Name: 基于细菌选择和生长的盘状细胞基因工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学习利用细菌选择和生长进行盘状细胞基因工程的方法，适用于Dictyostelium discoideum多种菌株的电穿孔转染。该技术快速高效，可在两天内通过显微镜验证结果，为细胞生物学和遗传操作研究提供可靠工具。

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作者感谢 Kay 实验室对本方法提供的建议，以及 MRC 分子生物学实验室（LMB）显微镜和流式细胞术平台提供的出色科研与技术支持。本研究由以下基金资助：医学研究理事会（MRC）资助项目 MC_U105115237（授予 R. R. Kay），生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）资助项目 BB/K009699/1（授予 R. R. Kay），癌症研究英国（Cancer Research UK）资助项目 A15672（授予 R. H. Insall），惠康基金会（Wellcome Trust）高级研究员项目 202867/Z/16/Z（授予 Jonathan R Chubb），以及医学研究理事会（MRC）对伦敦大学学院（UCL）MRC LMCB 大学研究单位的资助（MC_U12266B）。

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<li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis%2C+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li>
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作者声明无利益冲突。

目前，非无菌型野生型Dictyostelium细胞在分子生物学研究中的应用非常有限。现有针对这些菌株的基因工程方法缺乏可靠性和效率23，从而阻碍了其广泛采用。本文所提供的材料和方案可适用于任何D. discoideum菌株，无论其是否能够在液体培养基中生长。需要指出的是，本方案已针对NC4来源的细胞系进行了优化。如我们此前观察到的，并在本文中对V12M2和WS2162菌株所示，从自然界新近分离的菌株其转染效率与NC4存在差异8,9。电穿孔条件似乎尤其显著影响转染效率，某些菌株可能需要进一步优化该条件。总体而言，在迄今为止测试的所有菌株中均观察到了足够数量的转染子，表明这些方法切实可行。使用NC4来源菌株获得的阳性转染子数量高于其他非无菌型野生型菌株，但在所有情况下，所获得的转染子数量均足以支持后续实验。加之本方案操作简便，相较于早期尝试8,9，这是主要的改进之处。
这些新的非无菌培养方案涵盖了所有标准的遗传学操作，并具有额外优势，因为转染可以快速且高效地并行进行。由于在细菌上培养使细胞分裂时间缩短一半，因此可在数天内而非数周内获得阳性克隆。新建立的质粒在无菌条件下同样有效，可常规用于两种培养条件，这是该方法的另一项进步22。如本方案所述，用于细菌上筛选的质粒具有特殊要求，这对转染成功至关重要。特别是驱动表达盒和抗性盒的启动子，对转染的成功尤为关键。常用于驱动抗性或表达盒的act6（肌动蛋白6）启动子24，在细胞于细菌上生长时效率较低。在我们的质粒系统中，所有表达盒均由高活性的act15（肌动蛋白15）启动子驱动，而抗性盒则由coA（协同肌动蛋白A）启动子控制；这两个启动子在无菌条件下以及在细菌上培养的细胞中均具有活性。由于报告基因构建体、基因敲入和基因敲除构建体的表达要求，必须使用我们这一系列的质粒，但遗憾的是，这也限制了已有的、使用低效act6启动子的载体的应用。
启动子效率对于依赖单次整合至正确基因组位点的转染尤为关键。由于我们改进了驱动抗性基因表达的启动子，单一位点整合即可产生足够的抗性蛋白。此前有报道称，在使用潮霉素或G418进行筛选时，可能会偏好基因组中的多次整合事件，这是本方法的一个主要关注点。然而，迄今为止并未观察到这种对多次整合的偏好，这与之前使用较老启动子系统进行G418筛选的结果一致25。这意味着潮霉素和G418均适合作为获得干净的基因敲除和基因敲入的可筛选标记。遗憾的是，筛选标记杀稻瘟菌素（blasticidin）在非无菌条件下无法发挥作用。这是本方法的一个主要缺点，因为在 D. discoideum 中，杀稻瘟菌素抗性盒通常被用于构建基因敲除载体。已使用杀稻瘟菌素抗性盒构建的载体需重新构建，并改用其他可行的可筛选标记。克服这一限制的另一种可能策略是将近期建立的无菌型 D. discoideum CRISPR 技术与本转染方案相结合26。设计和制备合适的单导向RNA（sgRNA）比重建完整的基因敲除载体更为简便快捷。未来的发展方向中，将CRISPR/Cas9技术与本转染方案结合以实现多重基因敲除具有吸引力，可能为黏菌（Dictyostelium）研究领域众多科研人员开辟新的路径。然而，需谨慎评估目前用于无菌培养细胞中CRISPR/Cas9的瞬时表达系统在此方案中的适用性。
act5 基因敲入系统为在 D. discoideum 中建立稳定细胞系提供了一种可靠且安全的整合系统，并具有与其他生物中已建立的类似位点相兼容的优势22。该系统依赖于基因组中的单次整合事件，可为多种研究方向提供广泛的应用可能。act5 启动子具有强活性，能够在不同培养条件下实现近乎均一的基因表达27。利用设计好的靶向质粒，可将荧光报告蛋白轻松整合至这一安全位点。例如，在本文展示的混合实验中，该特性可用于细胞示踪研究。细胞间的表达变异性极低，有助于实现自动化的细胞追踪。重要的是，目标序列插入 act5 位点后表现为表型中性28,29。由于蛋白表达不依赖于筛选标记来维持，与随机整合或携带附加体质粒的细胞系不同，act5 系统也可适用于基因功能回补实验。此外，由于细胞系具有高度均一性，所有细胞均可用于分析，而使用附加体质粒进行表达时则存在显著的表达异质性，无法实现全面分析。
除了对所有菌株的这些总体改进之外，利用非无菌型野生型细胞进行分子研究的能力，使得研究人员能够评估当前实验室菌株中累积突变所带来的影响。自1970年采用Ax2菌株以来，已发现存在多次基因重排，此前发表的微阵列分析结果已证实了这一点26。由于这些突变的存在，出现了合成表型。例如，有报道指出，phg2突变体在一种实验室菌株背景下表现出黏附能力下降，而在另一种背景下则表现出黏附能力增强3。此类相互矛盾的数据现在可以通过在共同祖先菌株（本例中为DdB）中重复实验得以解决。该方法的优势最近在小GTP酶RasS的研究中已得到证实30,31。
在任何D. discoideum菌株中进行遗传实验的能力，拓展了依赖野生分离株的新研究方向的潜力，特别是涉及社会进化、亲缘识别以及有性循环的研究22。

