Genetics
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利用 niper-cas9 在不损失目标活动的情况下通过定向进化, 最大限度地减少 crispr-cas9 的非目标效应
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Summary February 26th, 2019
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在这里, 我们提出了一个优化 crispr-cas9 的协议, 以实现更高的特异性, 而不会丢失目标活动。我们使用一种称为狙击手屏幕的定向进化方法来查找具有所需特征的突变 cas9。sanicper-cas9 与截断的单导轨 rna 兼容, 并以核糖核酸蛋白格式交付, 这是实现更高特性的著名策略。
Transcript
在自然界中，Cas9是一种免疫蛋白，可抵御入侵病毒，进化后更喜欢具有混杂特异性的Cas9，这种特异性可以通过自发突变切割病毒DNA。我们构建了一个人工定向进化系统，它更喜欢具有高特异性的优化的Cas9变种。负选择和正面选择在狙击手筛查系统中同时工作。
Cas9 具有减少的目标活动，还可以同时筛选具有减少目标活动以及保持目标活动。随机引入整个Cas9序列的突变，以生成要筛选的库。这使得在意外位置找到突变成为可能。
目前，许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。但是，Y 型 Cas9 的特异性未得到优化，这可能导致紧密包装。在人类中，这意味着随机基因的意外突变，这可能导致严重的副作用。
有许多Cas9像酶，这是正在开发的治疗。我们的技术可用于提高其他DNA和核的特异性，如吉平格，泰国和Cas9也如CPF1。使库足够大是增加获得具有重要功能的变体的可能性的关键。
确保冷却步骤效率高，并使用高效称职的电池。为了开始这个程序，添加一个CCDB质粒和SGRNA质粒的南图，双不匹配到解冻的BW25141 GOI细胞的50微升。通过移液轻轻混合细胞，并将它们转移到预冷却的0.1厘米电穿孔盒中。
通过电穿孔将大肠杆菌与两个质粒进行转化。电穿孔完成后，立即添加250微升S、SOC介质。轻轻移液溶液，混合细胞和介质，将混合物转移到1.5毫升微离心管中。
恢复转化的细胞，并在32摄氏度下孵育，轻轻摇晃一小时。继续准备文本协议中概述的 Snyper 筛选单元。当准备执行 Snyper 筛选时，使用前面描述的 elctropation 过程，将 Snyper 筛选细胞与每个库中准备好的 Cas9 变种质粒的 100 纳米图进行转换。
然后，将250微升细胞转移到一个新鲜的1.5毫升微离心管。将 250 个 ATC 象形图添加到每毫升 10 毫微克的最终浓度中。在32摄氏度下用轻轻的震动孵育一小时，恢复含 ATC 和 ATC 无 ATC 的细胞。
在含有氯霉素和卡纳霉素的LB汞板上回收无 ATC 细胞的板 25 微升。将 ATC 添加到回收的 ATC 中，在 245 毫米 LB 的汞板上，最终浓度为每毫升 100 毫微克。立即将含 ATC 的细胞板镀在含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的 LB 碳中。
在32摄氏度下孵育所有板过夜。第二天，拍下盘子。使用开放式 CFU 软件，计算可行菌落的数量，确保非选择性板上的菌落数量至少比库的多样性大十倍，以涵盖所有变体。
从所有三个库中拉出在选择性板块上幸存下来的殖民地。将这些池菌落转移到250毫升的LB介质中，辅以氯霉素，并在42摄氏度下孵育过夜。首先，加载 Cas OF Finder 软件以选取目标站点。
选择适用于特定类型的 Cas9 和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择不匹配的数字，然后单击提交按钮。
几秒钟后，将出现目标站点和目标外站点。通常，选择一到三个不匹配的离目标站点。接下来，订购具有模板序列的CRRNA和轨道RRNA寡，并放大文本协议中概述的模板。
在2%的加糖凝胶上分析放大模板DNA的两微升，然后净化模板。在37摄氏度下孵育反应混合物过夜。第二天，加入0.5微升DNAse，在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后净化SGRNA。
然后，在100个单位的RNAse抑制剂存在的情况下，用250个单位的小牛肠道碱性磷酸酶治疗10微克的体外转录RNA，在3摄氏度下进行3小时，然后净化经过的SGRNA。首先，在DMEM中保持 HEK293 T 细胞，在 37 摄氏度下辅以 10%FBS 和 1% 抗生素，辅以 5% 的二氧化碳。接下来，将野生型或Snyper Cas9蛋白的两微克与两微克的SGRNA混合，并在室温下孵育十分钟，使RNP复合物。
trypsin化和计数细胞，然后洗涤它们，并在电穿孔缓冲液中准备，如文本协议中所述。使用 1300 伏特的脉冲将 RNP 复合物电化到电池中，间隔 30 毫秒。电穿孔后立即将细胞板放在一个48孔的板上，板上装满了500微升的DMEM，并辅以10%FBS和1%抗生素。
在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。在 DMEM 中保持 HEK293 T 细胞，并在 37 摄氏度下以 10% FBS 和 1% 抗生素补充 5%二氧化碳。转染前一天，对细胞进行三试和计数。
如果工作在48井规模，板10，000细胞每井和250微升的完整生长介质。使用基于脂质的转染试剂，准备250纳米的P3S Cas9质粒和250纳米的SGRNA转染。然后，将质粒混合在25微升无血清 MEM 中。
用25微升无血清 MEM 稀释一微升转染试剂。在室温下孵育这种混合物五分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物结合，在室内孵育20分钟，形成质粒脂质胺复合物。
在此之后，将这种混合物的50微升直接添加到每个含有细胞的井中。轻轻摇动板来回混合。在转染后48至72小时，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞，然后进行转基因表达检测。
在隔离先前准备的基因组DNA后，通过GDNA的PCR扩增生成深度测序库，并基于目标和非靶点。然后，使用索引底注标记每个样本。使用下一代测序机使池库具有配对的端排序。
执行 Snyper 屏幕后，可以通过将选择性 LB 板上的菌落数除以非选择性 LB 板上的菌落数来计算生存菌落的百分比。虽然使用 SP Cas9 的库执行此百分比通常非常低，但可以通过使用幸存的池重复屏幕来丰富真正的正命中数。具有代表性的 Snyper 屏幕显示，在第三个屏幕之后，获得 100% 的存活率。
使用 RNP 或质粒编码的 Snyper Cas9 进行转染，可针对各种目标进行，并可对目标安培康测序进行目标上和目标外活动测量。在大多数目标，Snyper Cas9 显示的目标活动水平和更高的特异性比相比野生类型。截断的 SGRNA 也可用于进一步提高特异性。
在第一个清洁步骤中，更高的转换效率非常重要，不要丢失具有高特异性的克隆。以后的筛选步骤重复的转换效率较低，因为克隆在第一个筛选步骤中已经丰富，并且丢失克隆的可能性较小。在 Snyper 屏幕中，我们将发现多个克隆。
这些克隆的目标和非目标活动应在尽可能多的不同目标中进行描述，以选择具有最佳性能的克隆。通过这种方法，科学家可以提高Cas9样酶的特异性，而不会损失目标活性。此外，科学家不需要事先了解蛋白质的结构来改进。
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