Name: Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Keşfedin, yenidoğan farelerde iki fotonlu görüntüleme ile kortikal nöronların dinamik morfolojik değişikliklerini canlı olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, nöron gelişimi ve hastalık modellerindeki süreçleri detaylı incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar T. Sato, M. Kanbayashi ve S. Kouyama kendi teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser ve JSP'ler KAKENHI Grant numaraları JP15K14322 ve JP16H06143, Takeda Bilim Vakfı, Uehara Anıtı Vakfı ve işbirlikçi araştırma projesi, Niigata Üniversitesi beyin Araştırma Enstitüsü 2017-2923 (H.M.) tarafından desteklenmiştir KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 ve JP15H04263 ve Grant-in yenilik alanları "Dinamik düzenleme beyin fonksiyonu tarafından hurda & yapı sistemi," bilimsel araştırma (JP16H06459) üzerinden MEXT (TI).

Deneyler deneyci'nın kurum tarafından reçete hayvan refahı yönergelere uygun olarak yapılmalıdır.
1. hazırlanması Pups görüntüleme için
Not: Pups seyrek etiketli kortikal nöronlar ile süpernova vektörel çizimler5,6/ rahim içinde Elektroporasyon (orijinal) tarafından elde edilebilir. Süpernova sistemi aşağıdaki iki vektörlerinin oluşur: TRE-Cre ve CAG-loxP-STOP-loxP-Gen X-IRES-tTA-WPRE. Bu sistemde, seyrek etiketleme TRE sızıntı üzerinde dayanır. Transfected nöronlar seyrek bir nüfus TRE Cre ve tTA zayıf ifade ediyor. Daha sonra yalnızca bu hücreler, tTA-TRE döngüleri bir olumlu geribildirim tarafından ifade Gen X kolaylaştırılmıştır. Elde etiketleme seyrek ve parlak bireysel nöronlar içinde vivomorfolojik ayrıntılarını görselleştirme sağlar. EKOSEM yordamı ayrıntılarını değil içinde açıklanmıştır onlar beri bu iletişim kuralı, başka bir7,8,9,10,11bölümünde.
<ol><li>Zaman aşımına uğradı-hamile fareler EKOSEM için hazırlayın.</li>
	<li>Bir DNA çözüm EKOSEM için hazırlayın. Seyrek RFP ile etiketleme için pK031:TRE içeren bir çözüm kullanın-Cre (5 ng/µL) ve pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) veya pK031:TRE içeren bir çözüm-Cre (5 ng/µL) ve pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL). Not: Çeşitli proteinlerin vektörel çizimler farklı kombinasyonları kullanarak etiketli nöronlarda ifade edilebilir. Ayrıca, çeşitli genler olabilir çaldı aşağı veya özel olarak etiketli hücreleri5,6 ' çaldı-out (Örneğin, vektörel çizimler süpernova sistemi için bir dizi mevcuttur RIKEN BioResource araştırma merkezi ve Addgene).</li>
	<li>Kortikal nöronlar etiketlemek için düzenli EKOSEM7,8,9,10,11 gerçekleştirin. Tabakası etiketleme için 4 nöronlar, embriyonik gün-14 embriyo kullanın.</li>
	<li>Yavru teslimi ve büyüme için bekleyin.</li>
</ol>2. cerrahi
<ol><li>Doğum sonrası gün-5 (P5) yavru İsoflurane gaz (% 1.0) kullanarak anestezi. Anestezi düzeyini denetlemek için bir kuyruk-çimdik testi gerçekleştirin. Yavru fok için çimdik yanıt verirse, isoflurane konsantrasyonu artırmak (%2.0) veya Yanıt kaybolana kadar bekleyin. Isıtma yastığını kullanarak ameliyat sırasında pups vücut ısısını korumak.</li>
