Name: Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende una técnica de tinción fluorescente de plata para detectar proteínas en geles de poliacrilamida mediante SDS-PAGE. Este método mejora la sensibilidad y especificidad respecto a la tinción cromogénica tradicional.

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Los autores desean agradecer a Patrick Chan en el Ming Wai Lau centro para la medicina reparadora, Karolinska Institutet, por su apoyo técnico. S. X. es agradecido por el apoyo del Consejo Sueco de investigación (Grant No. 2017-06344).

1. preparación del Gel
Nota: La demostración sigue un protocolo estándar para preparar el gel para manchas poco después de SDS-PAGE12. En Resumen, los pasos siguientes describen la preparación de las muestras y electrophoresis del gel.
<ol><li>Realizar SDS-PAGE con geles de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 m m, 15-bien) usando un gel mini tanque lleno con 2-(N -morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido tampón de ácido (MES).</li>
	<li>Diluir las muestras con una mezcla de agua destilada, litio dodecil sulfato (LDS) tampón y un agente de reducción de muestra.</li>
	<li>Carga el primer carril con el doble de acción (10 μl), seguido de la cantidad normal de stock (5 μl) y una serie de diluciones del doble de la acción después de eso (13 diluciones, de 2 x para x 8192).</li>
	<li>Correr el gel a una tensión constante de 200 V durante 30 minutos.</li>
</ol>2. fijación del Gel
<ol><li>Después de la electroforesis, sumergir los geles en una solución de 100 mL de ácido acético al 40% ethanol/10% en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente 2 x (cada uno por 30 min), o durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lave los geles 3 x 10 min cada uno en agua ultrapura en un recipiente limpio. El paso de lavado es fundamental. Si el ácido de la solución de fijación no se quita correctamente en el paso en desarrollo fluorógenos, la excesiva TPE-4TA será activada por el ácido y llevar a la fluorescencia de fondo fuerte en el gel.</li>
</ol>3. preparación del AgNO3solución e impregnación de plata del Gel
<ol><li>Para hacer la solución de3 AgNO (0,0001%) para la impregnación, en primer lugar, disolver 0.01 g de AgNO3 en 10 mL de agua ultrapura para preparar una solución 0,1% AgNO3 . A continuación, añada 100 μl de la solución 0.1% AgNO3 en 100 mL de agua ultrapura para la solución de trabajo. Nota: La solución de AgNO3 debe almacenarse en la oscuridad antes de su uso.</li>
	<li>Impregnar el gel con 100 mL de solución para 1 h de trabajo en un agitador orbital a 50 rpm en un recipiente de vidrio sellado de plata. Es fundamental realizar la impregnación de plata debajo de una campana de humos, protegida de la luz con papel de aluminio.</li>
	<li>Lavar el gel con agua ultrapura (aproximadamente 100 mL) en un recipiente limpio de 2 x 60 s.</li>
</ol>4. fluorógenos desarrollo del Gel
<ol><li>Para preparar la solución colorante (0,1 mM), agregar 3.0 mg de colorante TPE-4TA en 50 mL de agua ultrapura. Someter a ultrasonidos la solución durante unos minutos y añadir una solución de NaOH (por ejemplo 1 M) para ayudar a disolver el tinte.</li>
	<li>Comprobar la fluorescencia de la solución bajo una lámpara de nm UV 365 para asegurarse de que la molécula del colorante se haya disuelto completamente. Sólo soluciones débiles o nonemissive indican disolución completa. Nota: El tinte que TPE-4TA fue sintetizado el protocolo recientemente notificado por Xie et al. 10 la solución TPE-4TA es muy estable y puede conservarse en la oscuridad durante meses.</li>
	<li>Para preparar 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos (10 μm), añadir 10 mL de la solución madre de TPE-4TA en 90 mL de agua ultrapura. Compruebe el pH de la solución usando un medidor de pH y ajustar a 7-9 usando una solución de hidróxido de sodio (1 μm).</li>
	<li>Transferir el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos. Asegúrese de que el gel se sumergen totalmente en la solución. Sellar el recipiente. Cubierta de la luz y agitar durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente. Como alternativa, el paso de incubación puede también reducirse a unos ~ 2 h por precalentar la solución en desarrollo de la AIE a 80 ° C para la coloración y luego dejarlo a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. extracción y proyección de imagen
<ol><li>Transferir el gel a un recipiente limpio y desmanchar en 100 mL de etanol al 10% durante 30 minutos. Nota: El agua sola puede utilizarse para lavar el gel. Sin embargo, es más eficiente utilizar una solución de etanol del 10% para la extracción. Esto ayudará a reducir el proceso de extracción de horas a 30 minutos.</li>
	<li>Enjuagar el gel en agua ultrapura durante 5 minutos.</li>
	<li>Imagen del gel en los 365 nm o 302 canales de nm por un equipo de documentación de gel.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Que se haya presentado una solicitud de patente en esta tinción fluorescente de la plata.

