Name: Asamblea de nanobarras de oro en Metamolecules plasmónica quirales mediante plantillas de Origami de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a ensamblar nanobarras de oro en metamoléculas plasmónicas quirales usando plantillas de origami de ADN. Este método permite fabricar estructuras tridimensionales con fuertes respuestas quiroópticas para aplicaciones en nanotecnología.

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Los autores agradecen a S. Voutilainen su asistencia con el espectrómetro del CD. Los autores reconocen la prestación de servicios y soporte técnico por la Universidad de Aalto en OtaNano - Nanomicroscopy centro (Aalto-NMC). Este trabajo fue apoyado por la Academia de Finlandia (grant 308992) y programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea bajo Marie Skłodowska-Curie conceder acuerdo Nº 71364.

1. diseño de origami de la DNA
<ol><li>Identificar la disposición espacial relativa deseada de AuNRs y la forma adecuada de la plantilla del origami de ADN (figura 1A). Estimar los parámetros estructurales de la AuNRs y las plantillas de origami. Localizar la posición aproximada de grapas que necesitan modificación (figura 1B).</li>
	<li>Descargar e instalar caDNAno18 para diseñar una plantilla de origami de ADN. En caDNAno, los filamentos del andamio y grapa según la forma deseada de la plantilla de la ruta y generar la secuencia de hilos básicos haciendo clic en la Herramienta de la Seq. Haga clic en la Herramienta de pintura y marca los hilos básicos que requieren más modificación (figura 1C).</li>
	<li>Haga clic en Herramienta de exportación para exportar las secuencias de ADN básicas (figura 1C) a un archivo .csv.</li>
	<li>Diseño de cerraduras de doble cadena para fijar el ángulo Θ entre los dos haces de origami. Dependiendo de la orientación relativa de los dos paquetes, el constructo de origami puede adaptar - o mano derecha izquierda (LH/RH) quiral configuración espacial (figura 1B).</li>
	<li>Importar el archivo .csv de las grapas en una aplicación de hoja de cálculo. Agregar una secuencia de10 polyA en el final de las grapas utilizada para armar AuNR (asas). Modificar las hebras discontinuas en los sitios de cierre diseñados con secuencias de cierre. Nota: Los conjuntos de resultados representativos contienen 36 tiradores que sobresalen en el extremo 3' de las hebras discontinuas, 18 en cada paquete de origami de ADN, distribuidos equitativamente en dos hélices en paralelo cada 21 nt. La distancia entre la primera y la última posición de la manija es de 168 nt, aproximadamente 57 nm (ver archivo adjunto caDNAno).</li>
</ol>2. montaje de las plantillas de origami de ADN
<ol><li>Preparar un stock trabajo de hebras discontinuas (SM), incluyendo filamentos con las manijas y cerraduras, mezclando cantidades iguales de oligonucleótidos básicos concentración normalizada (por ejemplo,, 100 μm). Nota: Las estructuras de Origami suelen contengan varios cientos de líneas discontinuas. Grapas por lo general se compran de proveedores especializados en la síntesis química de oligonucleótidos de ADN en multiwell (p. ej., 96-well) placas.</li>
	<li>Para 500 μl de origami nM 10, mezcle 50 μl de Tris-EDTA (TE, x 10), 100 μl de MgCl2 (100 mM), 25 μl de NaCl (100 mM), 175 μl de H2O, 100 μl de SM (0,5 μm), 5 μl de filamentos de bloqueo (5 μm) y un andamio 50 μl (100 nM).</li>
	<li>Cocer la mezcla en un termociclador de 80 ° C a 20 ° C como se describe en la tabla 1.</li>
</ol>3. purificación de origami de ADN
Nota: Esta sección describe el protocolo para la purificación del gel de agarosa. Plantillas de origami de la DNA se pueden purificar mediante enfoques alternativos38,39.
<ol><li>Para gel 1%, disolver 1 g de agarosa en 100 mL de Tris-borato-EDTA (TBE, 0.5 x) calentando la mezcla en un horno de microondas. Añadir 10 μl de 10.000 x ADN de la mancha según la especificación de la mancha. Para minimizar la exposición a la luz UV en la extracción paso (3.6), usar una tinción de DNA que puede visualizarse bajo excitación azul.</li>
