Login processing...

Journal / Genetics /

JoVE Journal
Genetics

This content is Open Access.

JoVE Journal Genetics

Med Sniper-Cas9 att minimera Off-target effekter av CRISPR-Cas9 utan förlust av på målet aktiviteten Via riktad Evolution

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Journal (Genetics)

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Journal (Genetics)

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Click here for the English version

Med Sniper-Cas9 att minimera Off-target effekter av CRISPR-Cas9 utan förlust av på målet aktiviteten Via riktad Evolution

Article DOI: 10.3791/59202-v • 11:37 min

February 26th, 2019 •

Joonsun Lee*¹, Min-hee Jung*¹, Euihwan Jeong*¹, Jungjoon K. Lee¹

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 26th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Här presenterar vi ett protokoll för att optimera CRISPR-Cas9 för att uppnå en högre specificitet utan förlust av på målet aktivitet. Vi använder en riktad evolution strategi kallas Sniper-skärmen för att hitta en mutant Cas9 med de önskade egenskaperna. Sniper-Cas9 är kompatibel med trunkerade singel-guide RNAs och leverans i ribonukleoprotein format, välkända strategier för att uppnå högre särdrag.

Transcript

I naturen är Cas9 ett immunprotein mot invaderande virus som evolutionen föredrar Cas9 med promiskuös specificitet som kan klyva virus-DNA med spontana mutationer. Vi byggde ett artificiellt riktat evolutionssystem som föredrar en optimerad Cas9-variant med hög specificitet. Både negativa och positiva val fungerar samtidigt i Sniper Screening System.

Cas9-varianter med minskad aktivitet utanför målet som också upprätthåller aktivitet på mål kan screenas på en gång. Mutationer infördes på hela Cas9 sekvens slumpmässigt för att producera biblioteket som ska screenas. Och detta gjorde det möjligt att hitta mutationer i oväntade positioner.

För närvarande är många forskare inom den akademiska världen och industrin använder Y-typ Cas9 för terapeutisk utveckling. Dock är specificiteten i Y-typ Cas9 inte optimerad, vilket kan resultera i av tätt packade. Hos människor innebär detta oväntade mutationer i slumpmässiga gener, vilket kan leda till allvarliga biverkningar.

Det finns många Cas9 som enzymer som håller på att utvecklas i therapeutics. Vår teknik kan användas för att förbättra specificiteten hos andra DNA och nukleider som Jipinger, Thailand, och Cas9 även såsom CPF1. Att göra ett bibliotek tillräckligt stort är nyckeln för att öka möjligheterna att få en variant med viktig funktion.

Var noga med att få en hög effektivitet i kylsteget, och använd högeffektiva kompetenta celler. För att börja detta förfarande, tillsätt ett nanogram av både CCDB plasmid och SGRNA plasmid med dubbla missmatchningar i femtio mikroliter av tinade BW25141 GOI-celler. Blanda försiktigt cellerna genom pipettering, och överföra dem till en pre-kyld, 0,1 centimeter elektroporation cuvette.

Omvandla E-coli med de två plasmiderna via elektroporation. Omedelbart efter att elektroporationen är avslutad, tillsätt 250 mikroliter av SOC-medium. Försiktigt pipettera lösningen för att blanda cellerna och medium, och överföra blandningen till en 1,5 milliliter microcentrifug rör.

Återvinn de transformerade cellerna och inkubera dem i 32 grader Celsius, med mild skakning i en timme. Fortsätt att förbereda Snyper-screeningcellerna enligt textprotokollet. När du är redo att utföra Snyper screening, omvandla Snyper screening celler med 100 nanogram av den beredda Cas9 variant plasmider från varje bibliotek med hjälp av elctroporation process som tidigare beskrivits.

Överför sedan 250 mikroliter av cellerna till ett färskt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt 250 piogram av ATC till en slutlig koncentration på 10 nanogram per milliliter. Återhämta både ATC-innehållande och ATC-fria celler genom att inkubera dem i 32 grader Celsius i en timme med mild skakning.

Plate 25 mikroliter av de återvunna ATC-fria cellerna på en LB-agarplatta, innehållande kloramfenikol och kanamycin. Lägg ATC till den återvunna ATC som innehåller celler till en slutlig koncentration av 100 nanogram per milliliter på en 245 millimeters LB-agarplatta. Platta omedelbart de ATC-innehållande cellerna på en LB-agar innehållande platta som innehåller kloramfenikol, kanamycin och arabinos.

Inkubera alla plattor över natten vid 32 grader Celsius. Nästa dag, fotografera plåtarna. Med hjälp av den öppna CFU-programvaran, räkna antalet livskraftiga kolonier, se till att antalet kolonier på den icke-selektiva plattan är minst tio gånger större än mångfalden i biblioteket, för att täcka alla varianter.

Dra kolonierna som överlevde på de selektiva plattorna från alla tre biblioteken. Överför dessa poolade kolonier till 250 milliliter lb-medium, kompletterat med kloramfenikol, och inkubera över natten vid 42 grader Celsius. Först, ladda Cas AV finder programvara för att plocka mål platser.