Presentada aquí es una novela plata fluorescente tinción de proteínas en geles de poliacrilamida. Esta estrategia integra fluorescentes manchas y manchas de plata convencionales. Las hazañas de tinción la Unión selectiva de iones de plata a las proteínas como en otros plata manchas pero emplea una plata muy sensible fluorógenos sondeo TPE-4TA para iluminar las proteínas límite plata. Puesto que la sonda fluorógenos TPE-4TA puede detectar iones de plata en una concentración bastante baja ...

Muchos métodos de tinción han sido usados para visualizar proteínas después de electroforesis en gel, por ejemplo utilizando colorimétricos colorantes como el azul brillante de Coomassie, tinción de plata, fluorescencia, o radiactivo etiquetado1,2, 3 , 4. plata es considerada como una de las técnicas más sensibles para la detección de proteínas que requieren reactivos simples y baratos. Pueden ser categorizado en dos grandes familias: la mancha de plata amoniacal y el nitrato de plata manchan5,6. En el método alcalino de plata amoniacal, el complejo diamina de plata se produce con amoníaco e hidróxido de sodio y reducido a plata metálica durante el desarrollo de una solución de formaldehído ácidas. La mancha acomoda eficientemente las proteínas básicas pero muestra una actuación comprometida para las proteínas ácidas y neutras y es, además, se limita a sistemas electroforéticos taurina y glicina clásica. En comparación, las manchas de nitrato de plata aprovechen la alta bio-afinidad de los iones de plata a la proteína, principalmente el sulfidrilo carboxyl grupos de las cadenas laterales y tienden a manchar más eficientemente las proteínas ácidas7. Después de la Unión de iones de plata, una solución en desarrollo (normalmente hecha de una solución de carbonato de metal que contiene formaldehído y sodio tiosulfato) se aplica para reducir los iones de plata a los granos de plata metálicos, que se acumulan de un color marrón-oscuro para visualizar la bandas de proteínas.
Aunque plata ha sido conocido por su versatilidad y su alta sensibilidad desde su desarrollo en la década de 19708, el método es con frecuencia considerado complicado. Métodos de tinción de plata tienen pasos restringidos por el tiempo y demuestran la baja reproducibilidad. Puesto que el color de plata generalmente no es uniforme y depende de la etapa de reducción, que es difícil de controlar, la tinción de plata no es un método cuantitativo y, por lo tanto, no se recomienda para gel comparación estudio y proteína cuantificación9. Métodos optimizados de sensibilidad pueden utilizar aldehídos que también pueden proporcionar un más uniforme coloración10. Sin embargo, esto es a expensas de posteriores análisis por el entrecruzamiento de proteínas por aldehídos. Protocolos rápidos sobre todo combinaran o acortan pasos para reducir tiempo, comprometer la reproducibilidad y la uniformidad de la mancha5. Como resultado, hay numerosas plata tinción variantes en gel proteína coloración, cada uno optimizado para adaptarse a ciertos requisitos; por ejemplo, sencillez, sensibilidad o péptido tasa de recuperación para el análisis de aguas abajo. Estos atributos también pueden tener un impacto sobre otros, y satisfacer todos los requisitos de un protocolo puede ser difícil.
En este trabajo, presentamos un nuevo método para la detección de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. En este método, utilizamos una sonda fluorógenos para iones de plata, TPE-4TA (figura 1), para visualizar las proteínas impregnado de plata11. TPE-4TA es diseñada por el principio de emisión inducida por la agregación (AIE). Es no emisivo cuando está disuelto en solución acuosa, pero es altamente emisiva en presencia de iones de plata. Sustituyendo el desarrollo cromogénico en manchas de plata tradicionales con un fluorógenos desarrollo de paso, el método plata fluorescente permite la tinción robusto de proteínas totales con un fondo reducido.
Además, la mancha de plata fluorescente demostró una buena gama dinámica lineal para la cuantificación de la proteína, que es comparable con la tinción SYPRO Ruby ampliamente utilizado y no alcanzables con manchas de plata tradicionales. El gel puede ser reflejado en el gel comúnmente usado sistemas de documentación con una lámpara ultravioleta (longitud de onda de excitación: canal de 302/365 nm, emisión: ~ 490-530 nm) en muchos laboratorios biológicos.

