio de exposición usando PHREEQC17, sin embargo puede implementarse otros software de especiación de metales. En caso de no añadidos ligandos, Hg especiación se espera que esté presente como 97% Hg(OH)2 y 3% Hg (NH3)22 +, mientras que la especiación de Cd será presentar como 59% glicerofosfato-β-Cd, 25% Cd2 +y 16% CdSO4. Utilizando un software de modelado termodinámico simple, el usuario puede diseñar medios de exposición y prueba de la biodisponibilidad del metal de interés. Además, la célula del huésped del biosensor (e. coli NEB5α) es viable en un amplio rango de pH (5-8, 5) y la concentración de NaCl (0-0.55 M)17.
Metilación del HG es un proceso anaerobio, y el protocolo descrito en este estudio no tiene un requisito para el oxígeno, permitiendo la descripción más exacta del metabolismo anaeróbico en la biodisponibilidad del metal. Esto es importante porque la presencia de oxígeno altera la expresión de gene perfiles48,49 y por lo tanto, potencial de transporte de vías; por lo tanto, este método presenta la ventaja sobre el actual actualmente alternativas aeróbicas. La construcción de biosensores presentada potencialmente puede utilizarse con otros hosts anaerobias que pueden ser más relevantes para la metilación de mercurio (por ejemplo, Geobacter, Desulfovibrio), pero quizás menos manejable que el e. coli. Una limitación actual del enfoque presentado aquí es que nuestro límite de detección todavía no ha alcanzado los niveles de pM, contrariamente a los sistemas aeróbicos4,19,37. Es importante tener en cuenta que para lograr estos bajos límites de detección varios pasos deben tomarse44: i) ligando es necesaria para asegurar que Hg permanece en solución y no por adsorción sobre la pared celular microbiana (Hg será enlazado irreversible a la célula tioles superficie impidiendo su biodisponibilidad25,27; véase la respuesta umbral de Hg en la Figura 3A), ii) modificaciones en la densidad celular, o iii) modificar la estructura genética para incluir proteínas de transporte de la mer-operon (es decir, merT y merP), el creciente flujo de Hg dentro de la célula50,51. Estas modificaciones sería beneficioso en la detección de bajas concentraciones de Hg, pero no necesariamente ideal al evaluar situaciones ambientales relevantes. Mientras que anteriores biosensores de cadmio existen primordialmente como una "prueba de principio", fueron diseñados en medios complejos que no permiten al investigador evaluar el papel de la especiación en biodisponibilidad41,42, 43 , 44.
El biosensor es una herramienta muy útil en la determinación de los mecanismos en que las especies metálicas son biodisponible. Porque el organismo del anfitrión no es un Hg-methylator, sólo se puede utilizar para desarrollar un modelo para cómo Hg puede entrar bacterias Gram-negativas y no un fundamento definitivo para cómo Hg-methylators adquieran Hg. Existen otros métodos para determinar la biodisponibilidad de Hg, como la metilación, como resultado de la absorción o el uso de un enfoque de balance de masa de15,10,20,45,46. Dicho esto, el método presentado aquí ofrece la ventaja de casi en tiempo real datos de biodisponibilidad en las células viables. No se recomienda utilizar este método para cuantificar niveles de Hg o Cd total en una matriz ambiental. A pesar del propuesta uso de biosensores para determinar concentraciones de metales en el medio ambiente36, muchos más métodos estándar están disponibles como ICP-MS, FAAS (para el análisis de Cd) o espectroscopia de absorción atómica de vapor frío (para Hg Análisis). El biosensor sin embargo puede ser utilizado para determinar si una determinada matriz ambiental tiene el potencial para mejorar o dificultar la biodisponibilidad; Esto se logra mediante la realización de adiciones estándar.
El pH de los medios de exposición puede ser alterado a dondequiera dentro de la gama de 5 y 8,5, siempre el MOPS ácido libre (buffer) se intercambia con un ácido libre alternativo de un tampón con el pKa apropiado (vea por favor lista de buffers adecuados (Ferreira et al. (2015) 47) y ajustado con KOH para el pH apropiado al hacer la media de exposición. Además, el método no se limita a Hg y Cd, pero podría extenderse a otros metales con otros reguladores de la transcripción.
El ensayo de exposición puede modificarse para explorar la influencia de otros aceptadores del electrón O2 como fumarato en biodisponibilidad Hg o Cd. Pequeñas modificaciones al método de utilizar el O2 y fumarato como aceptadores del electrón están disponibles bajo petición.
En Resumen, nos gustaría destacar los siguientes puntos: I) es esencial que las concentraciones de Cd o Hg existencias son conocidas en el paso 2, ya que éstos se utilizarán para calibrar el biosensor. II) en el día de la exposición, debe interrumpirse el crecimiento de células en un OD600 de 0,6 (± 0.1) y que cuidado resuspender los cultivos celulares, como el biosensor está calibrado para esta densidad celular. III) por último, es importante que el medio de la exposición se hace meticulosamente en el día de la exposición. Para garantizar el éxito del Protocolo, deben cultivarse culturas múltiples al mismo tiempo (para evitar la posibilidad de retraso en el crecimiento) y el medio de crecimiento debe rehacer semanal (para eludir la metaestabilidad de los medios y la posible contaminación). Debe señalarse también que réplicas biológicas (cultivos de células múltiples) expresarán variabilidad cuando se trata de producción de la señal. Aunque las respuestas fluorescentes pueden variar de cultura a cultura, las tendencias fluorescentes en respuesta a una variable dada deben seguir siendo el mismo a lo largo de numerosas réplicas biológicas.