	<li>Subkutan bir analjezik (carprofen, 5 mg/kg) enjekte et.</li>
	<li>Üç kez % 70 etanol ile silerek kafatası kapsayan pups cilt sterilize.</li>
	<li>Yaklaşık 20 mm2 / %70 etanol (Şekil 1A) ile sterilize makas kullanarak kafatası kapsayan cilt kaldırın.</li>
	<li>Steril forseps ve temiz, steril pamuklu çubukla (Şekil 1A) kullanarak kafatası fasya kaldırın.</li>
	<li>Kanamayı durdurmak için yükleme ipuçları kazıma Cilt yüzeyine kullanarak doku yapıştırıcı uygulamak. Bu kafatası açılış daha zor hale getirir çünkü doku yapıştırıcı görüntüleme alanını (Şekil 1B) geçerli değildir.</li>
	<li>Yavru bir ısıtma yastığı (37 ° C) yerleştirin ve anesteziden kurtarmak sağlar. Doku yapıştırıcı kurutulmuş ve (yaklaşık 30 dakika) katılaşmış kadar bekleyin.</li>
	<li>Gerekirse, daha fazla doku yapıştırıcı uygulamak ve kuru ve kuvvetlendirmek bekleyin.</li>
</ol>3. kraniyal pencere hazırlık
<ol><li>İsoflurane (% 1.0-%2.0) kullanarak yavru anestezi ve anestezi seviyesini bir kuyruk-çimdik testi ile kontrol edin.</li>
	<li>Dikkatle dura sağlam (1 mm çapında) bırakarak steril bir tıraş bıçağı ile kafatası açın (Şekil 1 c). Jelatin sünger kullanın (steril makas kullanarak yaklaşık < 2 mm3, küçük parçalar halinde kesilmiş ve uygulamanızı Cımbız kullanarak) korteks arabellek12 ' (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glikoz, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 batırılmış ve 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; Oda sıcaklığında) kanamayı durdurmak için. Kafatası açarken, beyin yüzey nemli tutmak için bir korteks arabellek geçerli.</li>
	<li>Dural yüzeyindeki bir Jelatin sünger kullanarak herhangi bir arabellek ve kan çıkarmak. İnce tabaka sarı %1.0 (korteks arabellekte çözünmüş) düşük erime noktası özel kullanmanın ipuçları geçerlidir. Bir ısı blok makine kullanarak, özel çözüm 42 ° c sıcaklık uygulama kadar sürdürmek. Not: Kan ve arabellek boşaltma kuru Jelatin sünger ile temas dura gelmez dikkat çekici iken kranyotomi tarafındaki gerçekleştirilmelidir. Aksi halde beyin zarı zarar verebilir.</li>
	<li>Yuvarlak cam coverslip (No. 1, 3 mm çapında) özel jel tabaka uygulayın. Coverslip ve özel jel katman arasındaki tüm kabarcıklar özel jel aralarında aşırı dökerek kaldırın. Cımbız (Şekil 1 d ve 1E) kullanarak coverslip altından çıkıntılı aşırı jel kaldırın.</li>
	<li>Coverslip diş çimento (Şekil 1F) kullanarak güvenli.</li>
	<li>Mix çimento tozu ve çimentosu sıvısı. Katılaşmış olur önce sarı ipuçları kullanarak karışımı uygulamak. Bu beyin zarar verebilir çünkü dura üzerine diş çimento geçerli değildir.</li>
	<li>Steril bir titanyum eklemek diş çimento kullanarak kafatası kemik üzerinde bar (özel yapım, Şekil 1Gbkz: yaklaşık 30 mg). Titanyum bar ve coverslip (dura yüzeyinde) kolayca esir alma imge paralel olarak hizalayın.</li>
	<li>Diş çimento (Şekil 1 H) ile maruz kafatası kapağı.</li>