Dictyostelium 属是生活在土壤中的社会性变形虫，主要以细菌为食。该属属于变形虫门（Amoebozoa），已分离出大量物种，可归为四个不同的进化枝1。Dictyostelium discoideum（D. discoideum）已成为研究细胞迁移和吞噬作用等复杂细胞过程的常用模式生物。为了控制和标准化实验条件，已开发出可在无细菌条件下于复杂或定义明确的液体培养基中生长的无菌细胞系2。其中尤为重要的是 Ax2、Ax3 和 Ax4 菌株，它们均于 20 世纪 70 年代构建，最终均源自单一野生型分离株 NC43。这些无菌菌株中已建立了基因工程工具，并于 1987 年首次发表基因敲除成果4,5。相关实验方案也进一步发展并优化，适用于无菌培养条件下的操作6,7。
多个实验室已尝试将这些方案应用于无法在液体培养基中生长的野生型 D. discoideum 菌株。然而，由于转染方案本身复杂且效率低下，部分原因在于细菌可作为选择性试剂的“汇”而发挥作用，因此该尝试尚未完全成功8,9。结果导致，目前几乎所有关于 D. discoideum 的分子生物学数据均来源于单一野生型分离株的后代。我们希望克服这一局限性，开发一种不依赖细胞在液体培养基中生长能力的 D. discoideum 遗传修饰方法。该方法的必要性可通过以下观察加以说明：过去人们曾认为，允许无菌生长的突变在很大程度上是中性的，不会影响细胞生理功能。这一假设仅部分成立。通常存在两个显著差异：其一，存在于不同分离的无菌型菌株之间；其二，当这些无菌型菌株与非无菌型的野生分离株进行比较时8,9。
或许最关键的因素是最近被鉴定为RasGAP NF1的关键无菌系基因axeB。NF1作为RasGAP的主要功能是抑制Ras活性3。在所有无菌系中该酶的缺失会导致Ras活性过度增强，表现为形成较大的活性Ras斑块。这些扩大的Ras斑块导致PIP3在质膜上积累。PIP3与活性Ras共定位的斑块构成了环形皱褶的形成模板，最终环形皱褶闭合，形成巨胞饮体10。其结果是巨胞饮活性显著增强。巨胞饮是一种由肌动蛋白驱动的过程。细胞骨架组分在巨胞饮体或伪足形成之间的分配因而产生竞争。这种竞争对细胞行为的影响表现为营养期细胞向叶酸趋化几乎完全被抑制11。这些显著增大的PIP3斑块具有很强的持续性。即使在饥饿状态的细胞中，PIP3斑块仍然存在，并可能被误认为是伪足，这会给cAMP趋化研究的解读带来困难。
在某些情况下，NF1 基因突变具有实验上的实用性。这促使我们提出开发一种用于细菌培养的 D. discoideum 细胞转染方法的第二个动机，因为巨胞饮速率的提高使得无菌培养细胞在研究该过程基本机制方面具有重要价值12。然而，巨胞饮相关基因（如 Ras 和 PI3-激酶）的突变几乎完全阻断了无菌生长，因此有必要通过在细菌上培养的方式来操作这些细胞10。另一个使基于细菌的转染方法具有价值的原因是，近年来越来越多地利用盘基网柄菌类（Dictyostelids）来研究多细胞生物进化13,14、亲缘识别15,16以及细胞利他行为等科学问题，而这些研究主要依赖于新近分离的野生型菌株17。上述所有研究领域均可得益于高效的野生型分离株遗传操作方法，而这些菌株通常非无菌生长，且不能在液体培养基中生长。
我们的实验方案能够克服上述局限性。综合来看，在细菌培养的 D. discoideum 细胞中进行遗传操作的可能性为所有 Dictyostelium 研究人员带来了益处，即使这种优势仅体现在由于变形虫在细菌培养基上生长速度更快（倍增时间为4小时），相较于在无菌培养基中生长（倍增时间为10小时），筛选过程得以显著加快。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微型离心机 5424/5424R</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>05-400-002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5702R 离心机配备 A-4-38 型转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12823252</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mastercycler Nexus 梯度PCR仪</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP6331000025</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser X 细胞电穿孔仪（含 CE 认证） &amp;和 PC 模块</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>安全柜 Foruna - SCANLAF</td><td>Labogene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基 &amp;琼脂糖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo 培养基</td><td>Formedium</td><td>LF0501</td><td></td></tr><tr><td>Seakem GTG 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td></td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖</td><td>BioGene</td><td>300-200</td><td></td></tr><tr><td>纯化琼脂</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>SM 培养基</td><td>福麦迪亚</td><td>SMB0102</td><td></td></tr><tr><td>2x LB 肉汤</td><td>Formedium</td><td>LBD0102</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA凝胶染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 游离酸</td><td>Sigma Aldrich/Merck</td><td>391340 EMD</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>10028-24-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2 * &lt;/sub&gt;6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich/Merck</td><td>5982 EMD</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>442909</td><td></td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>VWR</td><td>26668.263</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板，平底，低蒸发盖，组织培养处理</td><td>康宁公司</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板，平底带盖，组织培养处理</td><td>康宁公司</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 组织培养皿，经组织培养处理</td><td>康宁公司</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 玻璃底微孔培养皿 No1.5</td><td>MatTek Corporation</td><td>P50G-1.5-30-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗生素&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素G418硫酸盐</td><td>Gibco（生命技术公司）</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;附加耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mm 间隙电穿孔比色皿，长电极</td><td>Geneflow Limited</td><td>E6-0062</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 型接种环，蓝色，10 微升</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>129399</td><td></td></tr><tr><td>L形无菌涂布棒</td><td>Greiner Bio-One</td><td>730190</td><td></td></tr><tr><td>Combitips advanced 5 mL</td><td>Eppendorf BIOPUR</td><td>30089669</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZR 质粒小提经典试剂盒</td><td>Zymoresearch</td><td>D4016</td><td></td></tr><tr><td>快速DNA小提中试剂盒</td><td>Zymoresearch</td><td>D3025</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean DNA 回收试剂盒</td><td>Zymoresearch</td><td>D40002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 2X 标准缓冲液预混液</td><td>NEB</td><td>M0482L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA聚合酶</td><td>TakaraBio</td><td>R045A</td><td></td></tr></tbody></table>