	<li>Enfriar la solución a aproximadamente 40 ° C y añadir lentamente 1 mL de MgCl2 (1,3 M) agitando. Molde gel e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ajustar el aparato de electroforesis y vierta el buffer corriente fría (4 ° C) (0,5 x TBE con 11 mM de MgCl2) en la caja de gel. Colocar el gel en un baño de agua helada.</li>
	<li>Añadir el tampón de carga a las muestras de origami (6 x carga búfer contiene 15% polysucrose 400 y 0.25% bromofenol azul en el agua). Cargar las muestras en los pozos con un volumen apropiado según el peine utilizado (e.g., 50 μl de un peine de 8 pozos de 1.5 mm de espesor).</li>
	<li>Correr la electroforesis durante 2 h a 80 V. Nota: Para caracterizar el origami y separar la estructura abierta y cerrada, utilice gel 2% en vez del 1% y prolongar el tiempo de ejecución a 4 h.</li>
	<li>Imagen del gel con el reproductor de imágenes de gel (figura 2). Usar un transiluminador de luz azul para visualizar las bandas, corte la banda de origami, romper el gel en un parafilm y extraer el líquido. El rendimiento de recuperación es aproximadamente 40%.</li>
	<li>Pipeta el líquido en una unidad de filtro centrífugo y centrifugado a 3.000 x g por 5 min medir la absorción de la solución de origami a 260 nm con un espectrómetro UV-visible (UV-VIS). Calcular la concentración de origami con un coeficiente de extinción de 1.3 x 108 M-1·cm-1. Nota: La típica concentración de solución de origami después de purificación del gel de agarosa es 1-2 nM.</li>
	<li>Guarde las plantillas de origami purificada a 4 ° C para su uso posterior.</li>
</ol>4. síntesis de nanobarras de oro
Nota: El protocolo para síntesis de AuNR es adaptado de la anterior literatura40 con modificaciones menores.
<ol><li>Lave toda la cristalería con agua regia por 5 min, enjuagar con agua, someter a ultrasonidos con agua ultrapura y seco antes de usar.</li>
	<li>Preparar 0,2 M bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4 m m de AgNO3, 64 m m L (+)-ácido ascórbico y 6 mM NaBH4. Usar agua fría (4 ° C) para disolver NaBH4 y mantener en nevera a 4 ° C. Solución de ácido ascórbico debe ser recién preparado. PRECAUCIÓN: CTAB es peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), contacto con los ojos (irritante), ingestión e inhalación. Usar ropa protectora adecuada. En caso de ventilación insuficiente, úsese equipo respiratorio adecuado. NaBH4 es extremadamente peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), contacto con los ojos (irritante), ingestión e inhalación. Usar gafas resistentes a salpicaduras, una bata, guantes y un respirador de vapor y polvo. Asegúrese de usar un respirador aprobado/certificado o equivalente.</li>
	<li>Preparar las semillas de la Au.<ol>
<li>Añadir 500 μl de CTAB (0,2 M), 250 μl de agua ultrapura y 250 μl de HAuCl4 (1 mM) en un frasco de vidrio. Revuelva a 450 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Aumentar la velocidad de agitación a 1.200 rpm. Añada 100 μl de solución fría NaBH4 (6 mM, 4 ° C). Después de 2 minutos, detener la agitación e incubar la solución en un baño de agua a 30 ° C por 30 minutos antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar AuNRs.<ol>
<li>Disolver 0,55 g de CTAB y 0,037 g de ácido 2, 6-dihydroxybenzoic en 15 mL de agua caliente (60-65 ° C) en un matraz de fondo redondo. Enfriar la solución a 30 ° C, añadir 600 μl de AgNO3 (4 mM) y revuelva a 450 rpm por 2 minutos. Luego, deje la solución reposar por 15 min a 30 ° C.</li>
		<li>Añadir 15 mL de HAuCl4 mM (1) a la solución y revuelva a 450 rpm por 15 minutos agregue 120 μl de L (+)-ácido ascórbico (64 mM), entonces, inmediatamente, revuelva a 1.200 rpm durante 30 s. Añadir 12 μl de semillas Au y seguir revolviendo a 1.200 rpm durante 30 s.</li>
		<li>Incubar la solución en un baño de agua a 30 ° C por 18 h. No molestar a la solución y usar una tapa para cerrar el frasco.</li>
		<li>Transferir la solución resultante a tubos de centrífuga y centrifugue a 9.500 x g durante 12 minutos a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante, dispersar el pellet en 20 mL de agua ultrapura y realizar un más paso de centrifugación.</li>
