Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo
Chapters
Summary February 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.
Transcript
Bu önlem anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İnsanbilim alanında. Patolojik koşullara fizyolojik son makrofajların işlevinde bu cevap.
Bu tekniğin en büyük avantajı polietilennemi kaplı verimli hücre ödün vermeden en vitro olabilir. En uygun dozlarda. Bu tekniğin etkileri tedavi ve birçok kronik inflamatuar bozukluklar ve kanserlerin tanısı doğru uzanır.
Makrofajların patogenezde önemli rol oynadığı yer. Prosedürü gösteren Na Jia olacak. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi.
Ve Kaixuan Wang, Dr. Xiaohua'nın laboratuvarından yüksek lisans öğrencisi. Allylic asit modifiye süper paramanyetik demir oksit nano tanecikleri veya SPION ilk pharas klorür heksahidat 28 gram ekleyin hazırlamak için. Ve 20 gram pharas selfate heptahydrate içeren bir kabın 80 mililitre deiyonize su.
Ve çözeltiye azot sokmak için cam bir kanal kullanın. Katı madde eriyene kadar karıştırılır. Reaksiyon karışımını dakikada 800 dönüşle karıştırarak 72 santigrat dereceye ısıtın.
Ve kabına 40 mililitre %28 amonyya suyu ekleyin. Beş dakika sonra allylic asit damla bilge dokuz mililitre ekleyin. Ve karışımı 72 derecede sürekli karıştırarak üç saat boyunca saklayın.
Kuluçka sonunda oda sıcaklığına çıkan çözeltisoğun. Ve standart protokollere göre manyetik ayırma yoluyla karışımı çökeltin. Daha sonra çökelti içeren SPION'u üç kez mutlak etil alkolle yıkayın.
Ve çökeltiyi 100 mililitre n-heksane ile asperse. Dimercapto akrilik asit modifiye SPION's hazırlamak için allylic asit modifiye SPION's 800 miligram ekleyin. 200 mililitre n-heksane ve 400 miligram dimercapto akrilik asit içinde dağılmış 200 mililitre aseton içinde 60 santigrat derecede bir su banyosunda üç boyun şişesine dağılmış.
Sonraki dakikada 1000 rotasyonları ve reflü ile karıştırma ile şişe akıllıca triethylammine damla 200 mikrolitre ekleyin. Siyah bir çökelti beş saat sonra manyetik ayırma ile elde edilebilir. Daha sonra tetramethylammonium hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını hidrofilik SPION'un deiyonize sudaki homojen dağılımları için ayarlayın.
Dejenere polietilen kaplı SPION's dimercapto akrilik asit modifiye SPION kolloidal çözeltisi 10 kilodalton polietilen çözeltisi içine akıllıca damla ekleyin. 500 mililitrelik üç boyun şişesinde iki saat boyunca dakikada 1000 dönüşle mekanik karıştırma altında. Kuluçka sonunda 100 kilodalton ve 15 mililitre lik bir içerik kesilmiş bir moleküler ağırlık ile ultra filtrasyon tüpü için ortaya çıkan çözüm ekleyin.
Kalan çözelti bir mililitre hacmine ulaşana kadar numuneyi centrafuse kullanın. Hacmi 15 mililitreye geri getirmek için çözeltiye deiyonize su ekleyin. Ve centrafuse ve sadece gösterildiği gibi on kat daha fazla çözelti rehydrate.
Daha sonra çözeltiyi 4 santigrat derecede depolamak için 22 mikron filtreden geçirin. SiRNA nano tanecikleri hazırlamak için ilk taze hazırlanmış 20 mikromolar siRNA çözeltisi üç mikrolitre eklemek beş etiketli RNA ücretsiz mikrosanroafused tüpler. Ve 0, 8, 1.6, 3.2 ve 6.4 mikrogram polietilenin SPION's tüpler ilerler sıfır, bir, iki, dört ve sekiz sırasıyla etiketli.
Nazik pipetleme ile karıştırıldıktan sonra, polietilen inilmin SPION siRNA komplekslerinin oluşmasını sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ve ben saf agarose ile yüzde üç agarose jel hazırlayın. Kuluçka sonunda her tüp için örnek beş mikrolitre başına 6X DNA yükleme tampon bir mikrolitre ekleyin ve dikkatle karıştırın.