基于细菌筛选与培养的dictyostelium discoideum细胞基因工程改造

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum 是研究发育过程中细胞分化、细胞信号传导及其他重要细胞生物学问题的一种引人入胜的模式生物。目前可用于遗传操作 Dictyostelium 细胞的技术已相当成熟，可通过不同的可筛选标记及标记回收方法进行转染，包括同源重组和插入突变。这些技术得益于基因组具有良好的注释信息。然而，这些方法主要针对在液体培养基中生长的无菌细胞系进行优化，难以应用于仅以细菌为食的非无菌野生型细胞。无菌品系中存在的突变会干扰 Ras 信号通路，导致为摄食所需的巨胞饮作用过度活跃，并损害细胞迁移能力，从而影响对这些品系中信号转导和趋化性实验结果的解释。此前对非无菌细胞进行遗传操作的尝试效率低下，且需要复杂的实验流程。我们开发了一种简便的转染方案，首次克服了这些限制。这一系列对 Dictyostelium 分子遗传学的重大改进，使得野生型细胞的遗传操作变得与标准实验室品系一样简便。除了有利于研究未受干扰的信号传导和运动过程外，现在还可以方便地分离出破坏巨胞饮依赖性生长的突变体。此外，整个转染流程大大加快，重组细胞可在数天内获得，而非数周。另一优势在于，可直接对从自然环境中新近分离的野生型 Dictyostelium 样本进行分子遗传学操作。这有助于拓展这些研究领域中所采用方法的应用范围。