Mercurio (Hg) es un contaminante global y su biodisponibilidad a Hg metilación microbios es el primer paso hacia su biomagnificación a través de redes tróficas y sus posibles efectos neurotóxicos en humanos y fauna1. Se piensa actualmente que metilación del Hg microbiana es un proceso intracelular que requiere: i) las especies de Hg al ser biodisponible2,3,4,5,6,7 y ii) para la célula de ser fisiológicamente capaz de metilación de Hg8,9,10. Cadmio (Cd) se bioacumula en los organismos, pero no no biomagnifica en foodwebs y es ampliamente utilizado en procesos industriales y comerciales que comúnmente causan exposición aguda en las personas y el medio ambiente11. Aunque microbios desempeñan varias funciones clave en el destino de Hg en el ambiente, la mayoría de los estudios en Cd geoquímica y Ecotoxicología centrarse en eukaryotes microbianos12. El consumo de cultivos agrícolas (por ejemplo, arroz) es la principal fuente de exposición directa al cadmio; en este caso, la biodisponibilidad de Cd a los microbios de la rizosfera influye directamente en la cantidad las plantas pueden acumular13.
Vías de transporte de Hg son complejas y posiblemente implican un transporte activo paso14. Cuando participa un transportador, el trabajo reciente sugiere que HgII utiliza un ZnII o MnII transportador7,15,16,17. Mientras que el CdII se presume para ser transportado accidentalmente en el citosol a través de vías de transporte de metales divalentes (especialmente manganesoII o ZnII), de mecanismos de CdII transportan interior las células permanecen vía de transporte especulativo y no específicos del Cd ha sido identificado13,18. Independientemente de la naturaleza de los transportadores implicados tres factores mecanicistas en última instancia determinan la capacidad de los metales para entrar en una célula: i) la especiación de metales en solución2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) las propiedades biophysiochemical de la membrana de la célula17,24,25,26,27,28,29 ,30,31y iii) la capacidad del metal acceder a un sitio de transporte7,32. CD y Hg están poco probable que existe como iones libres en condiciones fisiológicamente relevantes microbianas debido a su alta afinidad para disuelto orgánico materia (DOM), quelantes de contaminantes (por ejemplo, EDTA) o reducido sulfuro moieties33, 34,35 (CdII puede existir como una forma o ion ion-pares libres en ausencia de estos ligandos). Hay una falta de métodos eficaces para determinar cómo estas especies metálicas son biodisponibles en condiciones relevantes a su suerte en el medio ambiente. Por ejemplo, Hg es desnaturalizado bajo condiciones anaeróbicas14y cadmio y Hg son metales blandos (o clase B cationes), que requieren que la especiación sea investigado bajo condiciones que mantienen la integridad de grupos reducidas del sulfuro.
Biosensores microbianos son células bacterianas que emiten una señal cuantificable en respuesta a las concentraciones intracelulares de un metal, en este caso Hg o Cd. Como tal, son herramientas ideales para entender cómo los metales entrar en una célula36, siempre que las condiciones de exposición son cuidadosamente controladas para. Biosensores de Hg típicamente contienen fusiones de genes entre los circuitos de regulación de la mer-operon (incluyendo los genes que codifican para el regulador de la transcripción MerRas así como el operador y el promotor regiones del operon) y genes de reporting (por ejemplo, Lux, gfp, lac genes). Cuando Mercurio está presente en el citoplasma, se unirá a MerR, dando por resultado la transcripción de los genes informes y señal subsecuente producción19,37. Biosensores específicos de Cd están diseñados generalmente usando la cadC, cadAC, zntA o zntR codificado de los reguladores de transcripción38, pero cabe destacar que MerR tiene una afinidad más baja, pero cuantificable a Cd5. Debido a la restricción aerobia de la mayoría utiliza proteínas fluorescentes o luminiscentes reportero, hasta biosensores microbianos recientemente seguía siendo incapaces de ofrecer penetraciones en la biotransformación de los metales bajo condiciones anóxicas. Esto hace anaerobio detección de biodisponibilidad de metales muy difícil en un rango de condiciones relevantes a su destino ambiental, específicamente en la presencia de redox sensibles ligandos (por ejemplo, sulfuros y tioles)4, 5 , 39.
Para aliviar el obstáculo metodológico de viva imagen en ausencia de oxígeno, Drepper et al. (2007) han desarrollado una proteína fluorescente base de flavin (FbFp), basado en el dominio de tensión de oxígeno luz de SB2 proteína de p. putida. Esta familia de proteínas que es capaces de emitir fluorescencia en ausencia de oxígeno40. Basándose en el trabajo de Drepper et al., nuestro laboratorio ha diseñado un biosensor anaeróbico que permite el estudio de biodisponibilidad de Hg en condiciones anóxicas y óxicas y en un amplio rango de salinidad 17. En el documento actual, se describe cómo preparar y utilizar el biosensor para probar la influencia de las variables ambientales en la biodisponibilidad de Hg o Cd. Aunque hemos desarrollado el biosensor para HgII, optamos por realizar experimentos con CdII como medio para llamar la atención del lector al hecho de que los biosensores también pueden responder a múltiples factores estresantes que ocurren en el medio ambiente matrices; en este caso CdII fue investigado porque se sabe para enlazar con el regulador transcripcional MerR5. Aquí, mostramos calibración representativa y funcionales rangos lineales con respecto a cualquiera de los dos metales. También damos un ejemplo cuando resultados de biosensor son concluyentes (MgII y MnII sobre biodisponibilidad de Hg) y concluyente (ZnII sobre biodisponibilidad de Hg).

