Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optogenetisk manipulation af neurale kredsløb under overvågning søvn/vågenhed stater i mus
Chapters
Summary June 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi metoder til optogenetisk manipulation af bestemte typer af neuroner under overvågning af søvn/vågenhed stater i mus, præsenterer vores seneste arbejde på sengen kernen af Stria terminalis som et eksempel.
Transcript
Denne procedure kan hjælpe os med at identificere funktionen af specifikke neuro kredsløb, der er involveret i søvn vågenhed regulering med mindre invasive manipulation og høj tidsmæssig opløsning. Denne metode giver os overvågningsoverfladeN EEG i realtid sammen med manipulation af et bestemt neurokredsløb for at undersøge årsagssammenhængen mellem kredsløb og søvnlædelighedsstater. Shota Kodani vil demonstrere proceduren.
Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, anvende salve på dyrets øjne og bruge ørestænger og næse pin til stereotaktiske apparat til at stabilisere hovedet af bedøvet mus på en absorberende pad. Når hovedet er fastgjort i position, foretage en mid-sagittal snit i hovedbunden for at bekræfte, at skæringspunktet mellem sutura sagittalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidea er i en vandret linje på samme niveau. For at undgå et positionshul skal du justere næseknæen og ørestængerne efter behov.
Derefter ved hjælp af serafin klemmer til at holde huden åbne desinficere den udsatte overflade af kraniet for at gøre det muligt kraniel suturer, der skal visualiseres mere klart. For at indsprøjte den adeno-associerede virusvektor skal en ethanolsteriliseret 10 millilitersprøjte med to mikroliter mineralsk olie, efterfulgt af den eksperimentelle virusmængde, der skal injiceres. Brug mikroinjektionspumpen til at justere spidsen af mikroinjektionsnålen på bregmaen og noter koordinaterne som oprindelsessted.
Flyt derefter spidsen til det udpegede injektionssted, og placer spidsen af nålen på positionen. Marker kraniet på injektionsstedet og bruge en dental boremaskine udstyret med en 0,7 millimeter hårdmetal cutter til at bore en cirka to millimeter diameter hul i kraniet. Efter fjernelse af blod fra omkring hullet med en vatpind, langsomt flytte nålen til sengen kernen af stria terminalis eller BSNT og langsomt injicere den udpegede mængde virus opløsning.
Lad derefter nålen være på plads i fem minutter, så opløsningen kan infiltrere BNST-vævet tilstrækkeligt, før nålen trækkes tilbage. For elektroencefalogram, eller EEG, og elektromyogram, eller EMG, elektrode implantation, første lodde to rustfrit stål ledninger, hvorfra en millimeter isolering er blevet strippet fra begge ender til EMG elektroder og placere midten af elektroderne på bregma. Marker derefter positionen for hver EEG-elektrode.
For at bestemme placeringen af det optiske fiberimplantat, fastgør en optisk fiber ferrule til manipulator og rotere manipulator armen til et plus eller minus 30 graders vinkel mod en vandret linje. Sæt fiberspidsen på bregma og optag koordinaterne. Flyt spidsen til den målrettede indsætningslinje, og markér positionen på kraniet og placeringen af ankerskruen ved siden af indsætningsstedet.
Brug dental boremaskine til at bore kraniet på hvert sted og bruge manipulator til forsigtigt at indsætte den optiske fiber, indtil den når over BNST. Ferrule bør hvile på det resterende kranium. Fastgør fiberen til kraniet med en ankerskrue, og pas på ikke at bryde duraen eller beskadige væv.
Derefter dække fiber og skrue med foto-helbredes dental cement. Derefter bores huller til EEG/EMG-elektroder, og spidsen af den første elektrode indsættes i et hul. Hold implantatet med den ene hånd, anvende cyanoacrylat lim til rummet mellem kraniet og elektroden og indsætte elektroden resten af vejen, passe på ikke at beskadige noget væv.
