Name: 锁骨下静脉穿刺作为大鼠采血的一种替代方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习大鼠锁骨下静脉穿刺采血技术，作为尾静脉采血失败时的替代方案。该方法在全身麻醉下进行，通过识别胸骨上窝定位穿刺点，操作安全可行，适用于需要大量血样的研究。

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未声明任何利益冲突。

本研究经中南大学湘雅二医院（中国长沙）动物研究伦理委员会批准。手稿的撰写遵循《动物研究：活体实验报告》（ARRIVE）指南9。
1. 材料与动物准备
<ol>
	<li>准备所需材料：胶带、脱毛剂、75% 乙醇、采血管、2.5 mL 注射器（连接 24 G，0.6 mm × 25 mm 针头）、毛发剃刀、电子天平和量规（参见材料表）。</li>
	<li>使用 20 只 8–10 周龄、体重为 153–200 g 的 Sprague-Dawley（SD）大鼠（参见材料表）。按照《实验动物护理与使用指南》10的要求进行大鼠饲养与管理。</li>
	<li>将大鼠饲养在标准条件下，自由摄取食物和饮用水。每笼 2 只，置于底面积为 530 cm2 的笼具中，垫以木屑作为垫料。保持动物饲养环境温度恒定，约为 25 °C。</li>
	<li>在进行锁骨下静脉穿刺前，通过腹腔注射给予戊巴比妥钠（40 mg/kg）诱导全身麻醉。</li>
	<li>将大鼠置于仰卧位，将其后肢固定于舒适位置，并将前肢平行于身体纵轴固定在躯干旁。 
	注意：本操作无需机械通气（图 1）。</li>
	<li>清洁双侧锁骨下区域，去除毛发（使用毛发剃刀和脱毛剂，参见材料表）及任何可见污物。用 75% 乙醇擦拭颈部和胸部皮肤。用纱布保持穿刺区域清洁干燥。</li>
</ol>
2. 血液采集步骤
注意：锁骨下静脉两侧均适合穿刺，此处选择右侧进行穿刺。操作者用左手拇指确定右侧锁骨的位置和方向（图2）。用食指轻触胸骨上窝，因穿刺针的方向指向胸骨上窝（图2）。
<ol>
	<li>用肝素溶液（10 IU/mL）冲洗一支无菌的2.5 mL注射器。</li>
	<li>在右锁骨外侧1/3区域远端0.5 mm处确定穿刺部位（图3）。将注射器轻柔地刺入穿刺部位皮肤。一旦针头进入锁骨下皮肤，操作者用右手施加负压（图4）。 
	注意：平均和最大采血量分别为1.0 mL和1.4 mL。针头方向应朝向胸骨上窝，并且几乎与锁骨平行，略偏其后方。通常沿此方向进针约2 mm即可到达锁骨下静脉。一旦针头进入静脉，血液将在负压作用下流入注射器。
	<ol>
		<li>保持负压状态，直至采集到足够的血量（图5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若锁骨下静脉采血未成功，应将针头退至皮下区域，并轻微调整针头方向，使其更靠近胸骨内侧。
	<ol>
		<li>若连续三次尝试均失败，则应避免从同侧继续穿刺锁骨下静脉，改用对侧进行采血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采血完成后，拔出穿刺针，并对穿刺部位施加压力1–2分钟，以止血。 
	注意：施加的压力必须非常轻柔，以防造成压迫窒息。</li>
</ol>
3. 血液样本处理
<ol>
	<li>将血液样本转移至含有抗凝剂（EDTA）的真空采血管中，以1600 × g离心10分钟，收集血浆。</li>
	<li>吸取上清液至洁净试管中，并于-80 °C保存（图6）。</li>
</ol>

<ol><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology%2C+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Korfmacher, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+capillary+microsampling+for+rat+pharmacokinetic+studies%3A+Comparison+of+tail-vein+bleed+to+jugular+vein+cannula+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheterization+of+the+carotid+artery+and+jugular+vein+to+perform+hemodynamic+measures%2C+infusions+and+blood+sampling+in+a+conscious+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).</li>
<li>Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Repeated+Tail+Clip+and+Saphenous+Vein+Phlebotomy+on+Rats+Used+in+Toxicology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).</li>
<li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51969(2014).</li>
<li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Glucose+Metabolism+Kinetics+Using+18F-FDG+Micro-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li>
<li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), 266(2007).</li>
<li>Zou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Blood+Collection+from+Tail+Vein+of+Non-Anesthetized+Rats+with+a+Vacuum+Blood+Collection+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Kilkenny, C., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+ARRIVE-ing+at+a+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution.</a> Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).</li>
<li>National Institute of Health. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).</li>
<li>Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axillary+vein+puncture+without+contrast+venography+for+pacemaker+and+defibrillator+leads+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+and+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation.</a> Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).</li>
<li>Luis, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+magnetic+resonance+imaging+of+the+thoracic+venous+system+in+rats+with+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+and+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
</ol>