染色体外质粒可用于报告基因研究，旨在确定特定蛋白质在细胞内的定位，或突变细胞中细胞结构的变化。对于许多研究方法而言，例如细胞周期监测，同时表达两种报告基因至关重要。利用我们的双报告基因染色体外质粒系统，这一目标现已能够实现。表1。第1天，在转染5小时后加入筛选标记G418（图1）。在本示例中，NC4、DdB、Ax2 以及独立获得的野生分离株 V12M2 和 WS2162（补充表1) 转染了编码GFP-TubulinA（微管标记物）和mCherry-PCNA（用于监测细胞周期的蛋白）的质粒pPI289，图2A。32小时后，在显微镜下观察细胞。大多数细胞均表达了两种荧光标记的融合蛋白，这与以往报道一致：当两种报告蛋白来自同一质粒时，其表达水平相似；而若使用两种不同的质粒，则几乎无法实现这种一致性表达18,19每种细胞系（NC4、DdB、Ax2、V12M2 和 WS2162）中表达目标双报告基因的代表性细胞如图所示 图2B转染效率总结如下 图2CNC4 来源的细胞系表现出最佳的转染效率。然而，在 V12M2 和 WS2162 细胞系中也获得了相当高数量的转染细胞。
<img alt="质粒图谱、荧光显微镜图像、柱状图；细胞中的GFP-微管蛋白和mCherry-PCNA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：附加体质粒的表达。（A）附加体质粒以环状形式直接转染。例如，展示了双报告基因质粒pPI289。其中的NgoMIV位点表示将第二个报告基因插入到附加体表达质粒中的位置。（B）表达GFP-TubulinA（胞质）和mCherry-PCNA（主要位于细胞核）的代表性细胞的Z轴投影图像，所用五种野生型细胞系分别为NC4、DdB、Ax2、V12M2和WS2162。（C）根据（B）中所示的五种细胞系计算其转染效率。数据表示两次实验的平均值，误差条表示±标准差（SD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
将靶向载体整合到特定基因组位点更具挑战性，需要对所获得的细胞系进行更细致的分析。在图3中，尝试在NC4中实现act5-mCherry基因敲入（KI）。首先，质粒必须线性化，以提高转染后同源重组事件的发生频率。为此，使用NgoMIV酶对质粒pDM1514进行酶切。在琼脂糖凝胶电泳后可观察到两条条带。其中4127 bp的条带包含所需构建片段（图3）。进行转染前，需从凝胶中回收并纯化酶切后的DNA，可使用凝胶回收试剂盒，并按照制造商提供的说明进行操作。
<img alt="质粒图谱、酶切位点、凝胶电泳图、DNA分析、NgoMIV消化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：act5 基因敲入质粒的制备及转染用DNA的准备。 展示了一个将act5基因敲入质粒pDM1514中的示例。制备步骤如下：（A）在电穿孔前，使用所示的NgoMIV酶切位点将质粒线性化。（B, C）将酶切后的质粒在琼脂糖凝胶上电泳，直至两条预期条带完全分离；切下含有同源重组臂、mCherry及抗性盒的4127 bp条带，并从凝胶中回收DNA。此时DNA已可用于转染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
纯化的DNA用于转染NC4细胞。经过5-6天的筛选后，获得克隆。代表性转染效率及多个阳性鉴定克隆的数量 act5 敲入实验尝试的总结见于 表3. 随机选取两个NC4转染克隆，通过PCR进行分析（图4A），两者均显示出预期的敲入带型，并通过Southern印迹分析进一步验证，以确认载体在基因组中为单一位点整合事件20印迹显示在目标位点有清晰的单一位点整合 act5 位点（图4B）。生成的 NC4::act5-mCherry 细胞系现在可用于实验。
<img alt="act5 基因编辑敲入；包含凝胶电泳和DNA条带大小分析的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：在NC4中对act5-mCherry敲入（KI）的验证。 （A）用于验证act5位点阳性整合的方案及对照PCR。使用所示引物分析两个独立克隆及其亲本株系。两个克隆均显示出抗性盒以及下游（P1）或上游引物（P2）对应的预期条带，而这些条带在亲本株系中不存在。引物组合（P1/P2）证实了mCherry和抗性盒正确整合至act5位点。野生型NC4显示预期的2800 bp条带，而两个KI克隆均缺失该条带，并出现一个约大1400个碱基对的PCR产物。（B）所用限制性酶切与Southern印迹分析示意图。两个敲入克隆均显示出较小的3400 bp条带，这是由于构建体整合至act5位点所致，具体原因是潮霉素抗性盒中额外引入的BclI位点。野生型对照则显示出预期的5.8 kb条带，来源于两个位于下游的BclI位点。该印迹图经裁剪和拼接以提高清晰度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶向整合至 act5 位点的构建体</td>
