Name: Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Öğrenin, poliakrilamid jellerdeki proteinleri florojenik gümüş probu kullanarak boyamak için bu yeni floresan yöntemi. Geleneksel gümüş nitrat boyamaya göre gelişmiş duyarlılık sunar ve düşük moleküler ağırlıklı proteinleri tespit etmek için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No 2017-06344) destek için minnettar olduğunu.

1. hazırlık jel
Not: Gösteri jel sonra kısa bir süre12SDS-sayfa boyama için hazırlamak için standart bir protokol izler. Kısaca, aşağıdaki adımları örnekleri hazırlanması tarif ve Elektroforez jel.
<ol><li>SDS-sayfa % 4 - % 12 Bis-Tris protein jelleri (1 mm, 15-şey) ile gerçekleştirmek bir mini jel tankı kullanarak dolu ile 2-(N -morpholino) ethanesulfonic asit (MES) arabellek.</li>
	<li>Distile su, lityum Lauryl Sülfat (LDS) arabellek ve örnek azaltma Ajan karışımı ile örnekleri sulandırmak.</li>
	<li>Ardından normal stok tutarı (5 µL) ve bundan sonra iki kat dilutions hisse senedi (8192 x 2 x 13 dilutions) bir dizi ilk yol, iki katına stok (10 µL) yükleyin.</li>
	<li>Jel 30 dk için 200 V sabit voltaj çalıştırın.</li>
</ol>2. jel fiksasyonu
<ol><li>Elektroforez sonra 50 RPM (her biri için 30 dk) x 2 oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 100 mL solüsyon % 40 ethanol/10% Asetik asit jelleri daldırın</li>
	<li>Jelleri 3 x 10 dk her ultrasaf su temiz bir kap içinde yıkayın. Çamaşır, kritik bir adımdır. Sabitleme çözümden asit içinde belgili tanımlık fluorogenic gelişmekte olan adım düzgün kaldırılmaz ise aşırı TPE-4TA asit tarafından etkinleştirilecek ve güçlü arka plan Floresans jel içinde yol.</li>
</ol>3. hazırlık AgNO3Çözüm ve jel gümüş emprenye
<ol><li>AgNO3 çözüm (%0,0001) yapmak emprenye için ilk olarak, AgNO3 10 mL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm hazırlamak için ultrasaf su 0,01 g geçiyoruz. Sonra 100 µL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm çalışma çözüm yapmak için ultrasaf su 100 mL ekleyin. Not: Kullanmadan önce karanlıkta AgNO3 çözüm saklanmalıdır.</li>
	<li>Jel 100 mL 50 RPM mühürlü cam kap içinde bir orbital Çalkalayıcı 1 h için çözüm üzerinde gümüş ile hamile. Gümüş emprenye ışık alüminyum folyo ile korunan bir duman başlık altında gerçekleştirmek için önemlidir.</li>
	<li>2 x 60 için temiz bir kapta jel ultrasaf su (yaklaşık 100 mL) ile yıkayın s.</li>
</ol>4. Fluorogenic geliştirme jel
<ol><li>Boya stok çözüm (0,1 mM) hazırlamak TPE-4TA boya 3.0 mg 50 mL ultrasaf su ekleyin. Bir kaç dakikalığına çözüm solüsyon içeren temizleyicide ve boya dağıtılması yardımcı olmak için bazı NaOH çözüm (örneğin 1 M) ekleyin.</li>
	<li>Boya molekül tamamen tasfiye edilir emin olmak için 365 nm UV lambanın altında çözüm Floresans denetleyin. Yalnızca zayıf veya nonemissive çözümleri tam çözülme belirtir. Not: TPE-4TA yapıldı boya protokol son zamanlarda Xie vd tarafından rapor aşağıdaki sentezledim. 10 TPE-4TA çözüm çok kararlı ve karanlıkta aylarca tutulabilir.</li>
	<li>100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi (10 µM) hazırlamak ultrasaf su 90 mL 10 mL TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin. PH metre kullanarak çözüm pH kontrol ve 7-9 sodyum hidroksit çözüm (1 µM) kullanmaya ayarlamak.</li>
	<li>Jel 100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi ile temiz ve yapışmalı konteyner aktarın. Jel tamamen çözümde dalmış olduğundan emin olun. Konteyner mühür. Işıktan yap da gecede 50 RPM oda sıcaklığında bir orbital Çalkalayıcı üzerinde salla. Alternatif olarak, kuluçka adım da yaklaşık ~ 2 h AIE gelişmekte olan çözüm ile 80 ° C arasında boyama ve sonra oda sıcaklığında bırakarak için ön ısıtma ile kısaltılabilir.</li>
</ol>5. destaining ve görüntüleme
<ol><li>Temiz bir kaba jel transfer ve 100 ml % 10 etanol için 30 dk destain. Not: Jel yıkamak için su tek başına kullanılabilir. Ancak, daha zaman destaining için % 10 etanol çözümü kullanmak verimli olur. Bu destaining işlem için 30 dk dan itibaren azaltmak için yardımcı olur.</li>
	<li>Ultrasaf su 5 min için jel durulayın.</li>
	<li>Görüntü 365 nm kanal veya 302 nm kanal bir jel dokümantasyon makine tarafından jel.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Bu floresan gümüş boyama üzerinde bir patent başvurusu şikayetçi oldu.