Daha sonra tüm örnekleri jel üzerine yükleyin. Ve elektroforezi santimetrede beş volta çalıştırın. Bromofenol mavisi boya jel üzerinde uzunluğunun üçte ikisini göç edene kadar.
Transfeksiyondan bir gün önce RAW264.7 hücre kültürü gibi bir fare mikrofajını PBS ile yıkayın. Ve hücreleri %25 tripsin mililitresi ile tedavi edin. Hücrelerin çoğu koptuğunda.
Tam DMEN beş mililitre ile tripsin inaktive. Sonra herhangi bir hücre kümeleri dağıtmak için çözelti birkaç kez pippete. Santrifüj için hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik conackel tüpe aktarın.
Sonra tekrar sayma için taze tam DMEN beş mililitre hücreleri askıya. Hücreleri tam DMEN konsantrasyonunun mililitresi başına 4,5 kat on ile dördüncü hücrelere seyreltin. Ve hücre kültürü kuluçka 24 saat kuluçka için altı kuyu plaka her kuyuya orta iki mililitre ekleyin.
Ertesi gün polietilennemimine SPION siRNA nano tanecikleri uygun oranı hazırlamak 1.5 mililitre RNA akarsu mikrosantrifüj tüp nazik karıştırma ile sadece gösterildiği gibi. Ve her kuyuya uygun polietilen neneimin SPION siRNA nanopartikül kompleksinin hacmini ekleyin ve bir mililitre taze ortam la değiştirilmiştir. Polietilen nenemin SPION si kompleksleri hazırlayın.
Bu durumda polietilen infesonin SPION çok daha fazla ay böylece potansiyel toksisite en aza indirmek için kullanılabilir. Sonra iyi dipleri arasında nano tanecikleri eşit bir dağılım elde etmek için dikkatle plaka girdap. Sonraki hücresel güncelleme veya gen nakavt eksikliği analizi kadar hücre kültürü kuluçka için plaka dönün.
30.5 ve 37 milivolt zeta potansiyeline sahip polietileninspiin SPION's mililitre başına demir 30 mikrogram kadar konsantrasyonlarda belirgin bir sito toksisitesi göstermez. Normalde hücre nakli için kullanılan konsantrasyondan yaklaşık iki kat daha fazla. Polietilennemimine SPION'un zeta potansiyeli 48 milivolt ancak toksiktir.
En düşük dozda bile incelendi. Akış sitometrisi tarafından analiz edildiği gibi, hücrelerin %90'ından fazlası floresan olarak etiketlenmiş polietilen spion siRNA kompleksleri ile mililitrede 15 mikrogram demirle geçirilebilir. Polietilenin SPION siRNA konsantrasyonlarının mavi boyamayı ezerek hücresel içleştirme üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, mililitrede 7,5 mikrogram demirde minimal tespit edilebilir boyama olduğunu ortaya koymaktadır.
Ama açıkça görülebilen noktalar 15 mikrogram demir mililitre başına büyük olasılıkla polietilen nemine infekas siRNA alımı doygunluğu nedeniyle demir yüksek konsantrasyonlarda artmaz. Polietilen ingelamin SPION'un spesifik siRNA'sı ile transperferant makrofajlar, spesifik olmayan siRNA'ya göre targe mRNA düzeylerinde önemli bir azalma sergilemektedir. SiRNA'nın endositik veziküllerden sitoplazmaya kaçarak RNA girişim mekanizmasına ulaşabileceğini düşündürüyor.
Cd11b pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin intravenöz enjeksiyonundan sonra CD11b pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin flocentimetrical analizi, incelenen tüm organların herhangi bir noktasında CD3 pozitif hücrelere göre makrofajları ifade eden NANO partiküllerin CD11b ile daha verimli bir şekilde alımını ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, polietileninspiin SPION'un ortalama veri potansiyelini 37 milivolttan fazla olmayan bir şekilde hazırlamayı ve düşük demir deki polietilen ingezamin SPION siRNA komplekslerini siRNA oranlarına hazırlamayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların insan ve kanser gibi insan hastalıklarının hayvan motorlarında makrofajı hedeflemenin terapötik potansiyelini keşfetme ihtiyacını karşılaştırır.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