<table><tbody><tr><td>Frasco estándar de 7 ml, interior redondeado</td><td>Delta Scientific</td><td>200-007-20</td><td>34 recomendados</td></tr><tr><td>Bandeja de viales, aberturas de 21 mm</td><td>Delta Scientific</td><td>730-2001</td><td>4 para (rejilla de 4 x 8)</td></tr><tr><td>24 mm Cierre</td><td>Delta Scientific</td><td>600-024-01</td><td>32 recomendados</td></tr><tr><td>MUESCA DE ESQUINA DE TAPA BLK STR CS/50</td><td>Corning</td><td>Corning 3931</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de superficie no vinculante de fondo claro</td><td>Corning</td><td>Corning 3651</td><td></td></tr><tr><td>(guantera)</td><td></td><td></td><td>El aire en la cámara anaeróbica debe ser (97 % N2 &plusmn; 2 % y 3 % H2 &plusmn; 2 %)</td></tr><tr><td>Catalizador de paladio</td><td></td><td></td><td>Convierte O2 a H2O en la cámara anaeróbica. No es obligatorio, pero se recomienda.</td></tr><tr><td>Lector</td><td></td><td></td><td></td>de microplacas</tr><tr><td>450 (&plusmn; 10) Filtro nM para el lector</td><td></td><td></td><td></td>de microplacas</tr><tr><td>500 (&plusmn; 10) Filtro nM para el lector</td><td></td><td></td><td></td>de microplacas</tr><tr><td>Vial de cultivo anaeróbico (tubos de balch) + tapones de</td><td></td><td></td><td></td>goma</tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td>Modificado para tubos de cultivo anaeróbico</td></tr><tr><td>MA-3000 (analizador de mercurio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td> de pH <td>Cualquier sonda de pH funcionará</td></tr> con <tr><td>tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 mL.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 y micro; m Filtro de jeringa de polietersulfona + jeringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidrio estériles/limpios</td><td>Para medios de</td><td></td><td></td> crecimiento y estándares</tr><tr><td>Botellas de plástico o PTFE estériles/limpias</td><td></td><td></td><td>Para soluciones alcalinas (NaOH/KOH)</td></tr><tr><td>Reactivos en polvo: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicilina sal sódica, Difco M9 Sales mínimas, glucosa, MgSO4, tiamina HCl, NaNO3, l-leucina, l-isoleucina valina, sal de sodio EDTA, FeSO4, beta-glicerofosfato de sodio, ácido libre de trapeadores, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril Milli-Q</td><td></td><td></td><td>esterilizada en autoclave o con filtro está bien.</td></tr><tr>Caldo <td></td><td></td><td></td>de <td>lisogenia</td></tr><tr><td>Grado analítico H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Biodisponibilidad de mercurio (Hg) de microbios es un paso clave para tóxicos Hg biomagnificación en redes tróficas. Cadmio (Cd) transformaciones y biodisponibilidad para las bacterias controlan la cantidad que se acumulará en cultivos de alimentos básicos. La biodisponibilidad de estos metales depende de su especiación en solución, pero más particularmente bajo condiciones anóxicas donde Hg es metilado para monomethylmercury tóxicos (MeHg) y Cd persiste en la rizosfera. Biosensores microbianos celulares dan una señal cuantificable cuando un metal entra en el citosol y por lo tanto es herramientas útiles para evaluar la biodisponibilidad del metal. Por desgracia, mayoría de biodetección los esfuerzos hasta ahora ha sido obliga a oxic ambientes debido a la limitada capacidad de las proteínas existentes de reportero para funcionar en ausencia de oxígeno. En este estudio, presentamos nuestro esfuerzo para desarrollar y optimizar un ensayo de biosensores de célula entera capaz de funcionar anaeróbicamente que puede detectar metales bajo condiciones anóxicas en tiempo cuasi-real y dentro de las horas. Describimos cómo el biosensor puede ayudar a evaluar cómo químicas variables relevantes para el ciclo ambiental de metales afectan su biodisponibilidad. El siguiente protocolo incluye métodos para (1) preparar Hg y Cd estándares bajo condiciones anóxicas, (2) preparan el biosensor en ausencia de oxígeno, (3) diseño y ejecutan un experimento para determinar cómo afecta a una serie de variable biodisponibilidad Hg o Cd y (4) para cuantificar e interpretar datos de biosensor. Mostramos las gamas lineares de los biosensores y proporcionar ejemplos que muestran la capacidad del método para distinguir entre toxicidad y biodisponibilidad de metales utilizando cepas metal-inducible y constitutivas.