		<li>Dispersar el pellet final en 3 mL de agua destilada. Calcular la concentración de AuNRs de una medida de absorción UV-VIS utilizando el coeficiente de extinción para la resonancia del plasmon longitudinal. El coeficiente de extinción puede predecirse utilizando AuNR forma parámetros41. Almacenar AuNRs a 4 ° C para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. funcionalización de nanobarras de oro con ADN
Nota: Esta sección describe el protocolo para funcionalización de AuNR con ADN monocatenario (ssDNA), siguiendo la ruta de llamada bajo pH adaptada de la anterior literatura42. El AuNRs cubiertos con el ADN son purificados por centrifugación; Alternativamente, puede realizarse la purificación mediante electroforesis en gel de agarosa.
<ol><li>Incubar 20 μl de filamentos de la DNA de polyT tiol funcionalizados (1 mM) con 20 μl de recién tris(2-carboxyethyl) clorhidrato de fosfina (TCEP, 14 mM) de 1 h reducir enlaces de disulfuro. Nota: El formulario de grupos tiol bonos con AuNRs, y la secuencia polyT hibridiza con la manija10 de polyA en el origami, en el que demasiados o muy pocos pares de bases puede conducir a un mal funcionamiento o un conjunto inestable. PRECAUCIÓN: TCEP puede causar quemaduras severas de la piel y daños oculares. Use guantes de protección/protección ropa/protección/cara protección.</li>
	<li>Mezcla 150 μL de AuNRs (10 nM) y 40 μl de tratados TCEP tiol-ADN (0,5 mM). Agregue 1% sodio dodecil sulfato (SDS) a la solución de AuNR para alcanzar una concentración final de SDS de 0.05%. Ajustar el pH a 2.5-3 con ~ 1 μl de HCl (1 M).</li>
	<li>Incubar por 2 h agitando a 70 rpm. Nota: La relación AuNR a ADN debe estar en el orden de 1:5, 000-15.000, dependiendo del tamaño de las barras. Para el AuNRs (70 nm x 30 nm) preparado siguiendo el protocolo descrito en el apartado 4, un exceso de 13.000 de tiol-ADN se recomienda.</li>
	<li>Añadir NaCl para llegar a una concertación final de NaCl 0,5 m e incubar durante 4 h a temperatura ambiente agitando a 70 rpm. Nota: Un cambio de color en este paso puede indicar un error funcionalización de ADN.</li>
	<li>Ajustar el pH a ~8.5 con buffer TBE (x 10) e incubar durante la noche.</li>
	<li>Lavar el ADN-AuNRs 4 x mezclando las muestras con 1 mL de tampón de lavado (0,5 x TBE con 0.1% SDS) y centrifugar a 7.000 x g durante 30 minutos quite el sobrenadante y resuspender el ADN AuNRs en el líquido restante (~ 40 μL). Calcular la concentración de ADN-AuNRs de una medida de absorción UV-VIS como se describe en el paso 4.4.5. Nota: La solución podría ser ligeramente turbia a pasos 5.3-5.4 debido a la sustitución de CTAB de la superficie de la AuNRs por tiol-DNA. La solución debe quedar clara al calentamiento hasta ~ 35 ° C durante 5 minutos.</li>
</ol>6. montaje de nanobarras de oro en las plantillas de origami de ADN
<ol><li>Agrega MgCl2 a la solución de ADN purificado-AuNRs, a una concentración final de 10 mM. Mezclar el ADN-AuNRs purificado y el origami en una relación 10:1. Nota: Una relación baja puede disminuir el rendimiento producto del43.</li>
	<li>Cocer la mezcla en un mezclador con un control de temperatura de 40 ° C a 20 ° C agitando a 400 rpm, siguiendo el procedimiento en la tabla 2. Nota: Para la caracterización de la CD, la muestra puede ser medida después de este paso sin posterior purificación.</li>
	<li>Utilizar la electroforesis del gel de agarosa de 0,7% (3,5 h a 80 V) para purificar las estructuras de origami-AuNR final.</li>
	<li>Usar un transiluminador de luz blanca para la proyección de imagen. Corte la banda de producto (origami AuNR dimer) (figura 3), romper el gel en un parafilm y extraer el líquido. Pipeta el líquido en una unidad de filtro centrífugo y centrifugado a 3.000 x g por 5 min Resuspender el origami-AuNRs en la solución. El rendimiento de recuperación del gel es aproximadamente 50%.</li>
	<li>Calcular la concentración de las estructuras de AuNR origami de una medida de absorción UV-VIS como se describe en el paso 4.4.5.</li>
</ol>7. imágenes de microscopia electrónica de transmisión
Nota: Este formato de uranilo (OVNI) protocolo de tinción es adaptado de la literatura anterior44.