本工作受到国家自然科学基金（编号81670269、81500355和81500226）的资助。

本文介绍了一种从锁骨下静脉采血的替代方法，并证明该方法在大鼠血液采集中具有可行性、安全性和适用性。该方法借鉴了临床为患者植入起搏器导线时进行的锁骨下静脉穿刺技术11。锁骨下静脉位于锁骨后下方，是腋静脉的延续，走行于第一肋骨外侧缘至前斜角肌内侧缘之间12。随后，该静脉与颈内静脉汇合形成头臂静脉，并汇入上腔静脉，位置恰在胸骨上窝下方（图8）。锁骨易于辨认，且锁骨下静脉与锁骨之间具有明确的解剖关系。本研究将这一临床技术应用于动物实验。由于人类与大鼠上肢的解剖方位不同，在操作过程中需将大鼠的上肢紧贴躯干放置，以暴露锁骨下方的空间，从而便于穿刺（图1）。
锁骨下静脉比尾静脉大得多，因此从锁骨下静脉获取足够血量比从尾静脉更容易。每次采血总量可达总循环血量的10%1。如果传统的尾静脉采血或其他采血途径失败，研究人员可考虑采用锁骨下静脉穿...

在动物研究中，采血是必不可少的操作。可用于采血的目标静脉包括眶后静脉丛、颈静脉、隐静脉、尾部血管以及颈动脉1,2,3,4。有时也可从腹主动脉、下腔静脉甚至心脏采血5,6,7。然而，采用这些方法时，动物必须被处死，无法用于后续观察，因此在日常实验工作中较少使用。相比之下，从大鼠尾静脉采血较为常用，且对动物造成的应激更小8。
然而，从尾静脉采血有时受限于不理想的采血成功率。偶尔也难以通过该方法获得足够的血量。由于锁骨下静脉足够粗大且位于锁骨下方，当常规采血方法失败时，锁骨下静脉穿刺可作为替代的采血方法。本文介绍一种通过锁骨下静脉穿刺在大鼠中进行采血的方法。

<table><tbody><tr><td>大鼠</td><td>湖南斯莱克实验动物有限公司（中国湖南长沙）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>统计软件</td><td>SPSS Statistics 17</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛剂</td><td>中国广东省广州市法国伊莎化妆品有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL 注射器</td><td>山东威高集团医用高分子有限公司（中国山东省威海市）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛发剃除器</td><td>上海飞科电器有限公司（中国上海）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M Deutschland GmbH（德国卡门爱迪生街6号，邮编59157）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>默克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>中南大学湘雅二医院药学部</td><td></td><td></td></tr><tr><td>采血管</td><td>湖北金星科技&amp;安普&发展有限公司（中国湖北省武汉市）（2 ml）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>中国广东省东莞市胜恒电子有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>帆布手套</td><td>用于麻醉</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>南京新百药业&amp;nbsp; 有限公司（中国江苏省南京市）（2 mL，12500 IU）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>中国湖南科伦制药有限公司（中国湖南岳阳，100 ml）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

经颈静脉穿刺作为大鼠采血的替代方法

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

在动物实验中，采集足量血液至关重要。与眼眶后丛采血等更具侵入性的方法相比，从大鼠尾静脉采血较为常用且应激较小。然而，该采血方法有时受限于成功率不理想。本文介绍一种经锁骨下静脉穿刺进行采血的方法。锁骨下静脉位于锁骨正下方，管径较粗，足以满足采血所需的血量要求。我们的结果表明，该方法安全可行，能够满足所需血量的采样需求。当大鼠尾静脉采血失败时，经锁骨下静脉穿刺采血可作为替代的采血方法。