Una vez que se han cuantificado los picos de fluorescencia según paso 5.3, se puede graficar el resultado de los picos de fluorescencia según la concentración variable que ilustra cómo esta variable afecta la biodisponibilidad relativa de Hg o Cd. Por ejemplo, la curva de calibración de fluorescencia sobre [HgII] Figura 2 dará los inducibles datos presentados en la Figura 3A. Para HgII calibración, la curva de voluntad siempre contienen 3 componentes para la cepa Hg-inducible; una respuesta umbral de aproximadamente 1-2 nM HgII antes de la producción de señal de fluorescencia es linealmente proporcional a [HgII], la gama lineal donde 5 nM HgII será fiable siempre en el centro de ese rango y una meseta donde aumento [HgII] ya no aumentará la señal de fluorescencia. Ningún cambio en la producción de la señal de la tensión constitutiva muestra que toxicidad de [HgII] no afecta la producción de la señal. Para CdII en la figura 3B, siempre hay 2 componentes para la cepa inducible; una variedad lineal donde 200-300 nM CdII será fiable siempre en el centro de la gama lineal y una meseta. Una disminución en la señal de fluorescencia con el aumento de [CdII] demuestra que altas concentraciones de Cd son tóxicas para las células y pueden explicar una disminución en la producción de fluorescencia inducible después de la meseta a 1000 nM CdII. Por lo tanto, al probar la biodisponibilidad de Hg o Cd con respecto a una variable de entorno, le sugerimos que use 5 nM para el HgII y 300 nM para CdII.
En algunos casos, producción de la señal puede atribuirse correctamente a biodisponibilidad Hg o Cd, pero en otros casos, producción de la señal puede verse afectado por la variación en el estado fisiológico del hospedador biosensores celulares (por ejemplo, el metal de interés o condiciones ambientales probadas son tóxicas). En la Figura 4A, 5 biodisponibilidad de Hg nM fue probado sobre un gradiente de Zn (0-10 μm). En Hg-inducible y constitutivas cepas, hay una disminución similar en la señal con el aumento de las concentraciones de Zn. Por lo tanto, uno no puede discriminar si la señal resulta de baja biodisponibilidad o es el resultado de la toxicidad del Zn. En la Figura 4B y 4C, 5nM biodisponibilidad de Hg fue probado sobre un gradiente de MgII (0-10 mM) y MnII (0-10 μm). Aumento de MgII y MnII concentraciones disminuyeron la señal de fluorescencia de la cepa inducible. Por otro lado, la tensión constitutiva no mostraron una disminución de la fluorescencia con el aumento de Mg las concentracionesII II y Mn (MgII y MnII son beneficiosos para las células en la producción de la FbFp, como lo demuestra un aumento en la señal de fluorescencia). Esto demuestra que las células son viables y la disminución de la fluorescencia de la cepa Hg-inducible resulta de una disminución en la biodisponibilidad de Hg. Estos datos subraya lo importante que es para que todos los ensayos de biosensor para también proporcionar mediciones constitutivas de la condición física general del celular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figura 3: rangos lineales del biosensor con mercurio y cadmio. Fluorescencia máxima medida de fluorescencia relativa unidades (RFU) ± 1 desviación estándar emitido por e. coli NEB5α que la pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) y pUC19Balch-Pp (Constitutive) con la adición de A) hectogramoII (0-15 nM) y B) CdII (0-1.000 nM) bajo condiciones anaeróbicas. La fluorescencia fue que la media de 3 técnicas replica a 37 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figura 4: ejemplo de un resultado concluyente con Zinc y un resultado concluyente con magnesio y manganeso. Fluorescencia máxima medida de fluorescencia relativa unidades (RFU) ± 1 desviación estándar emitido por e. coli NEB5α que la pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) y pUC19Balch-Pp (Constitutive) con la adición de A) ZnII (0-10 μm), B) MgII (0-10 mM), y C) MnII (0-10 μm) en condiciones anaeróbicas. [HgII] fue fijado a 5 nM para todos los tratamientos y de la fluorescencia fue el promedio de 3 repeticiones técnicas a 37 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar un biosensor microbiano anaerobio de células completas para evaluar diferentes variables ambientales afectan la biodisponibilidad de Hg y Cd a las bacterias en ambientes anóxicos.

