Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Bruke nær-infrarød fluorescens og høyoppløselig skanning å måle protein uttrykk i gnagere Brain
Chapters
Summary May 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en protokoll som bruker nær-infrarøde fargestoffer i forbindelse med immunhistokjemi og høyoppløselig skanning til analysen proteiner i hjernen regioner.
Transcript
Denne protokollen er betydelig fordi den tillater kvantifisering av to proteiner i samme hjerneregion. Dette gjør at eksperimentereren kan se på aktivitet i molekylære signalveier i hjerneregioner ved å analysere pan og fosfoproteiner. Det kan også brukes til å analysere proteiner som er markører for forskjellige kognitive fenomener.
Vi bruker en relativt enkel teknikk, for eksempel immunohistochemistry, for å svare på spørsmål som vanligvis krever mer involverte teknikker. Inkludert å undersøke aktiviteten til molekylære signalveier, undersøke AMPA/ NMDA-forholdet. Ved hjelp av en kryostat opprettholdt mellom minus 9 grader Celsius og minus 12 grader Celsius, skive tidligere isolert og frossen rotte hjerne i områder av interesse på 30-50 mikrometer.
Monter skiver direkte på glasssklier og oppbevar ved minus 80 grader Celsius til immunocytochemistry. Fjern glassskliene fra fryseren og la dem likevekte til romtemperatur i 30 minutter. Arbeider under en røykhette, plasser lysbildene i 4% paraformaldehyd i 0,1 molar PBS i en til to timer ved romtemperatur for vevfiksering.
Skyll deretter lysbildene i 0,1 molar TBS tre ganger i 10 minutter hver. For å gjennomsyre cellemembraner, inkuber lysbildene i et mildt vaskemiddel i 30-60 minutter. Og skyll igjen i TBS tre ganger i 15 minutter hver.
Fortynn primært antistoff for protein av interesse for PBS i riktig konsentrasjon som beskrevet i manuskriptet. Pipette primære antistoff løsning direkte på hjernevevet. Plasser dekselet glir på lysbildene og inkuber hjernevevet i primær antistoff fortynning i 1-2 timer ved romtemperatur.
Etter inkubasjon fjerner du dekselslippene og vasker lysbildene i TBS som har en liten mengde vaskemiddel lagt til det, fire ganger i 15 minutter hver. Fortynn sekundært antistoff i et fortynningsmiddel som inneholder TBS, vaskemiddel og 1,5 % av vertsserumet. Legg til sekundært antistoff til lysbildene, dekk med dekselslips og inkuber ved romtemperatur i to timer.
Etter inkubasjon, skyll lysbildene i TBS-T fire ganger i 20 minutter hver og deretter i TBS fire ganger i 20 minutter hver. Tørk lysbildene ved romtemperatur i mørket, over natten. Plasser lysbildene på nær-infrarød skanning grensesnitt med vevet vendt ned.
Bilde flere lysbilder om gangen ved hjelp av markeringsverktøyet. Bilde lysbildene ved hjelp av innstillingen av høyeste kvalitet med en oppløsning på 21 mikrometer. I en forskyvning av null nanometer importerer du bilder til bildeanalyseprogramvare for å vise og merke for halvkvantitativ proteinanalyse.
Når du har åpnet bildeanalyseprogramvaren, velger du arbeidsområdet som bildet ble skannet inn i. Åpne deretter det skannede bildet i bildeanalyseprogramvaren for å vise skanningen og justere bølgelengder, kontrast, lysstyrke og forstørrelse som vises uten å endre det rå bildet eller det totale kvantifiserte utslippet. Når du har identifisert nøkkelområdene for kvantifisering, velger du analysefanen øverst på siden, og deretter velger du tegnerektangel for å tegne et rektangel over området som skal kvantifiseres.
Hvis du vil vise rektangelstørrelsen, merker du figurer nederst til venstre på skjermen. Velg deretter kolonner nederst til høyre. Legg deretter til høyde- og breddekolonner for å identifisere figurstørrelsen.
Til slutt, gi figuren et navn og gjenta. Når alle områder er samplet, fortsetter du med å kombinere og analysere dataene som er tilgjengelige fra kolonnefanen. For å bekrefte at denne protokollen fungerer, ble hjerneseksjoner inkubert med primære og sekundære antistoffer, sekundært antistoff alene, eller verken primært eller sekundært antistoff.
Det umiddelbare tidlige genet c-jun uttrykket ble oppdaget i den dorsale hippocampus og amygdala bare når både primære og sekundære antistoffer ble brukt på hjernevevet. GluR1-underenheten til AMPA-reseptoren og NR2A-underenheten til NMDA-reseptoren ble analysert i avføringsproteindeteksjonen i amygdalakjerner. Dette tillot å undersøke forholdet mellom AMPA NMDA reseptorer i sub-nuclei av amygdala som er en nevrobiologisk signatur av læring og minne.
Gjennomsnittlige og normaliserte mål på proteinuttrykk ble hentet fra høyoppløselige skanninger i ventral hippocampus. Ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren plasseres et rektangel i interesseområdet, og gjennomsnittlig lysintensitet fra formen ble brukt som et mål på fluoroforuttrykk, som er et mål på proteinuttrykk. For å oppnå den normaliserte kurven ble en form plassert over et område som uttrykker høyt signal og lavt signal i området under kurven ble brukt som et mål på proteinuttrykk.
Den største kampen med denne prosedyren er å finne et antistoff og sørge for at det fungerer. Søknaden er enkel. Mitt råd ville være å først prøve en vanlig immunohistokjemisk prosedyre, og deretter prøve denne teknikken.
Utfører alltid en valideringsanalyse først. Det viktigste å huske er å sjekke antistofffortynningen og sørge for at den påføres riktig. Uten disse trinnene mislykkes prosedyren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