			<td>质粒名称</td>
			<td>占用孔数</td>
			<td>检测克隆数</td>
			<td>阳性克隆数</td>
			<td>正确克隆 (%)</td>
			<td>使用的盘基网柄菌菌株</td>
			<td>转染效率（转化子/2×10⁶/1 µg DNA）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55.5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3×10⁻⁵</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1×10⁻⁴</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85.7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5×10⁻⁶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91.6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2×10⁻⁴</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6×10⁻⁴</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：在不同菌株背景下生成act5 基因敲入（KIs）时的转染效率及获得的阳性转染子数量22。
act5 位点能够实现整合报告基因相对均一的表达21。所构建的 NC4::act5-mCherry 细胞可用于与其他使用不同荧光蛋白（如 GFP）的 act5 基因敲入细胞进行混合实验。为突出该系统的重要优势，本文展示了与 Ax2::act5-GFP 细胞的混合实验结果。由于无法对非无菌型野生型细胞进行转染，此类实验此前难以开展。混合实验是分析细胞行为的重要工具，因为它允许在完全相同的实验条件下对不同细胞系进行直接比较。NC4 细胞在细菌菌苔上的生长速度高于 Ax2 细胞（图 5A）。这可能归因于其更强的吞噬细菌能力，或更高效的运动性及向食物源趋化的能力。通过琼脂下叶酸趋化实验，直接比较了 NC4::act5-mCherry 与 Ax2::act5-GFP 细胞群体，结果显示 NC4::act5-mCherry 细胞在叶酸感知方面效率显著更高。培养 4 小时后，成功迁移至琼脂糖下方的 NC4::act5-mCherry 细胞数量多于 Ax2::act5-GFP 细胞（图 5B）。对在琼脂糖下迁移细胞的趋化性常规指标进行分析表明，NC4::act5-mCherry 细胞的迁移速度更快，且趋化反应强度显著强于 Ax2::act5-GFP 细胞（图 5C-E）。
<img alt="斑块分析结果；柱状图、散点图、细胞显微镜图像；趋化性向叶酸分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：使用 行为基于图像的趋化混合实验的5个关键指标。 (A) NC4::act5-mCherry 和 Ax2::act5-GFP 表达指定的荧光蛋白 行为5个位点被分析在细菌菌苔上的生长能力。4天后，由单个接种形成的噬菌斑直径 盘基网柄菌 细胞被测量。非无菌 act5::NC4 细胞产生的噬斑明显大于无菌培养的细胞 Ax2::act5-GFP 细胞（均值 ± 标准差，***p &lt; 0.0001，n = 3，比例尺 5 mm。 (B用于琼脂糖下叶酸趋化试验22 直接比较趋化能力的 NC4::act5-mCherry 和 Ax2::act5-GFP 在（A）中使用的实验条件下，将两种菌株的细菌培养阿米巴进行50:50混合。让细胞在琼脂糖下爬行。4小时后，使用共聚焦显微镜对沿叶酸梯度迁移的细胞进行成像。