Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution

I naturen er Cas9 et immunprotein mod invaderende vira, som evolution foretrækker Cas9 med promiskuøs specificitet, som kan kløve viralt DNA med spontane mutationer. Vi byggede et kunstigt styret evolutionssystem, som foretrækker en optimeret Cas9-variant med høj specificitet. Både negative og positive valg fungerer samtidigt i Sniper Screening System.

Cas9 varianter med reduceret off-target aktivitet også opretholde on-target aktivitet kan screenes på én gang. Mutationer blev indført på hele Cas9 sekvens tilfældigt at producere biblioteket, der skal screenes. Og det gjorde det muligt at finde mutationer i uventede positioner.

I øjeblikket er mange forskere i den akademiske verden og industrien bruger Y-type Cas9 for terapeutisk udvikling. Specificiteten af Y-type Cas9 er dog ikke optimeret, hvilket kan resultere i tætpakket. Hos mennesker betyder dette uventede mutationer i tilfældige gener, hvilket kan føre til alvorlige bivirkninger.

Der er mange Cas9 lignende enzymer, som er ved at blive udviklet i terapeutiske. Vores teknik kan bruges til at forbedre specificiteten af andre DNA og nukleider som Jipinger, Thailand og Cas9 også såsom CPF1. At gøre et bibliotek stort nok er nøglen til at øge mulighederne for at få en variant med vigtig funktion.

Sørg for at få en høj effektivitet i køletrinnet, og brug højeffektive kompetente celler. For at starte denne procedure, tilsættes et nanogram af både CCDB plasmid og SGRNA plasmid med dobbelt mismatch i halvtreds mikroliter af optøede BW25141 GOI celler. Bland forsigtigt cellerne ved pipettering, og overføre dem til en forkølet, 0,1 centimeter elektroporation cuvette.

Omdan E-coli med de to plasmider via elektroporation. Umiddelbart efter elektroporationen er afsluttet, tilsættes 250 mikroliter SOC-medie. Forsigtigt pipette opløsningen til at blande celler og medium, og overføre blandingen til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.

Gendan de transformerede celler og inkuber dem ved 32 grader Celsius, med blid omrystning i en time. Fortsæt med at forberede Snyper-screeningscellerne som beskrevet i tekstprotokollen. Når du er klar til at udføre Snyper screening, omdanne Snyper screening celler med 100 nanogram af den forberedte Cas9 variant plasmider fra hvert bibliotek ved hjælp af elctroporation proces, der tidligere blev beskrevet.

Overfør derefter 250 mikroliter af cellerne til et friskt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Der tilsættes 250 picogrammer af ATC til en endelig koncentration på 10 nanogram pr. milliliter. Gendan både de ATC-holdige og ATC-frie celler ved at inkubere dem ved 32 grader Celsius i en time med let omrystning.

Plade 25 mikroliter af de genvundne ATC-frie celler på en LB agar plade, der indeholder chloramphenicol og kanamycin. Der tilsættes ATC til den genvundne ATC, der indeholder celler, til en endelig koncentration på 100 nanogram pr. milliliter på en 245 millimeter LB agarplade. Straks plade de ATC-holdige celler på en LB agar indeholdende plade indeholdende chloramphenicol, kanamycin, og arabinose.

Inkuber alle plader natten over ved 32 grader Celsius. Den næste dag, fotografere pladerne. Ved hjælp af den åbne CFU-software skal du tælle antallet af levedygtige kolonier og sikre, at antallet af kolonier på den ikke-selektive plade er mindst ti gange større end bibliotekets mangfoldighed, så det dækker alle varianter.

Træk kolonier, der overlevede på de selektive plader fra alle tre biblioteker. Overfør disse samlede kolonier til 250 milliliter LB medium, suppleret med chloramphenicol, og inkubere natten over ved 42 grader Celsius. Først skal du indlæse Cas OF Finder software til at vælge mål websteder.

Vælg den PAM-type, der passer til den specifikke type Cas9 og målgenomet. Udfyld fanen forespørgselssekvenser. Vælg uoverensstemmelsesnummeret, og klik på knappen Send.

Efter et par sekunder vises webstederne på mål og uden for målet. Generelt skal du vælge de steder uden for målet med et til tre uoverensstemmelser. Bestil derefter CRRNA og Track RRNA-oligos med skabelonsekvenser, og forstærke skabelonen som beskrevet i tekstprotokollen.