<table><tbody><tr><td> Tampón de muestra LDS (4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td> 4-12% Gel de proteína Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Gel prefabricado</td></tr><tr><td>Agente reductor de muestras (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>MES SDS Tampón de funcionamiento (20X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Mini tanque de gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de 300 W (230 VCA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Equipo Escalera de proteínas sin manchar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Muestra</td></tr><tr><td>Nitrato</td><td>de plata Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Bragg and co.</td><td>42520J</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Milli-Q Síntesis A10</td><td></td><td></td> <td>Merk-Proporciona 18.2 M&Omega;. </td></tr><tr><td>Sistema de documentación de gel de agua cm (modelo C600)</td><td>Azure biosystems-Equipment</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Tinción de plata es una técnica colorimétrica ampliamente utilizada para visualizar las bandas de proteínas en geles de poliacrilamida siguiendo la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE). Las manchas de plata clásico tienen ciertos inconvenientes, como fondo alta coloración, recuperación de proteína pobre, baja reproducibilidad, un estrecho rango dinámico lineal de cuantificación y la compatibilidad limitada con espectrometría de masas (MS). Ahora, con el uso de una sonda de Ag+ fluorógenos, TPE-4TA, hemos desarrollado un método para la visualización total de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. Esta nueva mancha evita el paso de reducción plata molestas manchas de plata tradicional. Además, la tinción fluorescente de plata demuestra buena reproducibilidad, sensibilidad y cuantificación lineal de detección de la proteína, lo que es una mancha de gel de proteína útil y práctico.

Las bandas de proteínas teñidas por el tinte plata fluorescente presentan una intensa fluorescencia verde bajo una lámpara de UV 365 nm. Todas las bandas de proteína 14 (10-200 kDa), de arriba hacia abajo, eran claramente visibles, correlacionan bien con los 14 color rojo teñido por el tinte (figura 2) SYPRO Ruby del10.
Detección cuantitativa de la proteína, los geles fueron ...

Aquí, describimos un protocolo detallado que un fluorescente nuevo coloración técnica para la detección de la proteína total en geles de poliacrilamida. El protocolo utiliza una sonda de encendido plata de iones específicos de fluorescencia que detecta Ag+-complejos de proteínas y elimina ciertas limitaciones de manchas plata cromogénicos tradicionales.

Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Este es un novedoso método de tinción de gel que utiliza una sonda de plata fluorogénica para convertir la tinción tradicional de plata en una mancha de plata fluorescente. Este método mostró un rendimiento mejorado en comparación con la tinción convencional de nitrato de plata y la tinción de rubí SYPRO mientras se utiliza un protocolo simple y sencillo sin aldehídos. Demostrar el procedimiento estará Alex Wong, un asistente de investigación de mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, diluya las muestras de proteínas con una solución que contenga agua destilada, tampón SUD y un agente reductor de muestras. Configure un mini tanque de gel lleno de tampón MES para realizar SDS-PAGE con un gel proteico 4-12%Bis-Tris. Cargue los pozos con la muestra de proteína preparada, luego ejecute el gel a una tensión constante de 200 voltios durante 30 minutos.Después de la electroforesis, sumerja el gel en una solución de 100 mililitros que contenga etanol y ácido acético en un agitador orbital e incubar dos veces durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se agita a 50 rpm. A continuación, lave el gel tres veces con agua ultrapura en un recipiente limpio con cada lavado que dure 10 minutos. En primer lugar, disolver 0,01 gramos de nitrato de plata en 10 mililitros de agua ultrapura para preparar una solución de stock con una concentración de 0,1% Añadir 100 microlitros de la solución de stock en 100 mililitros de agua ultrapura para hacer la solución de trabajo de nitrato de plata.En una campana de humo, sumerja el gel en 100 mililitros de la solución de trabajo de nitrato de plata en una cámara de vidrio sellada. Utilice papel de aluminio para proteger el gel de la luz durante la impregnación e incubar durante una hora mientras agita a 50 rpm en un agitador orbital. Después de esto, lave el gel dos veces con agua ultrapura en un recipiente limpio, con cada lavado con aproximadamente 100 mililitros de agua y con una duración de 60 segundos.Es importante utilizar agua ultrapura para limpiar el gel después del paso de impregnación de plata para minimizar la tinción de fondo. Primero, agregue 50 mililitros de agua ultrapura a tres miligramos de tinte TPE-4TA. Sonicar la solución durante tres minutos y añadir cinco microlitros de solución de hidróxido de sodio de un molar entre cada sesión de sonicación para ayudar a disolver el tinte, por lo general hasta tres veces.A continuación, compruebe la fluorescencia de la solución bajo una lámpara UV de 365 nanómetros para asegurarse de que el tinte está completamente disuelto. Sólo las soluciones débiles o no emisivas indican la disolución completa. Para preparar la solución de desarrollo fluorogénico, añada 10 mililitros de la solución de stock TPE-4TA a 90 mililitros de agua ultrapura.Utilice un medidor de pH para comprobar el pH de la solución. Ajuste la solución a un pH entre 7 y 9, utilizando solución diluida de hidróxido de sodio o ácido acético si el pH está fuera de alcance. A continuación, transfiera el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mililitros de la solución de desarrollo fluorogénico y asegúrese de que el gel esté completamente sumergido.Selle el recipiente y cúbralo para protegerlo de la luz. Agitar el recipiente durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm y a temperatura ambiente. Transfiera el gel a un recipiente limpio y deténgalo en 100 mililitros de 10% de etanol durante 30 minutos.A continuación, enjuague el gel en agua ultrapura durante cinco minutos. El gel se puede visualizar en un transilluminador de sobremesa o visualizarse en una máquina de documentación de gel en el canal de 365 nanómetros o en el canal de 302 nanómetros. En este estudio, se utiliza un novedoso método de tinción de plata fluorescente para manchar proteínas en geles de poliacrilamida.Las bandas de proteínas teñidas por la mancha de plata fluorescente exhiben un verde intenso bajo una lámpara UV de 365 nanómetros. Las 14 bandas de proteínas son claramente visibles y se correlacionan bien con las bandas de color rojo teñidas por el tinte SYPRO Ruby. Este método de tinción de plata fluorescente parece tener una alta resolución.Para algunas bandas de proteínas, la sensibilidad de la mancha de plata fluorescente también es ligeramente mejor que la de la mancha fluorescente SYPRO Ruby. En particular, se mejora el rendimiento de esta mancha para las bandas de proteínas entre 10 y 40 kilodaltones, lo que indica que el nuevo método es particularmente útil para la detección de proteínas con un bajo peso molecular. Como se puede ver, los datos también sugieren que la mancha de plata fluorescente da una buena y uniforme linealidad para las 14 proteínas en una gama relativamente amplia de cuantificación de proteínas.Mientras que la mancha de nitrato de plata dio un alto nivel de señal de fondo y picos distorsionados, la mancha de plata fluorescente detectó las bandas con buen contraste y distribución de intensidad uniforme comparable a la mancha SYPRO Ruby en las 14 proteínas. Los pasos de lavado son importantes, ya que limitan la solución de fijación residual de interrumpir la impregnación de plata o el desarrollo fluorogénico. Cuando utilice nitrato de plata, evite el contacto con la piel.Limpie los derrames inmediatamente. Use ropa y guantes de protección y deseche como residuos químicos.

fluorescent-silver-staining-of-proteins-in-polyacrylamide-gels

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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