	<li>Yavru fok anesteziden kurtarmak. Diş çimento (1 h) katılaşmış kadar bir ısıtıcı (37 ° C) tutmak.</li>
</ol>4. iki fotonlu görüntüleme
Not: Resim 2 vivo içinde Albümdeki iki fotonlu mikroskop kullanarak bir titanyum-Safir lazer ile satın alınan (çapı [1/e2]2ışınla: 1,2 mm).
<ol><li>İki fotonlu lazer dalga boyu ayarlayın. RFP uyarma, kullanım 1.000 nm (450 mW/mm2 ' de derinlik 400 µm) için. Not: z-pozisyon ilerlerken lazer güç azaltılmalıdır.</li>
	<li>Coverslip % 70 etanol ile yüzeyi silin.</li>
	<li>İsoflurane (% 1.5-%2.0) kullanarak yavru anestezi ve kuyruk-çimdik testi kullanılarak anestezi seviyesini kontrol edin.</li>
	<li>Yavru fok titanyum çubuk pups kafasına (Şekil 2A ve 2B) kullanarak görüntüleme sahnede Titanyum plaka ekleyin. Öyle ki coverslip Gonyometre sahne alanı'nda (Şekil 2B) kullanarak objektif lens paralel baş ayarlayın. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) kullanarak yavru vücut ısısını korumak.</li>
	<li>İsoflurane konsantrasyonu % 0.7 - %1.0 ayarlayın. Not: Bir çok yüksek isoflurane konsantrasyon yavru fok kaza sonucu ölüm görüntüleme sırasında neden olabilir.</li>
	<li>Görüntüleme sahnenin altında iki fotonlu mikroskop (Şekil 2B ve 2 C) objektif lens (20 X, NA 1.0) yerleştirin.</li>
	<li>Bir damla su coverslip üzerine uygulayın. Epi-floresan floresan protein etiketli nöronlar içinde belgili tanımlık alan nereye dura maruz bulmak için kullanın.</li>
	<li>Z-yığın görüntüleri 1.4-µm aralıklarla elde etmek. Katmanı için 4 nöron görüntüleme-tüm dendritik morfolojisi (Şekil 2B ve 2E) görüntü için 150-300 µm z genişliğini ayarlayın. Kullanım yavaş tarama ve nöronal morfoloji gösterilen net görüntüler elde etmek için Ortalama (genellikle tüm dendritik morfoloji elde etmek için 20 > dk sürer). Not: Aşağıdaki parametreleri görüntüleme için tavsiye edilir. Uyarma dalga boyu: 1.000 nm, tarayıcı: galvanometre türü, Dikroik ayna: 690 nm, emisyon filtresi: 575-620 nm bant, dedektör: GaAsP türü ayarı > 100 kazanç, görüntü boyutu > 512 x 512 µm, görüş alanı > 600 x 600 µm, piksel çözünürlük < 1.2 µm.</li>
</ol>5. kurtarma ve hemşirelik
<ol><li>Yavru görüntüleme sahne alanı'ndan bağlantısını kesin.</li>
	<li>Yavru bir ısıtıcı (37 ° C) yerleştirin ve (15 dk) kurtarmak sağlar.</li>
	<li>Yavru bir micropipette 2-h aralıklarla kullanarak ılık süt yem ve yavaşça mide boşaltım izin için teşvik. Yavru fok, vücut ağırlığının ölçerek süt içiyor onaylayın.</li>
</ol>6. yeniden görüntüleme
<ol><li>Pup ile isoflurane (% 1.5-%2.0), anestezi ve kuyruk-çimdik testi kullanılarak anestezi seviyesini kontrol edin. Görüntüleme sahne alanı'na ekleyin.</li>
	<li>Daha önce görüntülü nöronlar bulun ve bir z-yığın görüntü elde etmek. Nöronlar kimlik onların seyrek süpernova ile etiketleme sayesinde kolay değildir.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandı 5.1 6.2 tamamlayana dek. Not: Ağırlık kaybı olmadan 18 s kadar yavru fok görüntüsü. 
</li>
</ol>