迁移细胞的数量 NC4::act5-mCherry 和 Ax2::act5-GFP 细胞数量随后被确定。 NC4::act5-mCherry 细胞对叶酸的感知效率更高，大约高出10倍 NC4::act5-mCherry 与……相比，细胞数量被发现 Ax2::act5-GFP 细胞（均值 ± 标准差，***p &lt; 0.0001，n = 6，比例尺 100 µm). (C，D细胞被拍摄60分钟，并计算其迁移速度和趋化指数。在预先筛选出趋化反应最强的细胞后（仅包含在琼脂糖下方发生迁移的细胞）， Ax2::act5-GFP 细胞在细胞迁移速度和趋化性两个指标上均表现出较低的数值。每种细胞系分析了50个细胞。（中位数 ± 标准差，*p &lt; 0.01，n = 3）。(E）轨迹的 NC4::act5-mCherry 和 Ax2::act5-GFPact5次敲入在60分钟内的运动轨迹显示，细胞向趋化因子源的方向性移动更为明显 NC4::act5-mCherry 细胞（中位数 ± 标准差，***p &lt; 0.0001，n = 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
act5 基因敲入细胞系也可用于流式细胞术分析。与在细菌上生长的情况类似，无菌株系与非无菌野生型之间在发育过程中存在显著差异。发育完成后，NC4 细胞形成的子实体大小约为 Ax2 细胞来源子实体的两倍。若将两种细胞混合，则形成大小介于两者之间的子实体。为了更定量地分析两种细胞系的贡献比例，采用了流式细胞术。这些分析结果明确表明，中等大小的子实体是由于两种细胞系贡献水平不同所致。在检测到的孢子中，NC4::act5-mCherry 细胞约占 75%，而 Ax2::act5-GFP 细胞仅占 25%，揭示了非无菌株系可能具有发育适应性优势（图 6）。由于该分析未监测柄细胞群体，因此对于 Ax2 与 NC4 之间发育不平衡的现象存在两种可能解释：一种可能是 Ax2 细胞主要参与形成柄细胞群体，而较少进入孢子细胞群体；另一种可能是更多的 NC4 细胞进入发育周期，而 Ax2 细胞相对延迟，因而无法有效参与子实体的构建。对非无菌野生型细胞进行转染的可能性，进一步拓展了研究手段，并显著简化了实验流程。
<img alt="荧光蛋白分析；在孢子形成实验中使用GFP和mCherry；包括显微镜观察和数据图表结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：Act5 KIs 可用于通过流式细胞术分析混合实验。（A）NC4::act5-mCherry 和 Ax2::act5-GFP 分别单独培养或以50:50比例混合后在无营养琼脂平板上发育。NC4::act5-mCherry 细胞形成的子实体大于 Ax2::act5-GFP 细胞，而混合培养的子实体大小介于两者之间（比例尺为5 mm）。共聚焦荧光显微镜观察表明，来自混合培养的孢子头中 NC4::act5-mCherry 的孢子数量较多。（B）为定量验证该现象，采用流式细胞术分析了（A）中混合实验收获的孢子头中的孢子含量。约75%的孢子来源于 NC4::act5-mCherry 细胞，仅25%来源于 Ax2::act5-GFP 细胞。（C）流式细胞术散点图展示了两种细胞系孢子的代表性分布。约0.05%的孢子同时显示mCherry和GFP阳性信号，提示可能发生准性融合过程或孢子相互粘连。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞系</td>
			<td>遗传背景</td>
			<td>参考编号</td>
			<td>先前发表</td>
			<td>类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>act5::mCherry Clone 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 基因敲入</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>act5::GFP Clone 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 基因敲入</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
补充表1：研究的不同Dictyostelium菌株。