Burada sunulan bir roman floresan gümüş yöntemi polyacrylamide jeller proteinler için boyama. Bu strateji geleneksel gümüş lekeleri ve floresan lekeleri bütünleştirir. Proteinlere olduğu gibi diğer gümüş gümüş iyonu seçmeli bağlama lekeleri ama son derece hassas fluorogenic gümüş kullanır boyama patlatır gümüş ilişkili proteinler kadar ışık için TPE-4TA sonda. Fluorogenic sonda TPE-4TA oldukça düşük konsantrasyon nanomolar Aralık11, gümüş iyonları hissi olabilir b...

Birçok boyama yöntemi Jel Elektroforez takip, örneğin Coomassie parlak mavi, gümüş leke, Floresans gibi Renkölçer boya kullanarak proteinler görselleştirmek için kullanılan veya radyoaktif1,2, etiketleme olmuştur 3 , 4. gümüş boyama olarak kabul edilir en hassas teknikleri için basit ve ucuz reaktifler gerektiren protein algılama biri olmak. İki büyük aile sınıflandırılabilir:5,6ammoniacal gümüş leke ve gümüş nitrat leke. Alkali ammoniacal gümüş yönteminde, gümüş-diamin karmaşık amonyak ve sodyum hidroksit ile üretilen ve metalik gümüşe asidik formaldehit çözümünü kullanarak geliştirme sırasında düşük. Leke temel proteinler için verimli bir şekilde karşılar ama asidik ve tarafsız proteinler için güvenliği aşılan bir performansı gösterir ve ayrıca, klasik glisin ve taurin elektroforetik sistemleri için sınırlı olduğunu. Buna karşılık, gümüş nitrat lekeleri yüksek biyo-benzeşme protein gümüş iyonların yararlanmak, öncelikle sulfhydryl ve karboksil grupları yan zincirlerinden ve asidik protein daha verimli bir şekilde leke eğilimi7. Bağlama gümüş iyonu sonra (genellikle formaldehit ve sodyum tiyosülfat içeren metal karbonat çözeltisi imal) gelişmekte olan bir çözüm görselleştirmek için bir kahverengi koyu rengi inşa Metalik Gümüş tahıl için gümüş iyonları azaltmak için uygulanır protein bantları.
Gümüş boyama gelişimi 1970'li yıllarda8beri onun çok yönlü ve yüksek hassasiyet için bilinen olmasına rağmen yöntem sık kadar zor kabul edilir. Gümüş boyama yöntemleri zaman sınırlı adımlar ve düşük tekrarlanabilirlik göster. Gümüş leke rengi genellikle tek tip ve kontrol etmek zordur, azaltma adım bağımlı olmadığından gümüş leke nicel bir yöntem değildir ve böylece, jel karşılaştırma çalışma ve protein miktar9için tavsiye edilmez. Duyarlılık içinde en iyi duruma getirilmiş yöntemleri de10boyama daha fazla üniforma sağlayabilir aldehitler yararlanmak olabilir. Ancak, daha fazla akış aşağı analiz protein aldehitler tarafından polietilenin nedeniyle pahasına bu. Hızlı iletişim kuralları çoğunlukla birleştirmek ya da uzlaşma tekrarlanabilirlik ve leke5tekdüzelik süresini kısaltmak için adımları kısaltabilirsiniz. Sonuç olarak, orada çok sayıda gümüş türevleri içinde protein jel, her belirli gereksinimleri uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş boyama boyama; Örneğin, basitlik, duyarlılık veya peptid kurtarma oranı için aşağı akım analizi. Bu öznitelikler de birbirlerine bir etkiye sahip ve bir iletişim kuralı tüm gereksinimlerinin karşılanması zor olabilir.
Bu çalışmada, biz yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jel protein algılama için tanıtmak. Bu yöntemde, bir fluorogenic sonda gümüş iyonları, TPE-4TA (şekil 1), gümüş emdirilmiş proteinler11görselleştirmek için kullanıyoruz. TPE-4TA toplama kaynaklı emisyon (AIE) ilke tarafından tasarlanmıştır. Bu sigara-sulu çözüm içinde çözünmüş zaman yayıcı ama gümüş iyonlarının varlığında son derece yayıcı. Geleneksel gümüş lekeleri chromogenic geliştirilmesinde adım gelişen bir fluorogenic ile değiştirerek, floresan gümüş yöntemi azaltılmış bir arka plan ile toplam proteinlerin sağlam boyama sağlar.
Ayrıca, floresan gümüş leke için yaygın olarak kullanılan SYPRO Ruby leke ile karşılaştırılabilir ve geleneksel gümüş lekeleri ile ulaşılabilir protein miktar iyi dinamik bir doğrusal Aralık gösterdi. Jel bir ultraviyole lamba ile sık kullanılan jel dokümantasyon sistemleri üzerinde yansıma (uyarma dalga boyu: 302/365 nm kanal; emisyon: ~ 490-530 nm) birçok biyolojik laboratuarlarında.