<ol><li>Mezcla 200 μL de solución de OVNI (0,75%) y 1 μl de NaOH (5 M) de vortex inmediatamente durante 2-3 minutos y centrifugar la solución colorante durante 3-4 minutos a 14.000 x g. Proteger a la mancha de exposición a la luz (por ejemplo, envolviéndola en papel de aluminio). PRECAUCIÓN: OVNI es tóxico si se inhala o se ingiere y puede causar irritación de los ojos. En el caso de exposición breve o poco contaminante, utilice un dispositivo de filtro respiratorio. En caso de exposición intensa o más, utilice un dispositivo de protección respiratorio autocontenido. Guantes. Material del guante debe ser impermeable y resistente al OVNI y sus soluciones. Gafas herméticos.</li>
	<li>Descarga del resplandor rejillas TEM de carbón/formvar-cubierto para 6 s justo antes del uso para aumentar la hidrofilicidad y promover el pegarse de las estructuras. Pipeta de 5 μl muestra gotas de la rejilla TEM, incube durante 5-8 min y quitar la gota tocando suavemente un papel de filtro con el borde de la rejilla.</li>
	<li>Tomar con pipeta una gota grande (~ 20 μl) y otra pequeña (~ 10 μl) de la solución de tinción en un parafilm. Poner la rejilla en la gota de solución de pequeña mancha y seque inmediatamente al tocar el papel filtro con el borde de la cuadrícula. Luego, ponerlo en la gota de solución de la gran mancha para 30 s.</li>
	<li>Quite el líquido en la parrilla al tocar el papel filtro con el borde de la cuadrícula. Coloque la parrilla en el soporte de red. Espere a que la rejilla secar durante al menos 10 minutos.</li>
	<li>Caracterizan a las muestras de origami (figura 4), AuNRs (figura 5) y origami-AuNRs (figura 6) por TEM.</li>
</ol>8. medida circulares del dicroísmo
<ol><li>Purgar el espectrómetro del CD con N2 por 20 min. Nota: La mayoría de los espectrómetros de CD requieren purga con N2 antes de la ignición de la lámpara. Consulta el manual de espectrómetro del CD.</li>
	<li>Establecer el ancho de banda, la gama de la exploración y paso de adquisición. Nota: La gama de la exploración depende de las propiedades ópticas de AuNRs, que depende del tamaño de la AuNRs.</li>
	<li>Medida CD en blanco con el tampón.</li>
	<li>Medir los espectros de CD de origami-AuNR muestras (figura 7). Nota: Utilice cuartos o cubetas de vidrio para la medida de CD. Cubetas de plástico son inadecuadas para la espectroscopia del CD. También, la mayoría espectrómetros de CD permiten la adquisición simultánea de datos de CD y absorción.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El Protocolo introduce el flujo de trabajo completo de diseño, montaje, purificación y caracterización de asambleas quirales basados en origami de ADN de AuNRs. Las plantillas de origami de ADN utilizadas en el protocolo son especialmente adecuadas para la fabricación de conjuntos de estímulos-respuesta. Varios tipos de respuestas y functionalizes pueden ser incorporados en los filamentos de la cerradura que definen el estado quiral de origami plantilla (figura 1B)24,25,26,31. Para montajes estáticos, plantillas más sencillas en forma de bloque son a menudo suficientes14,45,46,47.
El ADN origami enfoque basado en la fabricación de nanoestructuras plasmónica hereda limitaciones del ADN origami técnica48. El tamaño de las plantillas de origami es normalmente limitado por el tamaño del filamento del andamio. La estabilidad de las estructuras de ADN se reduce bajo condiciones ley sal. El costo de la grapa sintético hebras sigue siendo bastante alto. Sin embargo, se espera que los acontecimientos recientes en el campo de la nanotecnología de ADN estructural para superar estas limitaciones49,50,51,52,53,54 , 55.
En comparación con otros enfoques moleculares para la generación de asambleas quirales de AuNRs34,35,36,37, origami de ADN proporciona un alto nivel de precisión espacial y de programación.
Para lograr respuestas ópticas fiables y reproducibles de asambleas quirales, se recomienda adaptar los protocolos de AuNR síntesis40, ya que la calidad y propiedades ópticas de los productos comerciales pueden variar entre lotes. Adicional recocido (paso 6.2) es a menudo crucial para asegurar la correcta fijación de AuNRs a plantillas de origami de ADN (figura 6).
Por último, el protocolo descrito aquí no se limita a asambleas quirales. Origami de ADN proporciona una plataforma muy flexible para la fabricación de nanoestructuras plasmónica complejo9,10.