Når alle elektroderne er placeret, dække omkredsen af elektroderne og de optiske fibre med yderligere cyanoacrylat klæbemiddel og cyanoacrylat accelerant for at undgå at forårsage nogen afbrydelse på ferrule til optisk kabel og elektrode til bly tråd forbindelseszoner. Udsæt nu nakkemusklerne, og indsæt ledningerne til EMG-elektroden under musklen. Juster længden af EMG-elektroden, så den passer lige under nakkemusklerne, og fyld implantaterne med mere cyanoacrylatklæbemiddel og accelerant.
Placer derefter musen på en varmepude med overvågning, indtil fuld kompensation. For EEG / EMG overvågning under foto-excitation af målrettede neuroner, skal du først bruge en skalar til at justere laser intensitet og bruge en ferrule til at binde spidsen af laserkablet til en ubrugt optisk fiber. Bekræft, at der ikke er plads ved krydset mellem fiberen og kablet.
Efter 20 minutter udsender den varmede laser til intensitetskontrollen og justerer intensiteten til 10 milliwatt pr. millimeter kvadreret. Indstil lyspulsvarigheden til 10 millisekunder, hvileperioden til 40 millisekunder, cyklussen til 20 og gentagelsen til 20. Skift lasertilstand til transistorlogik og bekræft, at lysimpulser udsendes fra den fiber, der styres af mønsterregulatoren.
Tilslut den implanterede elektrode og kabeladapteren, og dæk derefter krydset med let uigennemtrængeligt materiale for at forhindre laserlækage. Og når laseren er klar, skal du flytte musene til forsøgskammeret til EEG/EMG-optagelse. For at vurdere ventetiden til vågenhed fra ikke hurtige øjenbevægelser eller hurtig øjenbevægelses søvn, begræns optagetheden og optimeret tid til at få tid til at få tid til at vinde på stedet, og lad musene bevæge sig frit i forsøgskammeret i mindst en time.
I forsøgsperioden overvåges EEG- og EMG-signalerne på samme optageskærm. Vurder musens tilstand som vågenhed, ikke hurtig øjenbevægelse søvn, eller hurtig øjenbevægelse søvn ved hjælp af gevinst kontrol for hver bølge for at lette at skelne hver tilstand. Til måling af den ikke hurtige øjenbevægelse søvn til vågenhed latenstid, observere stabil ikke hurtig øjenbevægelse søvn i 40 sekunder, derefter tænde mønster generator for foto stimulation og bekræfte laser emission til de implanterede optiske fibre.
Optag derefter EEG/EMG-signalerne, indtil søvntilstanden ændres til vågenhed. Her repræsenterede EEG/EMG spor før og efter foto stimulation under ikke hurtig øjenbevægelse søvn er vist. En høj spænding og langsom frekvens EEG uden EMG signaler, repræsenterer ikke hurtig øjenbevægelse søvn.
Foto stimulation udløste en akut overgang til vågenhed omkring to sekunder efter stimulation i channelrhodopsin-2 udtrykke mus, mens kontrol mus ikke demonstrere denne overgang, hvilket tyder på, at excitation af BNST GABA neuroner under ikke hurtig øjenbevægelse søvn udløser en hurtig induktion af vågenhed. Omvendt, foto stimulation under hurtige øjenbevægelser søvn havde ingen effekt, så en overgangseffekt kun opstod i ikke hurtig øjenbevægelse søvn. Det er vigtigt at passe på præcise koordineringer for virus injektion og optisk fiber implantation trin.
EEG/EMG-spor, der er fanget under søvnanalysen, kan bruges til at vurdere konsekvenserne af fotomanipulationen på de forskellige årvågne tilstande hos mus. Denne teknik vil også hjælpe os med at identificere andre komponenter og kredsløb, der er involveret i reguleringen af søvn vågenhed stater. Brug beskyttelsesbriller for at undgå laserskader på øjet og sørg for altid at autoklave sterilisere den adeno-associerede virus vektor beholder efter brug.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