Välj den PAM Typ lämplig för den specifika typen av Cas9 och målgenomet. Fyll i fliken frågesekvenser. Välj felmatchningsnummer och klicka på skicka-knappen.

Efter några sekunder kommer on-target och off-target-webbplatser att visas. I allmänhet väljer du platser utanför målet med en till tre missmatchningar. Därefter beställer du CRRNA och Track RRNA-oligos med mallsekvenser och förstärker mallen som den skisseras i textprotokollet.

Analysera två mikroliter av den förstärkta mallen DNA, på en 2%agarose gel och sedan rena mallen. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid 37 grader Celsius. Nästa dag, tillsätt 0,5 mikroliter DNAse och inkubera i 37 grader Celsius i 15 till 30 minuter, och sedan rena SGRNA.

Behandla sedan 10 mikrogram av det in vitro transkriberade RNA med 250 enheter av kalven intestinal basisk fosfatas i tre timmar vid 3 grader Celsius, i närvaro av 100 enheter av RNAse-hämmare, och sedan rena det behandlade SGRNA. Först, behålla HEK293 T-celler i DMEM kompletteras med 10%FBS och 1%antibiotika vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Blanda därefter två mikrogram av antingen vildtyp eller Snyper Cas9-protein med två mikrogram SGRNA, och inkubera vid rumstemperatur i tio minuter för att göra RNP-komplex.

Trypsinize och räkna cellerna, sedan tvätta dem och förbereda dem i electroporation buffert som beskrivs i textprotokollet. Elektroporate RNP-komplexen in i cellerna med hjälp av en puls på 1300 volt i 30 millisekunder. Omedelbart efter elektroporationen, platta cellerna på en 48-väl platta fylld med 500 mikroliter av DMEM, kompletteras med 10%FBS och 1%antibiotika.

Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Underhåll HEK293 T-celler i DMEM kompletteras med 10%FBS och 1%antibiotika vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Dagen före transfektion, trypsinize och räkna cellerna.

Om man arbetar på en 48-brunnsskala, plåt 10, 000 celler per brunn och 250 mikroliter av komplett tillväxtmedium. Med hjälp av en lipidbaserad reagens för transfection, förbereda 250 nanogram P3S Cas9 plasmid och 250 nanogram SGRNA för transfection. Blanda sedan plasmiderna i 25 mikroliter av serumfri MEM.

Späd en mikroliter av transfektionsreagens med 25 mikroliter av serumfri MEM. Inkubera denna blandning i rumstemperatur i fem minuter. Kombinera plasmidblandningen med transfektionsreagensblandningen och inkubera på plats i 20 minuter för att bilda plasmid lipofectaminkomplex.

Efter detta, tillsätt 50 mikroliter av denna blandning direkt till varje brunn som innehåller celler. Försiktigt klippa plattan fram och tillbaka för att blanda. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator i 48 till 72 timmar efter transinfektion, innan assaying för transgenuttryck.

Efter att ha isolerat det tidigare beredda genomiska DNA: t, generera djupa sekvensering bibliotek av PCR förstärkning av GDNA med primers inriktning på mål och utanför målet. Använd sedan indexprimer för att märka varje prov. Använd en nästa generations sekvenseringsmaskin för att utsätta poolbiblioteken för ihopparad slutsekvensering.

Efter att Snyper-skärmen utförts kan andelen överlevnadskolonier beräknas genom att antalet kolonier på den selektiva LB-plattan dividerar med antalet kolonier på den icke-selektiva LB-plattan. Medan denna procentsats är oftast mycket låg när den utförs med bibliotek av SP Cas9, kan sanna positiva träffar berikas genom att upprepa skärmen med den överlevande poolen. En representativ Snyper-skärm visar en 100%-överlevnadsgrad erhålls efter den tredje skärmen.

Transfections med hjälp av RNPs eller plasmid kodade Snyper Cas9 kan göras för olika mål, och den resulterande på-mål och utanför målet aktiviteter mätt med mål amplicon sekvensering. På de flesta mål, visar Snyper Cas9 samma nivå av på målaktiviteter och högre specificitetskvoter jämfört med vildtyp. Trunkerade SGRNAs kan också användas för att ytterligare förbättra specificiteten.

Högre omvandlingseffektivitet i det första rengöringssteget är mycket viktigt att inte förlora klonerna med hög specificitet. Senare screening steg återkommer mindre omvandling effektivitet eftersom klonerna redan berikas i det första screeningsteget, och det finns mindre chans att förlora dem. Det kommer att finnas mer än en klon som vi hittade i Snyper skärmen.

On-target och off-target aktiviteter av dessa kloner bör karakteriseras i så många olika mål som möjligt för att välja kloner med bästa prestanda. Med denna metod kan forskare förbättra specificiteten hos De Cas9-liknande enzymerna utan förlust av on-target-aktivitet. Dessutom behöver forskarna inte någon förkunskap om proteinets struktur för att göra förbättringar.

X

Simple Hit Counter