Nanoestructuras de ADN, origami de ADN en particular, han sido ampliamente utilizados para organizar moléculas y otros componentes a nanoescala (por ejemplo, las proteínas y nanopartículas [NPs]), con precisión de nanómetros en geometrías casi arbitrario1,2 , 3 , 4 , 5. la capacidad de arreglar metal NPs en plantillas de origami de la DNA con un alto rendimiento y precisión permite la fabricación de plasmónica estructuras con nuevas propiedades ópticas6,7,8, 9 , 10. técnica de origami de ADN es especialmente útil para la generación de estructuras plasmónica quirales, que requieren arquitecturas realmente tridimensional11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20.
Este protocolo describe detalladamente todo el proceso de la fabricación de asambleas quirales con plantilla de origami de ADN de AuNRs. El software utilizado para el diseño21 y estructura predicción22,23 de origami de ADN es intuitiva y libremente disponible. La fabricación de origami y la síntesis de AuNR utilizan equipo común de laboratorio de bioquímica (p. ej., termocicladores, electroforesis en gel, placas, centrifugadoras). Las estructuras son caracterizadas usando la espectroscopia TEM y CD estándar.
La fabricación de nanoestructuras plasmónica similares con métodos de arriba hacia abajo (p. ej., litografía por haz de electrones) requeriría algo complicado y costoso equipo. Además, ADN origami plantillas proporcionan la posibilidad de incorporar reconfigurabilidad estructural en plasmónica asambleas24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33, que es extremadamente difícil para las estructuras fabricadas con técnicas de litografía. En comparación con otros enfoques moleculares34,35,36,37, fabricación basada en el origami de ADN proporciona un alto nivel de precisión espacial y de programación.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2,6-dihidroxibenzoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D109606-25</td><td>98+%</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA1141414</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul&nbsp;</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-06</td><td>FastGene LED Transiluminador</td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Acros Organics</td><td>403160050</td><td>Para gel de agarorosa&nbsp; tampón de carga</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo</td><td>Merck Millipore</td><td>42600</td><td>Extracción de ADN de agarosa</td></tr><tr><td>Chirascan CD espectrómetro&nbsp;</td>Cubeta <td>de Fotofísica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicada&nbsp;</td><td>Hellma&nbsp;</td><td>105-202-85-40</td><td>Tubos</td></tr><tr><td>lobind de ADN</td> de cuarzo SUPRASIL <td></td><td>Bioespectrómetro Eppendorf</td> 30108051 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6135000904</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP525-10</td><td>Polysacarosa 400 (Para gel de agarorosa&nbsp; tampón de carga)</td></tr><tr><td>Equipos de electroforesis en gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes en gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Gel Doc XR+ System&nbsp;</td></tr><tr><td>HAuCl4&bull; 3H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA3640006</td><td>99.99%</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>AC07441000</td><td>bromuro</td></tr><tr><td>de hexadeciltrimetilamonio 1M (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9151-100</td><td>BioXtra, ácido 98+%</td></tr><tr><td>L(+)-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td> hebra de andamio <td>99+%</td></tr><tr><td>M13p7560</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500</td><td>BioXtra, 99+%</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Acros Organics</td><td>200050250</td><td>99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-500</td><td>BioXtra, 99.5+</td></tr><tr><td>%NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500</td><td>BioXtra, 98+%</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668-1EA</td><td>PARAFILM M</td></tr><tr><td>Tampón PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td>Biología molecular</td></tr><tr><td>ProFlex Sistema de PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255-250</td><td>99+%</td></tr><tr><td>Filamentos de grapas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sybr Safe</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S33102</td><td>Para</td></tr><tr><td>tampón TBE de tinción de ADN (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE de biología molecular (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific BP24771</td><td></td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>FEI Tecnai F12</td></tr><tr><td>Funcionalizado con tiol&nbsp; ssDNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biomers.net</tr><tr><td>Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI20491</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura (Tipo 1)</td><td></td><td></td><td>Sistema Milli-Q Direct 8</td></tr><tr><td>Formiato de uranilo</td><td>Tebu-bio</td><td>24762-1</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz blanca</td><td>UVP</td><td>TW-26</td><td></td></tr></tbody></table>