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el ciclo biogeoquímico del cadmio y el mercurio, como cómo las diferentes variables ambientales afectan su biodisponibilidad a las bacterias. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece datos de biodisponibilidad casi en tiempo real y células viables independientemente de la presencia de oxígeno. Generalmente los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque hay muchos pasos sensibles al tiempo que requieren una atención muy meticulosa al detalle.Demostrando el procedimiento estará Ben, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para prepararse para el ensayo, recupere el biosensor inducible de mercurio y el biosensor expresado constitutivamente de un crio de menos 80 grados Celsius. Ina las células en placas de caldo de Lysogeny que contengan 120 microgramos por mililitro de ampicilina.Cultivar los cultivos de placas en una incubadora a 37 grados Centígrados durante la noche. Entre las 4:30 y las 5 p.m. inocular un cultivo en diez mililitros de LB con ampicilina y crecer durante la noche a 37 grados centígrados con temblores a 220 rpm.Entre las nueve y diez .m a la mañana siguiente trae la cultura, así como el medio de crecimiento previamente preparado a la cámara anaeróbica. A continuación, añadir ocho mililitros de medio de crecimiento fresco y 210 microgramos por mililitro de ampicilina en un tubo de balch estéril.Ahora recoger dos mililitros de la cultura cultivada durante la noche y transferir en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Después de centrifugar a 10.000 RCF durante 90 segundos, retire el sobrenadante y resuspend en dos mililitros de medio de crecimiento fresco. A continuación, agregue el cultivo resuspendido al tubo de la bala que contiene ocho mililitros de medio de crecimiento fresco y ampicilina.Con una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala antes de retirarlo de la cámara anaeróbica. A continuación, coloque el tubo en una incubadora y crezca anaeróbicamente a 37 grados centígrados con temblores a 220 rpm. Entre las tres y las cinco de la .m.llevar el tubo de la bala con el cultivo, un nuevo tubo de balch estéril, y el medio de crecimiento en la cámara anaeróbica. Añadir 100 microlitros del cultivo a 10 mililitros de medio de crecimiento fresco con ampicilina en el tubo de alfarradora estéril. Usando una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala.Retire el tubo de la cámara anaeróbica antes de cultivarlo durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 220 rpm. Entre las nueve y diez a.m. al día siguiente, transferir la cultura y el medio de crecimiento de nuevo a la cámara anaeróbica.Añadir de nuevo ocho mililitros de medio de crecimiento y ampicilina en un tubo de bala estéril. Transfiera dos mililitros del cultivo cultivado durante la noche a un tubo de micro centrífuga de dos mililitros. Después de la centrifugación como antes, retire el sobrenadante y resusppend las células en dos mililitros de medio de crecimiento fresco.A continuación, agregue el cultivo resuspendido al tubo de la bala que contiene el medio de crecimiento fresco y la ampicilina. Usando una técnica estéril, coloque cuidadosamente un tapón de goma en el tubo de la bala. Retirarlo de la cámara y crecer anaeróbicamente a 37 grados Celsius con agitación a 220 rpm.Monitorear el crecimiento del cultivo utilizando un espectrofotómetro mediante el vórtice del cultivo y luego medir la densidad óptica en 600 nanómetros o OD600. Después de tres a cuatro horas de crecimiento esperado, la cultura debe alcanzar un OD600 de 6. Ahora traiga el tubo en la cámara anaeróbica y transfiera el cultivo en dos tubos de micro centrífuga de dos mililitros.Después de la centrifugación como antes, retire el sobrenadante y resusppend cada paladar celular en dos mililitros de medio de exposición fresco. Repita este paso de lavado una vez para eliminar cualquier rastro del medio de crecimiento. Ahora combine ambos tubos de micro centrífuga de cultivo celular en un vial estándar de PTFE de siete mililitros para obtener el stock de biosensores para su uso en el ensayo de exposición.Antes de comenzar el experimento, compruebe el monitor anaeróbico para asegurarse de que no hay oxígeno en la cámara anaeróbica. Diseñe el