本实验共使用20只SD大鼠（雄性10只，雌性10只）。血液采集操作由熟练操作者和初学者操作者分别进行，其中熟练操作者具有20次以上大鼠锁骨下静脉采血经验，而初学者操作者无大鼠或其他动物锁骨下静脉穿刺经验。操作前，初学者至少观摩了3次熟练操作者完成的完整操作过程。
通过右侧锁骨下静脉通路，17只大鼠采血成功。3只大鼠该操作失败（熟练组1只，初学者组2只），这3只大鼠通过左侧锁骨下静脉通路成功完成采血。各案例的采血时间进程及采集血量如图所示 表1初学者组的成功率为80%，熟练组为90%，两组之间成功率相似。 p = 0.531）。当纳入3只大鼠额外的左侧锁骨下静脉通路时，两组的成功率均为100%。双尾Student's t检验结果显示，初学者组与熟练组在所用时间上无显著差异（102.1 ± 14.9 秒 vs. 84.3 ± 9.7 秒，p = 0.33）， <strong class=...

本文介绍了一种从大鼠锁骨下静脉采集血液样本的实验方案。

足够的血液体积采集在动物实验中至关重要。大鼠尾静脉采血是一种常用且应激较小的采血方法……

锁骨下静脉穿刺作为大鼠采血的替代方法。全身麻醉后，将大鼠置于仰卧位，用75%乙醇对锁骨下区域进行消毒。穿刺前确定胸骨上窝位置。确定穿刺部位，位于同侧锁骨外三分之一段的尾侧。针头方向应朝向胸骨上窝，且几乎与锁骨平行，紧靠其后方。采血后，按压穿刺部位一至两分钟，以止血。在动物实验中，始终需要采集足够体积的血液。大鼠尾静脉采血是一种常用方法，相较于眶后静脉丛采血等侵入性较强的采血方式，该方法对动物的应激较小。然而，该方法的局限性在于成功率较低。本文介绍了从锁骨下静脉采集所需血量的方法。我们的结果显示，该方法安全且实用，在尾静脉采血失败的情况下可予以考虑。首先，准备胶带、脱毛剂、75%乙醇、采血管、2.5 mL注射器、剃毛器、电子天平、肝素和生理盐水。在标准条件下饲养的家鼠，可自由获取食物和饮用水，笼具面积为530平方厘米，垫料为木屑。在穿刺前，通过腹腔注射对所有动物实施全身麻醉。将大鼠置于仰卧位，后肢固定于舒适位置，前肢平行于身体并紧靠躯干固定。清洁锁骨下区域的两侧，去除毛发和任何可见的污物。用75%乙醇擦拭颈部和胸部皮肤，并用纱布保持该区域清洁干燥。双侧锁骨下静脉均适合穿刺，此处选择右侧进行穿刺。用操作者左手拇指确定右侧锁骨的位置和方向，并用食指轻柔地定位胸骨上窝。用每毫升10单位的肝素溶液冲洗注射器。确定穿刺点，位于右侧锁骨外侧三分之一区域远端0.5毫米处。将注射器轻柔地刺入穿刺部位的皮肤。一旦针头进入锁骨下皮肤，操作者右手需施加主动压力。针头方向应朝向胸骨上窝，并几乎与锁骨平行，位于锁骨后方紧邻处。通常，沿此方向进针约两毫米即可到达锁骨下静脉。一旦针头进入静脉，血液将在主动压力作用下流入注射器。此后必须持续保持主动压力，直至抽取到足够的血量。采血后，取下穿刺针，按压穿刺部位一到两分钟以止血。注意：按压力度必须非常轻柔，以防堵塞。将血液样本转移至含EDTA的抗凝真空管中，以1600G离心10分钟，收集血浆。吸弃上清液以重新清洁离心管，并在-18摄氏度下保存。为比较熟练操作者与初学者的成功率，将20只SD大鼠随机分为两组。结果显示，通过右锁骨下静脉，熟练组中有9只大鼠成功，初学者组中有8只大鼠成功。随后，从其余三只大鼠的左侧成功采集了血液。这两组之间的成功率无显著差异。但这两组的时间进程略有不同。操作过程中及操作后未发生气胸、血气胸和出血等严重并发症。所有动物在采血后均存活。为了说明学习穿刺操作的难度，我们进一步比较了熟练组与初学者组之间的退针次数。如表二所示，熟练组的平均穿刺次数略少于初学者组，但差异无统计学意义。综上所述，我们的结果表明，采用锁骨下静脉穿刺法在大鼠中进行采血是安全且可行的。该方法具有重要应用价值，尤其适用于需要采集大量血液样本的场合。如果常规采血失败，该方法可能是一种理想的替代方案。

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