Dictyostelium discoideum 是研究细胞迁移、内吞作用和发育等复杂细胞过程的常用模式生物。该生物的应用依赖于其遗传操作的可行性。本文介绍了一种转染 Dictyostelium discoideum 细胞的方法，克服了在液体培养基中培养细胞的现有局限性。

基于细菌筛选与培养的Dictyostelium discoideum细胞基因工程改造

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是研究发育过程中细胞分化、细胞信号转导及其他相关过程的一种引人入胜的模式生物。

本方案的价值在于，它几乎允许对任意黏菌株（dictyostelium discoideum）进行分子遗传学操作，无论该菌株是否能在液体培养基中无菌培养。该技术的另一优势在于快速且简便。在开始混合黏菌之前，先转染细胞以导入游离型质粒。转染后两天即可通过显微镜观察验证结果。使用盘基网柄菌细胞与细菌悬液进行实验较为特殊，可视化过程将有助于实验人员了解各实验步骤的具体操作方式。与我共同演示该实验步骤的是我实验室的博士后 Soudabeh Imanikia。首先，根据文本方案，配制含有氯化镁和氯化钙的 1000 毫升索伦森缓冲液工作液。随后，用一单菌落的产气克雷伯菌（K aerogenes）接种一升 LB 培养基。将细菌在37摄氏度下振荡培养过夜。将菌液分装至两个500毫升离心管中，离心收集菌体。随后用500毫升缓冲液洗涤细菌一次。将沉淀重悬于20毫升缓冲液中。使用光度计检测样品的光密度，并用缓冲液稀释样品，直至光密度约为100。随后，根据文本方案配制H40电穿孔缓冲液。在室温下于SM培养基中过夜培养产气克雷伯菌至汇合状态。取400微升细菌悬液加入SM琼脂平板，均匀涂布。然后用无菌接种环挑取黏菌细胞，并在平板的一侧边缘接种并涂布细胞。将培养板在 22 摄氏度下孵育两天，以确保生长区域足够大，便于转染。向一个 10 厘米经组织培养处理的培养皿中加入 10 毫升 K. aerogenes 菌悬液。然后，使用 10 微升一次性接种环从培养板的生长区域刮取细胞。将细胞转移至含有预冷H40缓冲液的1.5毫升离心管中，在10000 ×g条件下离心2秒。随后弃去上清液，并将细胞重悬于H40缓冲液中。接下来，将100微升细胞加入含有1至2微克DNA的离心管中。用移液器吹打混匀，然后将细胞与DNA的混合物转移至预冷的电穿孔比色皿中。DNA用量不得超过2微克。较高的DNA浓度对细胞具有毒性，会降低转染效率。电穿孔后，立即将细胞转移至预先准备好的10厘米培养皿中，让细胞恢复5小时。为了筛选敲除、敲入或act five敲入的转染细胞，通过在培养皿表面吹打液体使细胞脱离。 然后，根据文本方案配制选择剂的三种稀释液。最后，将150 µL已配制好的稀释液分别加入96孔平底组织培养板的每个孔中。本方案中展示了一种双报告基因染色体外质粒系统。转染后32小时，大多数细胞均表达两种荧光标记的融合蛋白。同时尝试了act five M cherry基因敲入和NC4实验。将消化产物在琼脂糖凝胶电泳后，获得了两条条带。4127 bp 的条带包含目的构建体。纯化的 DNA 用于转染 NC4 细胞。通过 PCR 分析了两株 NC4 转染克隆，两者均显示出预期的条带模式。随后使用Southern印迹法验证PCR结果。NC4在细菌菌苔上的生长速度比Ax2细胞更快。四小时后，能够爬行穿过琼脂糖的NC4细胞数量多于Ax2细胞。NC4 细胞比 Ax2 细胞移动更快，且对叶酸的趋化反应更强。务必使用新近接种的 SM 平板上的细胞。切勿使用超过四天的细胞，否则效率会下降。新分离的、非扩展性的白色 HAP 菌株常用于研究盘基网柄菌的聚集或社会行为。我们的方法允许通过这些分离株应用分子遗传学技术。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基于细菌选择和生长的盘状细胞基因工程

