Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon

I naturen er Cas9 et immunprotein mot invaderende virus som evolusjon foretrekker Cas9 med promiskuøs spesifisitet som kan cleave viral DNA med spontane mutasjoner. Vi bygget et kunstig rettet evolusjonssystem som foretrekker en optimalisert Cas9-variant med høy spesifisitet. Både negative og positive valg fungerer samtidig i Sniper Screening System.

Cas9-varianter med redusert off-target aktivitet som også opprettholder aktivitet på mål, kan screenes samtidig. Mutasjoner ble introdusert på hele Cas9-sekvensen tilfeldig for å produsere biblioteket som skal screenes. Og dette gjorde det mulig å finne mutasjoner i uventede stillinger.

For tiden bruker mange forskere i akademia og industri Y-type Cas9 for terapeutisk utvikling. Spesifisiteten til Y-type Cas9 er imidlertid ikke optimalisert, noe som kan resultere i tett pakket. Hos mennesker betyr dette uventede mutasjoner i tilfeldige gener, noe som kan føre til alvorlige bivirkninger.

Det er mange Cas9 som enzymer som utvikles i terapeutiske midler. Vår teknikk kan brukes til å forbedre spesifisitet av andre DNA og nukleider som Jipinger, Thailand, og Cas9 også som CPF1. Å gjøre et bibliotek stort nok er nøkkelen til å øke mulighetene for å få en variant med viktig funksjon.

Sørg for å få høy effektivitet i kjøletrinnet, og bruk svært effektive kompetente celler. For å begynne denne prosedyren, legg til ett nanogram av både CCDB plasmid og SGRNA plasmid med doble uoverensstemmelser i femti mikroliter av tinte BW25141 GOI-celler. Bland forsiktig cellene ved å pipettering, og overfør dem til en forkjølet, 0,1 centimeter elektroporasjonscuvette.

Forvandle E-coli med de to plasmidene via elektroporasjon. Umiddelbart etter at elektroporasjonen er fullført, tilsett 250 mikroliter SOC-medium. Rør forsiktig løsningen for å blande cellene og mediet, og overfør blandingen til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.

Gjenopprett de forvandlede cellene og inkuber dem ved 32 grader Celsius, med mild risting i en time. Fortsett å forberede Snyper screening celler som beskrevet i tekstprotokollen. Når du er klar til å utføre Snyper screening, forvandle Snyper screening celler med 100 nanograms av forberedt Cas9 variant plasmids fra hvert bibliotek ved hjelp av elctroporation prosessen som tidligere ble beskrevet.

Deretter overfører du 250 mikroliter av cellene til et friskt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Tilsett 250 picograms ATC til en endelig konsentrasjon på 10 nanogram per milliliter. Gjenopprett både ATC-inneholdende og ATC-frie celler ved å inkubere dem ved 32 grader Celsius i en time med mild risting.

Plate 25 mikroliter av de gjenvunnede ATC-frie cellene på en LB agar plate, som inneholder kloramfenikol og kanamycin. Legg ATC til den gjenopprettede ATC som inneholder celler til en endelig konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter på en 245 millimeter LB agar plate. Umiddelbart plate ATC-inneholdende celler på en LB agar som inneholder plate som inneholder kloramfenikol, kanamycin, og arabinose.

Inkuber alle tallerkener over natten ved 32 grader Celsius. Neste dag, fotografer platene. Ved hjelp av den åpne CFU-programvaren teller du antall levedyktige kolonier, og sørger for at antall kolonier på den ikke-selektive platen er minst ti ganger større enn mangfoldet i biblioteket, for å dekke alle varianter.

Trekk koloniene som overlevde på de selektive platene fra alle tre bibliotekene. Overfør disse samlede koloniene til 250 milliliter LB medium, supplert med kloramfenikol, og inkuber over natten ved 42 grader Celsius. Først laster du inn Cas OF finder-programvaren for å velge målnettsteder.

Velg PAM-typen som passer for den bestemte typen Cas9 og målgenomet. Fyll ut kategorien spørringssekvenser. Velg nummeret som ikke samsvarer, og klikk på Send-knappen.

Etter noen sekunder vises nettstedene på mål og utenfor mål. Generelt velger du off-target nettsteder med en til tre uoverensstemmelser. Deretter bestiller du CRRNA og Spor RRNA oligos med malsekvenser og forsterker malen som beskrevet i tekstprotokollen.