asamblea de nanobarras de oro en metamolecules plasmónica quirales mediante plantillas de origami de adn

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

El direccionamiento inherente de las estructuras de origami de ADN hace plantillas ideales para el arreglo de las nanopartículas metálicas en complejas nanoestructuras plasmónica. La alta precisión espacial de un conjunto con plantilla de origami de ADN permite controlar el acoplamiento entre la resonancia plasmónica de partículas individuales y permite la adaptación de propiedades ópticas de nanoestructuras construidas. Recientemente, sistemas plasmónica quirales atrajeron la atención debido a la fuerte correlación entre la configuración espacial de los conjuntos plasmónica y sus respuestas ópticas (por ejemplo, dicroísmo circular [CD]). En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para la generación de asambleas quirales basados en origami de ADN de nanobarras de oro (AuNRs). El protocolo incluye una descripción detallada de los principios de diseño y procedimientos experimentales para la fabricación de plantillas de origami de ADN, la síntesis de AuNRs y el montaje de estructuras de AuNR origami. Además, se incluye la caracterización de estructuras mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopia de la CD. El protocolo descrito no se limita a configuraciones chiral y puede ser adaptado para la construcción de varias arquitecturas plasmónica.

Imágenes TEM de plantillas de origami de la DNA, AuNRs y conjuntos de origami-AuNR final se muestran en la figura 4, figura 5y figura 6A, respectivamente. Debido a su preferencia de unión a rejillas TEM, origami AuNR asambleas son vistos generalmente como paquetes de origami paralelas y barras (figura 6A). Recocido térmico es necesario para la correcta alineación de AuNRs en las plantillas de origami (figura 6A, B). El protocolo permite altos rendimientos de la Asamblea de AuNRs en metamolecules quirales con respuestas fuertes plasmónica de CD (figura 7).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>hora</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>79 - 71</td>
			<td>1 ° C/1 minuto</td>
		</tr>
<tr>
<td>70 - 66</td>
			<td>1 ° C/5min</td>
		</tr>
<tr>
<td>65 - 60</td>
			<td>1 ° C/30 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>59 - 37</td>
			<td>1 ° C/60 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>36 - 30</td>
			<td>1 ° C/15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>29 - 20</td>
			<td>1 ° C/5min</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>Mantenga</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Temperaturas y tarifas para el recocido térmico de plantillas de origami de la DNA.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tiempo (min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>36</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>32</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>Mantenga</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: temperaturas y tiempos de espera para el recocido de AuNRs y ADN plantillas de origami. La velocidad de enfriamiento entre los pasos se establece en 0,1 ° C por minuto. Las muestras de ADN origami AuNR se recuecen agitando a 400 rpm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig1.jpg"> Figura 1 : Diseño de ADN origami plantillas quirales metamolecules. (A) identificar la disposición espacial relativa deseada de nanobarras de oro (AuNRs) y una forma conveniente de la plantilla del origami de ADN. (B) estimar los parámetros estructurales de la AuNRs (DAuNR, LAuNR) y la plantilla del origami (origamide W, Lorigami, Θ). Localizar la posición aproximada de las grapas que necesitan modificación. (C) diseño de plantillas de origami de la DNA usando caDNAno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig2.jpg"> Figura 2 : La electroforesis de gel de agarosa de origami. (A) purificación con electroforesis de gel de agarosa al 1% por 2 h a 80 V. (B) caracterización con electroforesis en agarosa al 2% durante 4 h a 80 V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig3.jpg"> Figura 3 : La purificación de electroforesis en gel de agarosa de origami-AuNRs. Gel (0,7%) se corren por 3,5 h 80 V para las muestras preparadas siguiendo el procedimiento de montaje con diferentes ratios de AuNR ADN de origami (20:1, 5:1) y las muestras (proporción de DNA AuNRs para origami 10:1) con o sin procedimiento de recocido. Imágenes de TEM de las muestras en las bandas 1, 2 y 3, véase la figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig4.jpg"> Figura 4 : Imagen de TEM representante de las plantillas de origami de la DNA. La estructura del origami consiste en dos paquetes de la hélice 14 (80 nm x 16 nm x 8 nm) Unidos entre sí por el filamento de andamio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig5.jpg"> Figura 5 : Imagen de TEM representante de la AuNRs. Las dimensiones promedio de AuNRs sintetizados son 70 x 30 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig6.jpg"> Figura 6 : Imágenes TEM de origami-AuNR asambleas. (A) AuNR dímeros de origami después de recocer (banda 1 en la figura 3). (B) AuNR dímeros en origami sin el recocido (banda 2 en la figura 3). (C) Origami-AuNR agregados (banda 3 en la figura 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig7.jpg"> Figura 7 : Espectros de CD de las Asambleas de origami-AuNR. Los espectros de CD de las estructuras cerradas (las plantillas de origami fijadas por los filamentos de la cerradura en una configuración de diestra, con 50° entre los dos paquetes de origami) y la estructura abierta (las plantillas de origami sin hilos de la cerradura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos el protocolo detallado para el montaje basado en origami ADN de nanobarras de oro en metamolecules plasmónica quirales con fuerte chiroptical respuestas. El Protocolo no se limita a configuraciones chiral y puede ser fácilmente adaptado para la fabricación de varias arquitecturas plasmónica.

Asamblea de nanobarras de oro en Metamolecules plasmónica quirales mediante plantillas de Origami de ADN