<table><tbody><tr><td> LDS Numune Tamponu (4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td> %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 kuyulu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Prekast jel</td></tr><tr><td>Numune Azaltıcı Ajan (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>MES SDS Koşu Tamponu (20X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Mini Jel Tankı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>300W Güç Kaynağı (230 VAC)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Lekesiz Protein Merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Örnek</td></tr><tr><td>Gümüş nitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Bragg ve diğerleri.</td><td>42520J</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Milli-Q Sentezi A10</td><td></td> Merk-18.2 <td></td><td>M & Omega Sağlar; cm su</td></tr><tr><td>jeli dokümantasyon sistemi (c600 model)</td><td>Azure biosystems-Equipment</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

floresan gümüş polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag+ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.

Tarafından floresan gümüş leke lekeli protein bantları 365 nm UV lambası altında yoğun bir yeşil Floresans sergi. Bütün 14 protein grupları (10-200 kDa), yukarıdan aşağıya doğru açıkça görülebilir, iyi tarafından SYPRO Ruby boya (Şekil 2)10lekeli 14 kırmızı renkli olanlar ile birleştiriliyor.
İle ilgili nicel protein algılama, jelleri görüntüleme sistemi otomatik yordamları k...

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Bu floresan gümüş boyama içine geleneksel gümüş boyama dönüştürmek için bir florojenik gümüş prob kullanan yeni bir jel boyama yöntemidir. Bu yöntem, aldehitler olmadan basit ve basit bir protokol kullanırken geleneksel gümüş nitrat boyama ve SYPRO Yakut boyama ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş performans gösterdi. Prosedürü gösteren Alex Wong, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı olacak.Bu prosedürü başlatmak için, distile su, LDS tampon ve bir örnek leyici ajan içeren bir çözelti ile protein örnekleri seyreltin. 4-12% Bis-Tris protein jeli ile SDS-PAGE gerçekleştirmek için MES tampon ile dolu bir mini jel tankı ayarlayın. Hazırlanan protein örneği ile kuyular yükleyin, sonra 30 dakika boyunca 200 volt sabit bir voltajda jel çalıştırın.Elektroforezden sonra, jeli orbital shaker üzerinde etanol ve asetik asit içeren 100 mililitrelik bir çözeltiye batırın ve 50 rpm'de sallayarak oda sıcaklığında 30'er dakika boyunca iki kez kuluçkaya yatırın. Daha sonra jeli 10 dakika süren her yıkama ile temiz bir kapta ultra saf suile üç kez yıkayın. İlk olarak, 0,01 gram gümüş nitratı 10 mililitre ultrasaf suda çözünerek %0,1 konsantrasyona sahip bir stok çözeltisi hazırlayın gümüş nitrat çalışma çözümünü yapmak için 100 mililitre ultrasaf suya 100 mikrolitre stok çözeltisi ekleyin.Bir duman başlık, mühürlü bir cam odasında gümüş nitrat çalışma çözeltisi 100 mililitre jel batırın. Bir orbital shaker üzerinde 50 rpm sallayarak bir saat boyunca emprenye ve kuluçka sırasında ışık jel korumak için alüminyum folyo kullanın. Bundan sonra, her yıkama yaklaşık 100 mililitre su kullanarak ve 60 saniye süren temiz bir kapta ultra saf su ile jel iki kez yıkayın.Bu arka plan boyama en aza indirmek için gümüş emprenye adım sonra jel temizlemek için ultrasaf su kullanmak önemlidir. İlk olarak, tpe-4TA boya üç miligram ultrasaf su 50 mililitre ekleyin. Çözeltiyi üç dakika sonicate ve boya çözünmeye yardımcı olmak için her sonication oturumu arasında tek molar sodyum hidroksit çözeltisi beş mikrolitre ekleyin, genellikle üç kez.Daha sonra boyanın tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltinin floresansını 365 nanometrelik uv lambası altında kontrol edin. Sadece zayıf ya da emissive olmayan çözümler tam çözünme gösterir. Florojenik geliştirme solüsyonu hazırlamak için, 90 mililitre ultra saf suya 10 mililitre TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin.Çözeltinin pH'ını kontrol etmek için bir pH ölçer kullanın. PH kapsama alanı dışında ise seyreltilmiş sodyum hidroksit çözeltisi veya asetik asit kullanarak 7 ile 9 arasında bir pH çözeltisini ayarlayın. Daha sonra jeli 100 mililitre florojenik gelişen çözeltiile temiz ve sızdırmaz bir kaba aktarın ve jelin tamamen batırDığından emin olun.Kabı kapatın ve ışıktan korumak için üzerini kapatın. 50 rpm ve oda sıcaklığında bir yörünge shaker bir gecede konteyner çalkalayın. Jeli temiz bir kapta aktarın ve 100 mililitrelik 10 000 mililitre etanolde 30 dakika boyunca destain.Daha sonra jeli ultra saf suda beş dakika durulayın. Jel bir tezgah transilluminator üzerinde görselleştirilmiş veya 365 nanometre kanal veya 302 nanometre kanal bir jel dokümantasyon makinesinde görüntülenebilir. Bu çalışmada poliakrilamid jellerde proteinleri lekelemek için yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi kullanılmıştır.Floresan gümüş lekesi ile boyanmış protein bantları 365 nanometreLIK UV lambasının altında yoğun bir yeşillik sergiler. Tüm 14 protein bantları açıkça görülebilir ve sypro Ruby boya ile boyanmış kırmızı renkli bantları ile iyi korelasyon. Bu floresan gümüş boyama yöntemi yüksek çözünürlüğe sahip gibi görünüyor.Bazı protein bantları için floresan gümüş lekesinin hassasiyeti de floresan SYPRO Ruby lekesinden biraz daha iyidir. Özellikle bu lekenin performansı 10 ila 40 kilodalton arasındaki protein bantları için geliştirilmiştir, bu da yeni yöntemin düşük molekül ağırlığına sahip proteinlerin tespiti için özellikle yararlı olduğunu gösterir. Görüldüğü gibi, veriler aynı zamanda floresan gümüş leke protein nicelik nispeten geniş bir yelpazede tüm 14 proteinler için iyi ve tekdüzelik verdiğini göstermektedir.Gümüş nitrat lekesi yüksek düzeyde arka plan sinyali ve bozuk zirveler verirken, floresan gümüş lekesi 14 proteinin tüminde SYPRO Ruby lekesi ile karşılaştırılabilecek iyi kontrast ve tek tip yoğunluk dağılımına sahip bantları tespit etti. Yıkama adımları, artık fiksasyon çözümcünün gümüşemprenyesini veya florojenik gelişimi bozmasını sınırlaştırdığı için önemlidir. Gümüş nitrat kullanırken, cilt temasından kaçının.Dökülmeleri hemen temizleyin. Koruyucu giysi ve eldiven giyin ve kimyasal atık olarak atın.

fluorescent-silver-staining-of-proteins-in-polyacrylamide-gels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

, Jel proteinlerin elektroforetik yöntemlerle ayrılması ardından çeşitli boyama yöntemleri ile tespit edilebilir. Coomassie Mavi, Gümüş Boyama, SYPRO Turuncu, SYPRO Ruby ile proteinlerin Boyama Bu video gösterilmektedir.

Jeller içinde Proteinler Boyama

Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek...

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Bu videoda, florojenik problar kullanarak toplam proteinin görselleştirilmesi için poliakrilamid jellerin gümüş boyama yöntemini gösteriyoruz.

Floresan Gümüş Boyama: Poliakrilamid Jellerdeki Toplam Proteini Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, sülfatlanmış glikozaminoglikan oligosakkarit fragmanlarının kombine Alcian mavisi ve gümüş boyaması için bir prosedür gösteriyoruz. Bu kombine boyama tekniği, poliakrilamid jellerdeki farklı uzunluklardaki glikozaminoglikan polimerlerinin bantlarını önemli ölçüde çoğaltır.

Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Gümüş Boyanması: Poliakrilamid Jellerde Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Görselleştirilmesi İçin Bir Boyama Yöntemi

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Öğrenin, poliakrilamid jellerdeki proteinleri florojenik gümüş probu kullanarak boyamak için bu yeni floresan yöntemi. Geleneksel gümüş nitrat boyamaya göre gelişmiş duyarlılık sunar ve düşük moleküler ağırlıklı proteinleri tespit etmek için idealdir.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Daha fazla video keşfet