利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis...

利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

本文演示了一种针对特定目标序列构建随机突变文库的简单方案。我们展示了该方法如何在大肠杆菌（Escherichia...

在 E. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

来源：Paschke, P., 等. 基因工程 盘基网柄菌 基于细菌筛选与生长的细胞研究。J. Vis. Exp.

通过电穿孔法转染野生型阿米巴并辅以细菌喂养

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。...

通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

C. elegans 通常在接种了 E. coli 的固体琼脂平板或液体培养基中培养。为了防止细菌代谢产物对毒理学和营养学研究造成干扰，我们采用了一种无菌液体培养基...

培养 秀丽隐杆线虫 在无菌液体培养基中培养及通过微粒轰击法创建转基因蠕虫

抗应激能力是长寿的标志性特征之一，已知其受遗传因素调控。在此，我们开发了一种无偏倚的高通量方法，用于筛选赋予胚胎干细胞抗应激能力的突变，从而建立用于长寿研究的小鼠模型。...

利用正向遗传学方法揭示小鼠应激抗性基因——在胚胎干细胞中进行的高通量筛选

社会性变形虫Dictyostelium discoideum最近已被确立为研究蛋白质错误折叠和蛋白质稳态的模型系统。本文中，我们描述了一种基于成像的新方法，用于研究温度诱导的蛋白质聚集以及D.

使用温度控制的活细胞成像研究 D. discoideum 的蛋白质质量控制系统

本文介绍了一系列用于开发工程化细胞和功能化表面的实验方案，这些方案能够使合成工程化的大肠杆菌（E.

利用合成生物学构建可与可编程材料相互作用的活细胞

本文描述了评估细胞对急性机械刺激反应的方法。在基于显微镜的检测中，我们通过短暂的剪切流刺激后，观察荧光标记的生物传感器的定位变化。此外，我们还通过生物化学方法检测多种目标蛋白在急性机械刺激下的激活情况。...

Dictyostelium discoideum 对急性机械刺激反应的评估

该方法可用于从任意二倍体品系产生四倍体和三倍体Caenorhabditis线虫。通过该方法产生的多倍体品系已被用于研究减数分裂前期的染色体相互作用，且该方法适用于探究细胞生物学、发育生物学、进化生物学和癌症生物学中的重要基础问题。...

Caenorhabditis elegans 中倍性的操控

学习利用细菌选择和生长进行盘状细胞基因工程的方法，适用于Dictyostelium discoideum多种菌株的电穿孔转染。该技术快速高效，可在两天内通过显微镜验证结果，为细胞生物学和遗传操作研究提供可靠工具。

基于细菌筛选与培养的Dictyostelium discoideum细胞基因工程改造

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