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

Este método permite la fabricación de ensamblajes plasmónicos quirales tridimensionales con fuertes respuestas quirócticas. La principal ventaja de este enfoque es que permite la fabricación de nanoestructuras metálicas complejas utilizando herramientas de software de libre disponibilidad y equipos comunes de laboratorio de bioquímica. Demostrando el procedimiento será Yike Huang un estudiante de posgrado y Minh-Kha Nguyen un postdoctorado de mi laboratorio.Utilice caDNAno para diseñar una plantilla de origami de ADN. Enrute el andamio en hebras de grapas de acuerdo con la forma deseada de la plantilla. A continuación, genere las secuencias de hebras de grapas haciendo clic en la herramienta de secuencia.Haga clic en la herramienta de pintura y marque las hebras de grapas que requieren más modificaciones. Haga clic en la herramienta de exportación para exportar las secuencias de grapas de ADN a un archivo CSV. A continuación, importe el archivo CSV en una aplicación de hoja de cálculo.Agregue una secuencia de poliadenina al final de las grapas que se utilizarán como asas para el ensamblaje de nanorod de oro. Modifique las hebras de grapas en los sitios de bloqueo diseñados con secuencias de bloqueo. Preparar un stock de trabajo de hebras básicas, incluyendo hebras con asas y cerraduras mezclando cantidades iguales de oligonucleótidos básicos normalizados de concentración.A continuación, prepare la mezcla de origami como se detalla en el protocolo de texto. Anneal la mezcla en el termociclo de 80 grados a 20 grados Celsius. Para un gel al 1%, disolver un gramo de agarosa en 100 mililitros de TBE calentando la mezcla en el horno microondas.Agregue 10 microlitros de 10.000X de mancha de ADN de acuerdo con la especificación de la mancha. Para minimizar la exposición a la luz UV en el paso de extracción, utilice una mancha de ADN que se puede visualizar bajo excitación azul. Arroje el gel e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, coloque la caja de gel en un baño de agua helada. Añadir búfer de carga a las muestras de origami y cargar las muestras en los pozos con un volumen adecuado de acuerdo con el cono utilizado. Ejecuta la electroforesis durante dos horas a 80 voltios.Image el gel con el gel imager. Utilice un transilluminador de luz azul para visualizar las bandas y cortar la banda de origami. A continuación, romper el gel en parafilm y extraer el líquido.El rendimiento de recuperación es de aproximadamente 40% Pipetear el líquido en una unidad de filtro centrífuga y girar a 3.000 veces G durante cinco minutos. Mida la absorción de la solución de origami a 260 nanómetros con un espectrómetro visible UV. Para preparar las nanorods de oro, disolver 0,55 gramos de CTAB y 0,037 gramos de 2, 6-dihidroxibenzoico ácido en 15 mililitros de agua tibia en un matraz inferior redondo.Después de enfriar la solución a 30 grados Celsius, añadir 600 microlitros de cuatro nitrato de plata milimétrica y remover a 450 RPM durante dos minutos. Deje la solución sin perturbaciones durante 15 minutos a 30 grados centígrados. A continuación, agregue 15 mililitros de un tetracloroaurato de hidrógeno milimiolar a la solución y revuelva a 450 RPM durante 15 minutos.Además, añadir 120 microlitros de ácido L-ascórbico de 64 milimolares y agitar inmediatamente a 1,200 RPM durante 30 segundos. Ahora, añade 12 microlitros de semillas de oro y sigue revolviendo a 1.200 RPM durante 30 segundos. Incubar la solución en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 18 horas.No moleste la solución y utilice una tapa para cerrar el matraz. Transfiera la solución resultante a tubos centrífugos y centrífuga a 9.500 veces G durante 12 minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y disperse el pellet en 20 mililitros de agua ultra pura.Realice un paso más de centrifugación y luego disperse el pellet final en tres mililitros de agua destilada. Estimar la concentración de nanorods de oro a partir de una medición de absorción visible UV utilizando el coeficiente de extinción para la resonancia longitudinal del plasmón. Mezclar 150 microlitros de 10 nanorods de oro nanomolar y 40 microlitros de ADN tiol tratado con TCEP de 0,5 milimolar.Añadir 1%SDS a la solución de nanorod de oro hasta que se alcance una concentración final de SDS de 0.05%. Ajuste el PH a entre 2.5 y tres con aproximadamente un microlitro de un molar HCL. Incubar durante dos horas mientras se agita a 70 RPM.Añadir cloruro de sodio para alcanzar una concentración final de cloruro de sodio de 0,5 molares e incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente mientras se agita a 70 RPM. A continuación, ajuste el PH a aproximadamente 8,5 con tampón TBE 10X e incubar durante la noche. Lave las nanorods de oro DNA cuatro veces mezclando las muestras con un mililitro de tampón de lavado y centrífuga a 7.000 veces G durante 30 minutos.Retire el sobrenadante y resusppend las nanorods de oro de ADN en el líquido restante. Estimar la concentración de nanorods de oro de ADN a partir de una medición de absorción visible UV como antes. Añadir cloruro de magnesio a la solución de nanorods de oro de ADN purificado a una concentración final de 10 milimolar.Mezclar los nanorods y origami de oro de ADN purificado a una proporción de 10 a uno y producir la mezcla en un mezclador con un control de temperatura de 40 grados Celsius a 20 grados Celsius mientras agita a 400 RPM. Utilice 0.7%agarose gel electrophoresis para purificar las estructuras finales de nanorod de oro de origami. Para la toma de imágenes TEM, mezcle 200 microlitros de 0,75% de solución de formato de uranilo y 1 microlitro de cinco molares de hidróxido de sodio.Vórtice inmediatamente durante dos o tres minutos. Centrifugar la solución de tinción durante tres a cuatro minutos a 14.000 veces G.Then, proteja la mancha de la exposición a la luz envolviéndola en papel de aluminio. Después de aumentar la hidrofalicidad de las rejillas TEM como se describe en el protocolo de texto, pipetear cinco microlitros gotas de muestra en la cuadrícula TEM.Después de una incubación de cinco a ocho minutos, retire la gota tocando suavemente un papel de filtro con el borde de la rejilla. Ahora, pipetear una gota grande y una pequeña gota de la solución de manchas en un pedazo de parafilm. Coloque la rejilla en la pequeña gota de solución de manchas y séquela inmediatamente tocando el papel de filtro con el borde de la rejilla.Luego, colóquelo en la gran gota de solución de manchas durante 30 segundos. Aquí se muestra una imagen TEM de plantillas de origami de ADN. La estructura del origami consta de dos 14 haces de hélice unidos entre sí por la hebra del andamio.Aquí, se muestra una imagen TEM representativa de nanorods de oro. Las dimensiones medias de las nanorods de oro sintetizado son de 70 por 30 nanómetros. Esta imagen muestra dimers de nanorod de oro en el origami después del recocido.Debido a su preferencia de unión a las rejillas TEM, los conjuntos de nanorod de oro de origami se ven generalmente como haces y varillas paralelas de origami. El protocolo permite altos rendimientos del ensamblaje de nanorods de oro en metamollas quirales con fuertes respuestas de dicroísmo circular plasmónico. Aquí se muestran los espectros de las estructuras cerradas y las estructuras abiertas.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran las propiedades ópticas plasmónicas de complejas nanoestructuras metálicas autoensambladas. Como se describe en el protocolo de texto, se utilizan varios productos químicos peligrosos en este método. Por favor, compruebe cuidadosamente la hoja de datos de seguridad del material y tome las precauciones necesarias.