diseño de la placa de acuerdo con una plantilla de 96 pozos. Para ejecutar experimentos en réplicas técnicas de tres esto permitirá 32 tratamientos diferentes, que se representa mejor con una cuadrícula de cuatro por ocho para configurar los viales.Configure la cuadrícula de cuatro por ocho de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo. A continuación, coloque los viales estándar de PTFE de siete mililitros en la bandeja. Los viales solo deben manipularse manipulando el exterior del vial.Añadir el volumen medio de exposición en cada vial correspondiente a cada tratamiento. A cada vial añadir el volumen correspondiente de la variable química a probar de acuerdo con el diseño de la placa. Ahora agregue nitrato a cada vial para que la concentración sea de 200 micromolares.Excluya este paso para los espacios en blanco de tratamiento de biosensores constitutivos. Para añadir mercurio a los viales, primero tome el material de cuatro a ocho micromolares y agite bien. Diluir la solución y el medio de exposición en un vial de PTFE de siete mililitros a una concentración de 100 a 250 nanomolares para hacer una solución de mercurio en funcionamiento.A partir de esta solución de trabajo, agregue mercurio a los viales necesarios de acuerdo con la disposición de la placa. Después de añadir el mercurio o el cadmio, agite manualmente la placa en un movimiento orbital. El experimento puede estar en pausa ahora dependiendo del tiempo necesario para que el mercurio o el cadmio se especifiquen en solución.Cuando se reanude el experimento, pipetee suavemente el stock de biosensores de ida y vuelta para garantizar la homogeneidad. A continuación, añada 100 microlitros del stock de biosensores a cada vial y agite manualmente la placa como antes. Calienta el lector de placas a 37 grados centígrados y configura una carrera cinética durante diez horas con lecturas cada dos puntos cinco a cinco minutos.Un temblor orbital entre lecturas. Configure la carrera para tomar mediciones de fluorescencia con una excitación de fluorescencia de 440 nanómetros y una emisión de 500 nanómetros. Ahora pipeta 200 microlitros de cada vial de PTFE en la rejilla de cuatro por ocho en los pozos correspondientes de la placa de 96 pozos.Pipetear de ida y vuelta cinco veces antes de transferir cada 200 microlitros. En lugar de desechar la punta de la pipeta, deje la punta de la pipeta en el vial de PTFE para realizar un seguimiento del progreso del pipeteo. Coloque la placa de 96 pozos en la bandeja del lector de placas.A continuación, coloque la tapa en la placa de 96 pozos y comience el ensayo. Aquí hay resultados representativos que muestran los datos de fluorescencia corregidos en función del tiempo. La fluorescencia se muestra con concentraciones crecientes de mercurio al biosensor inducible.Todos los valores están en blanco para el control sin mercurio. Los picos fluorescentes se pueden cuantificar para mostrar la señal fluorescente en función de la concentración de mercurio o cadmio. Tanto para los biosensores inducibles como para los constitutivos, la concentración de mercurio o cadmio en el centro del rango lineal de los sensores inducibles debe utilizarse para probar variables.Estos son ejemplos de un resultado no concluyente con zinc. Y un resultado concluyente con magnesio y manganeso sobre la biodisponibilidad de mercurio para el biosensor. El resultado con zinc no es concluyente porque la fluorescencia constitutiva se descompone con fluorescencia inducible que indica toxicidad.Al intentar este procedimiento es importante recordar entrar en las concentraciones de cadmio o mercurio, ya que estos se utilizarán para calibrar el biosensor. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el modelado termodinámico de sistemas acuosos para responder a preguntas adicionales como cómo afectan a su biodisponibilidad especies químicas específicas de mercurio o cadmio. No olvide que trabajar con cadmio y mercurio y ácidos fuertes como el ácido sulfúrico puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección personal durante la realización de este procedimiento.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología ambiental exploraran mercurio anaeróbico casi en tiempo real o biodisponibilidad de cadmio y microbios genéticamente tratables.