<ol><li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li>
<li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272(2005).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-regulated+dynamics+of+layer+4+neuronal+dendrites+during+thalamocortical+reorganization+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supernova%3A+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 35747(2016).</li>
<li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring%3A+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li>
<li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li>
<li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLIFE%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839(2017).</li>
<li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İletişim kuralı kritik adımlar ve sorun giderme:
En kritik Protokolü'nün (iletişim kuralı adım 3.2) kafatası kaldırılması adımdır. Ekleme jilet kez dural kanama ve beynin zarar görmesi neden dura yapışır. Bu kafatasında bir damla korteks arabelleği ekleyerek ve kafatası korteks arabellekte kaldırarak önlenebilir.
Kafatası pencere hazırlık için pencerenin tıkanıklığı açar sonra dura ve cilt kanama. Bu doku önlemek için kullanılan ya da diş çimento izin tamamen kuru bir ...

Serebral korteks nöronal devreler kesin kablolama algı, biliş ve öğrenme ve bellek de dahil olmak üzere daha yüksek beyin fonksiyonları için önemlidir. Kortikal devreleri postnatal geliştirme sırasında dinamik olarak rafine. Çalışmalar histolojik kortikal devre oluşumu kullanarak işlemi ve vitro kültür analizleri araştırdı. Ancak, yaşayan memelilerde devre formasyonu dinamiği çoğunlukla keşfedilmemiş kalmıştır.
İki fotonlu mikroskobu yaygın yetişkin fare beyin1,2nöronal devreler vivo içinde analizleri için kullanılmıştır. Ancak, teknik sorunlar nedeniyle sınırlı sayıda çalışmalar nöronal devre oluşumu yeni doğan farelerde ele sahip. Örneğin, Carrillo vd. beyincik ikinci Doğum sonrası hafta3lifler tırmanma zaman hata görüntüleme yapılır. Portera-Cailliau vd. , akson kortikal katmanına 1 ilk Doğum sonrası hafta4görüntüleme bildirdi. Bu da çalışmanın, katman 4 kortikal nöronlar ve onların dendrites yenidoğan farelerde gözlem için bir protokol özetler. İki yöntemleri içerir, bu iletişim kuralını uygulayarak elde edilen sonuçlar bizim son yayın5' te rapor edilir. Öncelikle, süpernova vektör sistemi5,6 bireysel yenidoğan beyin nöronlarda etiketleme için kullanın. Süpernova sisteminde nöronal etiketleme için kullanılan floresan proteinler değiştirilebilir ve etiketli hücre özel gen nakavt ve düzenleme/nakavt analizleri da mümkündür. İkinci olarak, kırılgan yenidoğan farelerde beyin pencere hazırlanması için bir cerrahi işlem açıklanmaktadır. Birlikte, bu metodolojileri yenidoğan beynindeki bireysel nöronların vivo içinde gözlem izin verir.

<table><tbody><tr><td>pK031 (İngilizce). TRE-Cre</td><td></td> <td>Yazarları-RIKEN</td> <td>BRC ve Addgene</td></tr><tr><td>pK029'dan temin edilebilir. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td><td></td> <td>Yazarlar-RIKEN</td> <td>BRC ve Addgene</td></tr><tr><td>pK273'ten edinilebilir. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td><td></td> <td>Yazarlar-Yazarlardan</td> temin <td>edilebilir</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>410 Anestezi Ünitesi (izofluran gaz makinesi)</td><td>Univentor</td><td>8323101</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (doku yapıştırıcısı)</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td></td></tr><tr><td>M&micro; ltiFlex Round (yükleme ucu)</td><td>Sorenson</td><td>13810</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (jelatin sünger)</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>Düşük erime noktası</td></tr><tr><td>Yuvarlak şekilli lamel</td><td>Matsunami-Özel</td><td></td> <td>yapım</td></tr><tr><td>Unifast 2 (diş çimentosu)</td><td>GC-Titanyum</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>çubuk</td><td></td> <td>Yazarlar-Özel</td><td> yapılmış (bkz. Şekil 1G)</td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofen)</td><td>Zoetis-Enjekte</td><td></td> <td>edilebilir</td></tr><tr><td>2-foton mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>LSM7MP</td><td></td></tr><tr><td>Titanyum-safir lazer</td><td>Spertra-Fizik</td><td>Mai-Tai eHPDS</td><td></td></tr><tr><td>Titanyum plaka</td><td></td> <td>Yazarlar-Özel</td> <td>yapım (bkz. Şekil 2A)</td></tr><tr><td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td><td>BITPLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonyometre aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>GN2/M</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

İki fotonlu görüntüleme memeli beyinde nöronal devreler vivo çözümlenmesi için güçlü bir araçtır. Ancak, vivo içinde görüntüleme yöntemleri sınırlı sayıda canlı yeni doğan memeliler beyin dokusunun incelenmesi için bulunmaktadır. Burada yaşayan yenidoğan farelerde bireysel kortikal nöronlar görüntüleme için bir protokol özetler. Bu iletişim kuralı aşağıdaki iki yöntemleri içerir: (1 süpernova sistemi gelişmekte olan beyin ve kırılgan yenidoğan kafatası için (2) bir cerrahi işlem kortikal nöronların seyrek ve parlak etiketleme için. Bu iletişim kuralı bireysel kortikal neurites zamansal değişiklikleri gözlem yüksek sinyal gürültü oranı ile yenidoğan aşamaları sırasında sağlar. Etiketli hücre özel gen susturmak ve nakavt Ayrıca süpernova RNA müdahale ve CRISPR/Cas9 gen sistemleri düzenleme ile birleştirerek elde edilebilir. Bu iletişim kuralı böylece, kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir.