assembly-gold-nanorods-into-chiral-plasmonic-metamolecules-using-dna

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Origami de ADN es un poderoso método para la fabricación de objetos nanométricos precisos programando el auto-ensamblaje de moléculas de ADN. Aquí, se describe cómo origami de ADN se puede utilizar para diseñar un robot robótico capaz de detectar señales biológicas y responder por el cambio de forma, posteriormente transmitida a un efecto deseado.

Diseño de un Robot Bio-respuesta a partir del ADN Origami

Suspendibles solución de nanotubos de oro con dimensiones controladas pueden ser sintetizados por deposición electroquímica en anódica porosa de óxido de aluminio (AAO) membranas utilizando un núcleo de polímero hidrofóbico. Los nanotubos de oro y arrays de nanotubos son prometedores para aplicaciones en biosensores plasmónica, de superficie mayor espectroscopia Raman, calefacción fototérmica, el transporte iónico y molecular, la microfluídica, la catálisis y la detección electroquímica.

Plantilla Dirigida Síntesis de nanotubos de oro plasmónicos con Tunable absorbancia IR

origami de ADN es un poderoso método para fabricar objetos precisos a nanoescala mediante la programación del autoensamblaje de moléculas de ADN. Aquí describimos un protocolo para el plegamiento de un robot bio-sensible a partir de origami de ADN, su purificación y tinción negativa para la transmisión de imágenes microscópicas electrónicas (TEM).

Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

mosaico de ADN es un enfoque eficaz para crear nanoestructuras programables. Describimos los protocolos para construir formas bidimensionales complejas mediante el autoensamblaje de mosaicos de ADN monocatenario.

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Describimos el protocolo detallado para el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para un rack de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6.

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

Este artículo presenta un protocolo detallado para ligadura de T4 y desnaturalización página purificación de moléculas pequeñas de ADN circular, recocido y del análisis de la página nativa de Tejas circular, montaje y proyección de imagen de AFM de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D, así como de agarosa gel purificación de electroforesis y centrifugación de nanoestructuras de ADN finito.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

Aquí, se presenta un protocolo para la protección del ADN origami nanoestructuras en Mg-agotado y nucleasa medios enriquecidos con polisacárido catiónico natural Quitosana y recubrimientos sintéticos polietilamina lineal (LPEI).

Terapia génica inspirado POLICATIÓN recubrimiento para protección de nanoestructuras de Origami de ADN

Aquí, describimos un protocolo para crear nanoestructuras inorgánicas discretas y precisas en sustratos utilizando formas de origami de ADN como plantillas guía. El método se demuestra mediante la creación de antenas plasmónicas en forma de pajarita de oro en un sustrato transparente (zafiro).

Nanopatrón de nanopatrón de nanopatrón de sustrato mediado por origami de ADN para aplicaciones de cizallamiento

Este protocolo demuestra mediciones de dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) de una sola molécula utilizando una nanoantena de origami de ADN (DONA) combinada con microscopía de fuerza atómica colocalizada (AFM) y mediciones Raman.

Mediciones de dispersión Raman mejoradas en superficie de una sola molécula habilitadas por nanoantenas de origami de ADN plasmónico

Se describen detalles experimentales de la síntesis de partículas modeladas y reconfigurable de dos dimensiones (2D) precursores. Esta metodología se puede utilizar para crear las partículas en una variedad de formas, incluyendo poliedros y dispositivos de agarre en escalas de longitud que van desde el micro a escala de centímetros.

Origami Inspired autoensamblaje de partículas modeladas y Reconfigurable

Aprende a ensamblar nanobarras de oro en metamoléculas plasmónicas quirales usando plantillas de origami de ADN. Este método permite fabricar estructuras tridimensionales con fuertes respuestas quiroópticas para aplicaciones en nanotecnología.

Asamblea de nanobarras de oro en Metamolecules plasmónica quirales mediante plantillas de Origami de ADN

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