Analyser to mikroliter av den forsterkede malen DNA, på en 2% agarose gel og rens deretter malen. Inkuber reaksjonsblandingen over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag, legg til 0,5 mikroliter dnase og inkuber ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter, og rens deretter SGRNA.

Deretter behandler 10 mikrogram av in-vitro transkribert RNA med 250 enheter kalv intestinal alkalisk fosfatase i tre timer ved 3 grader Celsius, i nærvær av 100 enheter RNAse hemmer, og deretter rense den behandlede SGRNA. Først opprettholde HEK293 T celler i DMEM supplert med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Deretter blander du to mikrogram enten villtype eller Snyper Cas9-protein med to mikrogram SGRNA, og inkuberer ved romtemperatur i ti minutter for å lage RNP-komplekser.

Prøvpsinize og telle cellene, deretter vaske dem og forberede dem i elektroporasjon buffer som beskrevet i tekstprotokollen. Elektroporate RNP komplekser inn i cellene ved hjelp av en puls på 1300 volt for 30 millisekunder. Umiddelbart etter elektroporasjonen, plate cellene på en 48-brønns plate fylt med 500 mikroliter DMEM, supplert med 10% FBS og 1% antibiotika.

Inkuber ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Vedlikehold HEK293 T-celler i DMEM supplert med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Dagen før transfection, trypsinize og telle cellene.

Hvis du arbeider på en 48-brønns skala, plate 10, 000 celler per brønn og 250 mikroliter med komplett vekstmedium. Ved hjelp av en lipidbasert transfeksjonsreagens, klargjør du 250 nanogram p3S Cas9 plasmid og 250 nanogram sgrna for transfeksjon. Bland deretter plasmidene i 25 mikroliter serumfri MEM.

Fortynn en mikroliter transfeksjonsreagens med 25 mikroliter serumfri MEM. Inkuber denne blandingen ved romtemperatur i fem minutter. Kombiner plasmidblandingen med transfection reagensblandingen og inkuber på rommet i 20 minutter for å danne plasmid lipofectamine komplekser.

Etter dette legger du til 50 mikroliter av denne blandingen direkte til hver brønn som inneholder celler. Rock platen forsiktig frem og tilbake for å blande. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator i 48 til 72 timer etter transfeksjon, før analyse for transgenuttrykk.

Etter å ha isolert det tidligere forberedte genomiske DNA, generere dype sekvensering biblioteker av PCR forsterkning av GDNA med primere rettet mot mål og off-target. Deretter bruker du indekst primere til å merke hvert utvalg. Bruk en neste generasjons sekvenseringsmaskin til å utsette utvalgsbibliotekene for part sluttsekvensering.

Etter at Snyper-skjermen er utført, kan prosentandelen av overlevelseskolonier beregnes ved å dele antall kolonier på den selektive LB-platen med antall kolonier på den ikke-selektive LB-platen. Selv om denne prosentandelen vanligvis er svært lav når den utføres med biblioteker av SP Cas9, kan sanne positive treff berikes ved å gjenta skjermen med det overlevende bassenget. En representativ Snyper-skjerm viser en overlevelsesrate på 100 % etter den tredje skjermen.

Transfections ved hjelp av RNPs eller plasmid kodet Snyper Cas9 kan gjøres for ulike mål, og de resulterende on-target og off-target aktiviteter målt ved mål amplicon sekvensering. På de fleste mål viser Snyper Cas9 samme nivå av på målaktiviteter og høyere spesifisitetsforhold sammenlignet med villtypen. Avkortede SGRNAer kan også brukes til å forbedre spesifisiteten ytterligere.

Høyere transformasjon effektivitet i det første rengjøringstrinnet er svært viktig for ikke å miste klonene med høy spesifisitet. Senere screeningtrinn gjentar mindre transformasjonseffektivitet siden klonene allerede er beriket i det første screeningtrinnet, og det er mindre sjanse for å miste dem. Det vil være mer enn én klone som vi fant i Snyper-skjermen.

Aktiviteter på mål og utenfor mål av disse klonene bør karakteriseres i så mange forskjellige mål som mulig for å velge kloner med best ytelse. Med denne metoden kan forskere forbedre spesifisiteten til de Cas9-lignende enzymene uten tap av on-target aktivitet. I tillegg trenger forskere ingen forkunnskaper om proteinets struktur for å gjøre forbedringer.