Rakamlar 2D - 2F iki fotonlu hızlandırılmış görüntüleme mevcut protokolü kullanılarak katman 4 kortikal nöronların temsilcisi sonuçları göster. Çözümleme amacıyla nöronlar görüntüleme dönemleri boyunca açık dendritik morfolojisi ile seçin. Dendritik morfolojisi görüntülü nöronların morfolojik analiz yazılımı kullanarak analiz ettik. Temsilcisi dendritik morfoloji yeniden Şekil 2Fiçinde gösterilir. Bağlantısı kesilen gösterile...

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Bu yöntem nörolojide anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle nöron soketi oluşumu ile ilgili olanlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, araştırmacıların yaşayan yenidoğan farelerde bireysel nöronların morfolojik değişikliklerini analiz edebiliyor olmasıdır. Doğum sonrası beş yavru ile anestezi ile başlayın ve kuyruk kıskaç testine bir reaksiyon yokluğunda devam edin.İlk olarak,% 70 etanol ile silerek kafa derisi sterilize. Daha sonra, kafatası kapsayan derinin yaklaşık 20 milimetre kare kaldırmak için% 70 etanol ile sterilize makas kullanın. Sonra, steril forceps ve korteks tampon batırılmış temiz bir pamuklu bez kullanın, kafatası fasya kaldırmak için.Görüntülenecek alan kaçınırken kanamayı durdurmak için damarsız cilt yüzeyine doku yapıştırıcısı uygulamak için bir yükleme ucu kullanın. Başka bir ısıtma yastığı üzerinde yavru yerleştirin, 37 santigrat derece ye ayarlanmış, ve anestezi kurtarmak için izin. Doku yapıştırıcısı kuruyana ve katılanına kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.Doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra, yeniden anestezili farenin kafatası penceresi hazırlığına başlayın. Kafatası üzerine korteks tampon bir damla uygulayın, sonra dikkatle kafatasının bir milime

in-vivo-two-photon-imaging-of-cortical-neurons-in-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Yenidoğan Farelerde Kortikal Nöronların İki Fotonlu Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, anestezi uygulanmış bir transgenik fare yavrusunun beynindeki nöronları görüntülemek için kullanılan iki foton mikroskobunu göstermektedir. İki fotonlu lazer, yüksek uzamsal çözünürlük ve minimum ışık saçılımı ile daha derin görüntülemeye olanak tanıyarak dendritik projeksiyonlar da dahil olmak üzere nöronal morfolojinin ayrıntılı bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Bir Fare Yavrusunda Nöronal Morfolojiyi Görüntülemek için İki Foton Mikroskobu

Source: Nishimura, C.  ve ark. HIV Kaynaklı Nöroinflamasyonun Fare Modelinde İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Serebral Vasküler Mimarinin Ölçülmesi. J. Vis. Exp. (2016). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak fare beynindeki kortikal kılcal damarların in vivo görselleştirmesini göstermektedir. İnce kafatası kortikal pencereli anestezi uygulanmış bir fareye floresan boya enjekte etme, görüntüleme için kurulumu hazırlama ve analiz için beyin mikrovasküler yapılarının ayrıntılı görüntülerini...

 Fare Beyni Mikrovaskülatürünün İn Vivo Görüntülenmesi için İki Foton Mikroskobu 

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Neokorteksteki birincil duyusal alanlar, gelişim sırasında benzersiz spontan aktiviteler sergiler. Bu makale, yenidoğan farelerde alana özgü senkron aktiviteleri in vivo olarak analiz etmek için bireysel nöron aktivitelerinin ve birincil duyusal alanların nasıl görselleştirileceğini açıklamaktadır.

Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi

Keşfedin, yenidoğan farelerde iki fotonlu görüntüleme ile kortikal nöronların dinamik morfolojik değişikliklerini canlı olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, nöron gelişimi ve hastalık modellerindeki süreçleri detaylı incelemeye olanak tanır.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Daha fazla video keşfet