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Investigación

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Detección de un analito objetivo mediante un biosensor bacteriano

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Ensayo de biosensor bacteriano para detectar mercurio biodisponible en condiciones anaeróbicas

La integración del cultivo de microalgas con los gases de combustión industriales introducirá en última instancia metales pesados y otros compuestos inorgánicos en los medios de crecimiento. Este estudio presenta un procedimiento utilizado para determinar el destino final y el impacto de los metales pesados y contaminantes inorgánicos en el crecimiento de Nannochloropsis salina cultivada en fotobiorreactores.

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Debido a la importancia y el uso extenso de paladio, oro y cobalto   metales en equipos de alta tecnología, su recuperación y el reciclaje constituyen un importante reto industrial. El sistema de recuperación de metal descrita en este documento es un medio de bajo costo simple, para la eficaz detección, remoción y recuperación de estos metales de la mina urbana.

Detección y recuperación de paladio, oro y cobalto Metales de la Mina Urbana utilizando sensores Novela / adsorbentes designados con nanoescala Los poros en forma de rueda-Wagon

Se presenta la caracterización de complejos formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptidos dicysteinil mediante espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray.

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

Se describe el uso de moléculas de polidesoxinucleótidos (aptámero de 44 meros) para detectar iones de gadolinio (III) no quelados en una solución acuosa. La presencia del ion se detecta a través de un aumento en la emisión de fluorescencia del sensor.

Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Este trabajo ha discutido el protocolo para diseñar y desarrollar un dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As y F en muestras ambientales, muestras biológicas y alimentos y bebidas. Se han analizado casi 2000 muestras y los resultados concuerdan con la técnica estándar de oro.

Técnica avanzada de detección E-Eye guiada por TD-DFT para la cuantificación in situ de Fe, Cr, F y As en muestras ambientales, biológicas y alimentarias

En este trabajo se describe el diseño, construcción y funcionamiento de una instalación de 1.000 m 2 que contiene 24 parcelas de 33,6 m 2 de campo individuales equipados para medir el volumen total de escorrentía con el tiempo y la recopilación de submuestras de escorrentía en los intervalos seleccionados para la cuantificación de componentes químicos en el agua de escorrentía de céspedes caseros simulados.

Diseño y Construcción de un Centro de Investigación La escorrentía urbana

Aprende a utilizar biosensores microbianos anaerobios para evaluar la biodisponibilidad de mercurio y cadmio en entornos anóxicos. Este protocolo proporciona datos en tiempo real esenciales para comprender el ciclo biogeoquímico de estos metales tóxicos.

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

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