Analysér to mikroliter af det forstærkede skabelon-DNA på en 2%agarosegel, og rengør derefter skabelonen. Inkuber reaktionsblandingen natten over ved 37 grader Celsius. Den næste dag, tilsæt 0,5 mikroliter af DNAse og inkubere ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter, og derefter rense SGRNA.

Derefter behandles 10 mikrogram af in vitro transskriberede RNA med 250 enheder af kalv intestinal alkalisk fosfatase i tre timer ved 3 grader Celsius, i nærvær af 100 enheder af RNAse-hæmmer, og derefter rense den behandlede SGRNA. Først skal hek293 T-celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Dernæst blandes to mikrogram af enten vild type eller Snyper Cas9 protein med to mikrogram SGRNA, og inkuberes ved stuetemperatur i ti minutter for at lave RNP-komplekser.

Trypsinize og tælle cellerne, derefter vaske dem og forberede dem i elektroporation buffer som skitseret i tekstprotokollen. Elektroporate RNP-komplekserne ind i cellerne ved hjælp af en puls på 1300 volt i 30 millisekunder. Umiddelbart efter elektroporationen plade cellerne på en 48-brønd plade fyldt med 500 mikroliter dmem, suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika.

Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Vedligehold HEK293 T-celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Dagen før transfektion, trypsinize og tælle cellerne.

Hvis du arbejder på en 48-brønd skala, plade 10, 000 celler pr brønd og 250 mikroliter af komplet vækstmedium. Ved hjælp af et lipidbaseret transinfektionsreagage, klargør 250 nanogram P3S Cas9 plasmid og 250 nanogram SGRNA til transinfektion. Derefter blandes plasmiderne i 25 mikroliter af serumfri MEM.

En mikroliter af transfektionsreage hos transfektionsreage hos 25 mikroliter serumfri MEM. Inkuber denne blanding ved stuetemperatur i fem minutter. Kombiner plasmid blandingen med transfektion reagens blandingen og inkubere på plads i 20 minutter til at danne plasmid lipofectamin komplekser.

Efter dette, tilsæt 50 mikroliter af denne blanding direkte til hver brønd, der indeholder celler. Ryd forsigtigt pladen frem og tilbage for at blande. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator i 48 til 72 timer efter transfektion, før der analyseres for trans-genekspression.

Efter isolering af den tidligere forberedte genomiske DNA, generere dybe sekventering biblioteker ved PCR forstærkning af GDNA med primere målretning på mål og off-target. Brug derefter indeksprimere til at mærke hvert eksempel. Brug en næste generations sekvenseringsmaskine til at udsætte puljebibliotekerne for parrede endesekseventering.

Når Snyper-skærmen er udført, kan procentdelen af overlevelseskoloner beregnes ved at dividere antallet af kolonier på den selektive LB-plade med antallet af kolonier på den ikke-selektive LB-plade. Mens denne procentdel er normalt meget lav, når de udføres med biblioteker af SP Cas9, kan sande positive hits beriges ved at gentage skærmen med den overlevende pulje. En repræsentativ Snyper skærm viser en 100% overlevelsesrate er opnået efter den tredje skærm.

Transfekt ved hjælp af RNPs eller plasmid kodet Snyper Cas9 kan gøres for forskellige mål, og den deraf følgende on-target og off-target aktiviteter målt ved mål amplicon sekventering. På de fleste mål, viser Snyper Cas9 det samme niveau af på målaktiviteter og højere specificitet nøgletal i forhold til den vilde type. Afkortede SGRNA’er kan også bruges til yderligere at forbedre specificiteten.

Højere transformationseffektivitet i det første rengøringstrin er meget vigtigt ikke at miste klonerne med høj specificitet. Senere screening skridt igen gentage mindre transformation effektivitet, da klonerne allerede er beriget i den første screening skridt, og der er mindre chance for at miste dem. Der vil være mere end én klon, som vi fandt i Snyper skærm.

Disse kloners on-target- og off-target-aktiviteter bør karakteriseres i så mange forskellige mål som muligt for at udvælge kloner med den bedste ydeevne. Med denne metode, forskere kan forbedre specificiteten af Cas9-lignende enzymer uden tab af on-target aktivitet. Desuden har forskerne ikke brug for nogen forudgående viden om strukturen af proteinet til at foretage forbedringer.